孫 冰 侯艷茹 白艷蘋 侯普馨 蘇 琳 靳 燁* 哈斯高娃

(1.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，呼和浩特010018；2.烏拉特中旗農牧和科技局，烏拉特中旗015300)

肌纖維是肌肉組織的基本組成單位，其組織學特性與畜禽肉品質密切相關[1]。氧化型肌纖維線粒體和肌紅蛋白含量較多，有更多的肌血球素和較少的糖原，氧化型肌纖維占比高的肌肉色澤鮮紅、細嫩多汁且有較好的持水力。酵解型肌纖維包含更多的糖原且ATP 酶活性高，酵解型肌纖維占比高時，肌肉pH下降速率快，易導致白肌肉(PSE肉)[2-4]。在動物出生后，肌纖維基本不會再有數量上的改變，在后期的生長發(fā)育過程中，肌纖維的動態(tài)變化會表現為直徑增粗、橫截面積增大以及類型間的雙向轉化，轉化遵循Ⅰ型?Ⅱa型?Ⅱx型?Ⅱb型的順序[5]。

運動作為一種可以引起骨骼肌的表型重塑的重要外界因素，在生物體完成不同形式的運動過程中，肌纖維類型組成的差異與骨骼肌重塑能力和肌肉蛋白質抗原特異性緊密相關[6]，骨骼肌會在肌纖維形態(tài)、類型、肌肉能量代謝酶活性等方面產生適應性變化[7]。閆祥林等[8]研究發(fā)現，與工廠集約化飼養(yǎng)相比，運動量大的放養(yǎng)多浪羊背最長肌的肌原纖維密度較小、直徑較大。汪江先[9]研究了運動量對淮南麻黃雞生長和肉品質的影響，結果表明，相比于中步行數[(20 438±950)步]和低步行數[(16 935±1 119)步]，高步行數[(24 608±1 270)步]能促進淮南麻黃雞母雞生長，改善胸肌保水性和剪切力。這是因為運動量增多，能夠促進畜禽肌纖維發(fā)育、減少脂肪沉積、改善肉色，從而對肉品質和風味產生影響[10]。增加商品肉雞日活動量，能有效改善雞肉色澤，隨著周齡的延長，雞肉的蒸煮損失呈下降趨勢，說明運動對肉質有所改善[11]。Gangnat等[12]發(fā)現，運動量的增加能夠影響肉牛體內的新陳代謝，誘導其肌纖維組織學特性發(fā)生改變，從而導致肉的嫩度變差。由此可見，適當增加畜禽運動量對肌纖維組織學特性有著重要影響，從而影響肉品質。

目前蘇尼特羊傳統(tǒng)放牧的方式由于環(huán)境保護及集約化生產的要求已經日益向舍飼方式轉化，但很多研究表明舍飼羊肉品質下降，而決定放牧和舍飼羊肉品質的最根本區(qū)別在于運動量及攝食的差別，然而關于運動影響反芻動物機體內肌纖維類型轉變的研究并不多，運動強度、時間等對于調控肌纖維類型轉變的具體機制也不清晰。因此，本文通過對蘇尼特羊進行6 km/d的驅趕運動訓練，以探究運動對蘇尼特羊肌纖維特性和肉品質的影響及運動使其發(fā)生變化的調控機理。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

所需試驗動物于2019年6—9月在內蒙古烏拉特中旗哈拉圖嘎查順遂牧區(qū)飼養(yǎng)。選取體況良好、平均體重為(19.77±3.81) kg的3月齡蘇尼特羊14只，隨機分為2組：運動組和對照組，每組7只。對照組和運動組在相同的圈中集中飼養(yǎng)，運動組蘇尼特羊在脖子上佩戴計步器，每日分別于08:00、19:00趕至18.5 m×10.5 m的運動場內進行驅趕運動：每次運動時間40 min，運動速度75 m/min，共計6 km。2組蘇尼特羊均飼喂以玉米等精飼料為主的飼糧，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期間自由采食和飲水。預試期7 d，正試期90 d。屠宰前14只蘇尼特羊停水2 h，禁食24 h，然后按照穆斯林阿訇屠宰方法進行宰殺。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平 (風干基礎)

1.2 測定指標與方法

1.2.1 肉品質的測定

在羊屠宰后取左半胴體背最長肌(longissimusdorismuscle,LD)測定各項肉品質指標。使用全自動色差儀測定肌肉紅度(a*)、黃度(b*)、亮度(L*)值，并計算肌肉飽和度；使用CLM-3型嫩度儀對肌肉嫩度(用剪切力表示)進行測定；使用pH-STAR型胴體直測式pH計測定肌肉pH；蒸煮損失的測定及計算參照侯普馨等[2]的方法。

1.2.2 肌纖維組織學特性的測定

將肌肉沿肌纖維方向切割并修整為約0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm的肌肉塊(先將其分割成長條狀，再用刀片逐個進行修整)，放進提前經液氮預冷的異戊烷中脫水干燥30 s，待肉塊顏色發(fā)白后立即投入液氮中冷凍，然后裝入5 mL無酶無菌凍存管中，液氮中保存，帶回實驗室后在-80 ℃的條件下長期保存，用于后續(xù)肌纖維組織的冰凍切片。

將按照上述方法采集好的樣品置于-27 ℃冰凍切片機中包埋并冷凍，將其切成10 μm厚的橫斷面[13]，組織切片通過ATP酶(pH 4.55～4.65)組織化學染色法[14]進行染色，染好的組織切片在Leica 4000B熒光倒置顯微鏡10×10倍下觀察，選擇2～4個分型清晰的視野，通過Leica Qwin V4.4彩圖軟件分析肌纖維的各項指標[15]。

1.2.3 基因表達量的測定

1.2.3.1 樣品采集

將肌肉剪成80～100 mg的小塊裝在2 mL無酶無菌管里，投入液氮中速凍，保存于-80 ℃的冰箱中，用于后續(xù)試驗。

1.2.3.2 RNA提取與反轉錄

參考蘇琳[16]的試驗方法提取蘇尼特羊肌肉組織中的總RNA，總RNA濃度和純度用微量分光光度計和核酸蛋白分析儀測定。所提取的總RNA的完整性用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳(條件為120 V，15 min)進行檢測。參照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，將合成的質量濃度為50 ng/μL的cDNA稀釋到10 ng/μL，用于后續(xù)試驗[17]。

1.2.3.3 引物序列及合成

試驗所需肌球蛋白重鏈(myosin heavy chains，MyHC)Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱx引物序列引自尹麗卿[18]和馬曉冰[18]的文獻，細胞色素C氧化酶Ⅳ(cytochrome C oxidase Ⅳ，COXⅣ)、一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)α1和α2、過氧化物酶體增殖激活受體γ輔助激活信號因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1α，PGC-1α)、沉默信息調節(jié)因子1(sirtuin 1，SIRT1)引物序列利用NCBI網站設計，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參基因。引物序列由生工生物公司(上海)合成，詳見表2。

表2 引物序列

1.2.3.4 實時熒光定量PCR擴增

以質量濃度為10 ng/μL的cDNA為模板，按照TB GreenTMPremixEx TaqTMⅡ說明書，配制反應液，進行實時熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.2.4 代謝酶活性測定

肌肉中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)以及蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH)活性的測定依據測試盒說明書操作。

1.3 數據統(tǒng)計分析

試驗數據用SPSS 25.0進行單因素方差分析統(tǒng)計分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 運動對蘇尼特羊肌纖維組織學特性的影響

2.1.1 蘇尼特羊肌纖維ATP酶染色結果

因為不同類型肌纖維內的ATP酶對酸堿的穩(wěn)定性有所差異，所以可將肌纖維分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱa型和Ⅱb型[2,14]。如圖1所示，顏色最深的黑色部分為Ⅰ型(慢速氧化型)肌纖維，淺色部分為Ⅱa型(快速氧化-酵解型)肌纖維，顏色介于兩者之間的棕褐色部分為Ⅱb型(快速酵解型)肌纖維。

圖1 對照組(A)與運動組(B)蘇尼特羊

2.1.2 運動對蘇尼特羊肌纖維組織學特性的影響

由表3可知，運動組蘇尼特羊肌纖維密度和Ⅱb型肌纖維面積比例顯著低于對照組(P<0.05)；Ⅰ型肌纖維直徑和Ⅱa型肌纖維數量比例極顯著高于對照組(P<0.01)；Ⅰ型肌纖維橫截面積，Ⅱa型肌纖維直徑、橫截面積、面積比例顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅱb型肌纖維數量比例極顯著低于對照組(P<0.01)。

表3 蘇尼特羊肌纖維組織學特性各項指標

2.2 運動對蘇尼特羊肌肉中MyHC mRNA相對表達量的影響

由圖2可知，運動組蘇尼特羊肌肉中MyHCⅡa、MyHCⅡxmRNA相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，MyHCⅠ、MyHCⅡbmRNA相對表達量也較對照組有所提高，但差異不顯著(P>0.05)。

MyHC：肌球蛋白重鏈 myosin heavy chains。

2.3 運動對蘇尼特羊肌肉中代謝酶活性的影響

由圖3可知，肌肉中LDH、SDH活性的差異性表現為運動組顯著高于對照組(P<0.05)，運動組肌肉中MDH的活性較對照組也有所增高，但差異不顯著(P>0.05)。

2.4 運動對蘇尼特羊肉品質的影響

由表4可知，與對照組相比，運動組蘇尼特羊肌肉飽和度顯著降低(P<0.05)，a*、b*、L*值均極顯著降低(P<0.01)，剪切力顯著增大(P<0.05)。運動組蘇尼特羊宰后初始肌肉pH為6.13，極顯著低于對照組(P<0.01)，放冷庫靜置排酸24 h后，運動組的肌肉pH24 h降至5.49，顯著高于對照組的pH24 h(P<0.01)。

圖3 運動對蘇尼特羊肌肉中代謝酶活性的影響

2.5 運動對蘇尼特羊肌肉中AMPK、COXⅣ、PGC-1α和SIRT1 mRNA相對表達量的影響

由圖4可知，運動組蘇尼特羊肌肉中AMPKα1 mRNA相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)，COXⅣ、PGC-1αmRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，SIRT1 mRNA相對表達量雖也較對照組提高，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 運動對蘇尼特羊肌纖維類型組成的影響

本試驗測定運動組蘇尼特羊肌肉中氧化型(Ⅰ型+Ⅱa型)肌纖維數量比例、面積比例分別是54.88%、56.30%，對照組則分別為45.46%、53.46%，這說明對舍飼羊每日進行6 km的人為驅趕運動可以在一定程度上提高氧化型肌纖維的比例。經過長期運動的蘇尼特羊各型肌纖維直徑和橫截面積均要大于半舍飼條件下的蘇尼特羊，并且肌纖維直徑和橫截面積的變化規(guī)律相一致。在肉雞上的研究表明，與籠養(yǎng)方式相比，山地放養(yǎng)方式下的肉雞肌肉肌纖維密度減小，直徑增大，因為山地放養(yǎng)肉雞的運動量明顯高于籠養(yǎng)雞[20]，說明運動改善了肌肉分化的強度，與本試驗結果一致。Schmitt等[21]研究運動量對小鼠骨骼肌的影響時發(fā)現，訓練10周的自愿輪跑方式能有效促進小鼠比目魚肌中酵解型肌纖維更多的向氧化型肌纖維轉化。以上研究結果說明，增加舍飼羊的運動量能增大肌纖維直徑和橫截面積，從而促進肌肉發(fā)育，改善肌肉分化，且促進肌纖維類型間的轉化。

表4 運動對蘇尼特羊肉品質的影響

AMPK：一磷酸腺苷激活的蛋白激酶AMP-activated protein kinase；COXⅣ：細胞色素C氧化酶Ⅳ cytochrome C oxidase Ⅳ；PGC-1α：過氧化物酶體增殖激活受體γ輔助激活信號因子-1α peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1α;SIRT1：沉默信息調節(jié)因子1 sirtuin 1。

3.2 運動對蘇尼特羊肌肉中MyHC mRNA相對表達量的影響

依據MyHC差異表達的分子分型法比組織化學染色法能更為準確地對肌纖維類型進行劃分，可將MyHC分為MyHCⅡa(快速氧化型)、MyHCⅡb(快速酵解型)、MyHCⅠ(慢速氧化型)、MyHCⅡx(中間型)4類[5]。根據2.1.2中ATP酶染色結果得出，運動提高了肌肉中氧化型肌纖維的比例。MyHCmRNA相對表達量分析結果與ATP酶染色結果基本一致。Serrano等[22]通過研究耐力訓練誘導馬臀中肌中MyHC的轉化規(guī)律，發(fā)現其按照Ⅱx型→Ⅱa型→Ⅰ型的順序轉化，并且該規(guī)律與肌肉中代謝特性的變化相一致。湯長發(fā)等[23]研究了不同運動方式、時間和強度下大鼠肌纖維類型間變化的差異，從而探究內在轉化規(guī)律，結果表明，各種強度運動都可以引起比目魚肌MyHC亞型之間發(fā)生變化，小強度運動引起MyHCⅡb向MyHCⅡx、MyHCⅡa、MyHCⅠ轉化；中等強度、大強度運動引起MyHCⅠ、MyHCⅡb向MyHCⅡx、MyHCⅡa轉化。上述結果產生的原因可能是不同方式、強度及頻率的運動可誘導肌肉中MyHC異形體間發(fā)生不同方式的轉化。

3.3 運動對蘇尼特羊肌肉中代謝酶活性的影響

MDH和SDH廣泛存在于線粒體中，是葡萄糖有氧氧化過程中的關鍵限速酶，可以體現機體氧化代謝程度，二者都能評價肌肉的氧化活性，且氧化代謝能力與其活性的高低呈正相關[5,24]。酵解型肌纖維主要通過糖酵解過程產生能量，LDH是一種糖酵解酶，其活性的高低能體現機體無氧酵解的活躍程度[25]。運動組蘇尼特羊肌肉中SDH活性升高，說明運動能使細胞內能量即ATP的生成增強，同時Ⅰ型、Ⅱa型肌纖維的比例增加，表明運動在一定程度上能加快機體對糖類的轉化利用，進而促進肌纖維向氧化型轉化；運動組蘇尼特羊肌肉中LDH活性升高，說明機體無氧酵解供能加強，這可能是由于運動加快了肌肉內丙酮酸和乳酸的相互轉化所導致，但是尚不能確定是加快了丙酮酸向乳酸的轉化還是為了減少物質代謝產物的堆積而加快了乳酸向丙酮酸的轉化。本試驗得到的結果與趙杰修等[26]的研究結果相一致。以上研究結果表明，增加舍飼羊的運動量能夠提高肌肉中LDH和SDH活性，從而影響機體的能量代謝。

3.4 運動對蘇尼特羊肉品質的影響

pH是反映畜禽屠宰后肌肉糖原酵解程度和速率的肉質指標[27]。宰后初始肌肉pH主要表示肌肉中的乳酸水平，蘇尼特羊在屠宰前，機體由糖原的無氧酵解釋放能量，隨之肌肉pH會隨乳酸水平變化受到不同程度的影響，而運動組蘇尼特羊經過長時間運動后，體內乳酸水平上升，使得宰后初始肌肉pH較低。靜置排酸24 h后，運動組蘇尼特羊肌肉pH24 h(5.49)顯著高于對照組(5.30)，可能是運動組蘇尼特羊肌肉pH下降速率和回升速率較對照組更快，加快了肉的成熟速度。肉色是直接通過感官影響消費者是否購買的一個重要肉質評定指標[28]。Jin等[29]報道，在運動場中飼養(yǎng)的皖南三黃雞腿肌a*值顯著高于無運動場的皖南三黃雞，并且雞肉風味物質含量也能得到有效改善[30]。本試驗中，運動組蘇尼特羊肌肉在L*和b*值上優(yōu)于對照組，但運動后肌肉a*值沒有增加，這與Vestergaard等[31]的研究結果相似。本試驗采用的是人為驅趕的方式使蘇尼特羊完成一定量的運動，而非在其主觀下進行的，這會使羊受到不同程度的應激，從而會影響肉品質的多項評定指標。此外，飼養(yǎng)管理、肌肉部位、品種的差異也會對畜禽胴體肉色造成一定的影響。剪切力與嫩度呈負相關，可以直接反映肉質嫩度[32]。肌纖維直徑、密度及橫截面積的大小都對肌肉嫩度有直接影響[33]。結合2.1.2中肌纖維組織學特性結果，運動量增加會使羊肌纖維密度降低、直徑增粗、橫截面積增大，而嫩度與肌纖維的直徑和橫截面積均呈負相關[27,34]，這也恰好解釋了運動組蘇尼特羊肌肉嫩度降低的原因。

3.5 運動對蘇尼特羊肌肉中AMPK、COXⅣ、PGC-1α和SIRT1 mRNA相對表達量的影響

AMPK、SIRT1、PGC-1α這3個信號因子在機體內構成能量感應網絡，這對于調節(jié)能量代謝、線粒體生物發(fā)生以及氧化型肌肉表型的代謝變化起到協同作用[35]。COXⅣ的表達程度能作為線粒體生物合成的有效標志[36]。動物在受到一些病理或生理刺激時能激活機體內AMPK的表達，此時細胞內分解代謝增強，合成代謝受阻，ATP水平升高，進一步調節(jié)能量感應通路，維持整個機體的代謝穩(wěn)態(tài)[37]。運動強度越大，AMPK的表達量越高[38]。AMPK和SIRT1都可以調控下游因子PGC-1α的表達。另外，AMPK能直接磷酸化PGC-1α，觸發(fā)以PGC-1α為核心的信號級聯，促進線粒體生物發(fā)生和氧化型肌纖維的形成[39]。

陳艷華等[40]研究發(fā)現，對老年小鼠進行負荷漸增式訓練能誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞AMPK磷酸化表達，增強骨骼肌有氧代謝能力，該學者推測其內在調節(jié)機理是線粒體相關信號途徑：AMPK/SIRT1/PGC-1α。AMPK一經激活，可以直接激活PGC-1α蛋白表達和氧化酶活性增加，減少酵解型肌纖維的生成[41]。Zhang等[42]通過在豬和小鼠中建立PGC-1α特異性表達轉基因模型，得到骨骼肌的氧化代謝和脂肪酸氧化程度都能有效增強的效果，同時氧化型肌纖維也就是慢肌纖維比例大幅上調。趙雅娟[43]研究發(fā)現，大鼠MyHCⅠ、MyHCⅡa型肌纖維分布與PGC-1α mRNA相對表達量呈顯著正相關關系。在本試驗中，運動組蘇尼特羊的MyHCⅡa和MyHCⅡxmRNA相對表達量顯著上調，這說明運動對肌纖維組成的影響可能是由于運動首先激活了AMPK的表達，使得PGC-1α、SIRT1的表達上調，從而促進機體線粒體的生物合成，使肌纖維類型間發(fā)生轉化，提高肌肉氧化代謝能力。

骨骼肌組織學特性的核心是肌纖維類型分布，運動是調節(jié)骨骼肌可塑性的重要因素。在本研究中，增加舍飼蘇尼特羊的運動量能有效激活骨骼肌內AMPK的表達，從而觸發(fā)介導肌肉生長和能量代謝的細胞內信號通路AMPK/SIRT1/PGC-1α的穩(wěn)態(tài)表達，這同樣在維持機體能量代謝和介導氧化型纖維生成方面起著不可或缺的調控作用。

4 結 論

本研究結果發(fā)現，增加舍飼蘇尼特羊的運動量上調了其肌肉中MyHCⅡa、MyHCⅡx以及PGC-1α、SIRT1、COXⅣ的表達，同時提高了肌肉中代謝酶LDH、SDH的活性，說明運動可激活AMPK信號通路相關基因，促使肌纖維類型間相互轉化，增強肌肉線粒體生物發(fā)生和氧化代謝能力。雖然對蘇尼特羊每日進行6 km的運動可以增強肌肉分化強度，促進氧化型肌纖維生成，有效加快畜禽宰后肉的成熟過程，但對于羊肉的色澤和嫩度沒有積極作用。