郭振華，要宏陽，楊海清，王 青 ，刁冬慧，劉悅萍*

(1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 102206；2.北京市平谷區(qū)人民政府果品辦公室，北京101200)

桃(PrunuspersicaL.)屬于薔薇科李屬植物，是世界第三大溫帶果樹，起源于中國[1]，有著 4 000 多年的栽培歷史，在中國各省區(qū)廣泛栽培，資源十分豐富。北京市平谷區(qū)是中國最大的桃生產(chǎn)基地，桃園面積約7 000 hm2，2020年桃產(chǎn)量約18.33萬t。桃產(chǎn)值收入占農(nóng)民收入比重大，桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展已成為平谷區(qū)果品產(chǎn)業(yè)提質(zhì)升級的主動力，而桃的品質(zhì)是影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。桃的形狀、單果質(zhì)量、果實(shí)大小和著色等外觀品質(zhì)以及風(fēng)味、香氣、糖酸比和貯運(yùn)特性等內(nèi)在品質(zhì)決定桃的經(jīng)濟(jì)價值[2]，這些品質(zhì)性狀的形成是由環(huán)境及遺傳等多種因素決定的，眾多代謝相關(guān)基因及調(diào)控因子參與桃品質(zhì)形成過程，通過桃基因組的深測序已挖掘出一些控制果實(shí)品質(zhì)性狀的基因[3]。

生長素是植物生長過程中的重要激素[4]，不僅參與植物向性生長、組織器官形成等活動[5-6]，還對果實(shí)的發(fā)育成熟起到重要的調(diào)控作用[7-9]。研究表明，內(nèi)源生長素隨果實(shí)成熟含量逐漸降低，果實(shí)出現(xiàn)軟化、花青苷積累等成熟性狀[10-11]。施加較高濃度的外源生長素可以延遲果實(shí)成熟，因此生長素通常被認(rèn)為是果實(shí)成熟過程的負(fù)調(diào)控信號[12-15]。在溶質(zhì)性桃果實(shí)中，內(nèi)源生長素含量隨果實(shí)成熟急劇上升。生長素通過介導(dǎo)其受體TIR1/AFB(Transport inhibitor response 1/Auxin signaling F-box)家族的F-box蛋白和Aux/IAA(Auxin/Indole-3-acetic acid)轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合， SCFTIR1/AFBE3泛素連接酶復(fù)合物將活化的泛素轉(zhuǎn)移到Aux/IAA上， Aux/IAA的多泛素化導(dǎo)致其通過26S蛋白酶體降解，將下游的轉(zhuǎn)錄因子ARF(Auxin Response Factor)去抑制化，從而激活生長素信號通路，使得植物最終表現(xiàn)出生理反應(yīng)[8]。桃優(yōu)質(zhì)生態(tài)安全研究課題組在桃基因組中篩選出17個ARFs編碼基因，其中大部分ARF因子在桃的不同組織部位廣泛存在，個別ARF因子的表達(dá)部位具有特異性，如PpARF13和PpARF16在根與莖中沒有表達(dá)，PpARF5僅在果實(shí)中表達(dá)，PpARF4在桃果實(shí)成熟期的表達(dá)量呈現(xiàn)上升，外源生長素處理促進(jìn)該基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)[16]。

酵母雙雜交系統(tǒng)能在生物體內(nèi)測定蛋白的相互作用，具有較高的靈敏性，被廣泛應(yīng)用到蛋白互作的研究中。假陽性較高是這項技術(shù)的明顯缺點(diǎn)[17]，目前通過改造Y2H Gold菌株可適當(dāng)降低假陽性，另外采用 4 個報告基因(AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1)和新型穩(wěn)定的抗生素AbAi，可以有效殺死非抗性克隆，從而有效降低背景克隆的生長[18]。目前酵母雙雜交技術(shù)已成為檢測已知蛋白之間相互作用的重要試驗手段。隨著科學(xué)研究的發(fā)展，更重要的是要發(fā)現(xiàn)與已知蛋白相互作用的未知蛋白，因此需建立高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫(以下簡稱cDNA文庫)用于未知蛋白的篩選。有報告通過cDNA文庫，在草莓果實(shí)發(fā)育成熟研究中獲得目標(biāo)因子，F(xiàn)vMAP4K1是擬南芥AtSIK1的同源基因，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其通過細(xì)胞增殖和細(xì)胞膨大調(diào)控器官大小，長莢果變小，種子數(shù)量減少，推測其可能參與草莓的果實(shí)生長發(fā)育，通過cDNA文庫篩選，獲得4個可能與果實(shí)發(fā)育相關(guān)的蛋白因子[19]。在桃果實(shí)發(fā)育研究領(lǐng)域，PrupeSEP1在調(diào)節(jié)果實(shí)成熟軟化過程中起重要作用，通過文庫篩選，獲得與SEP1互作的蛋白因子AKR2(Aldo-Keto Reductase，醛酮還原酶)[20]。

為研究生長素響應(yīng)因子對桃果實(shí)成熟的調(diào)控機(jī)制，該試驗把硬溶質(zhì)桃果實(shí)成熟前后4個時期的果皮材料等量混合，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫，對生長素響應(yīng)因子PpARF4進(jìn)行文庫篩選，共獲得26個互作蛋白。

1 材料與方法

1.1 材 料

以硬溶質(zhì)桃‘突圍’為試材， 采摘于北京市平谷區(qū)中胡家務(wù)村果園，取盛花期后 75 d(第2次快速生長期，S3)、盛花期后85 d(成熟前期，S4-1)、盛花期后93 d(成熟后期，S4-2)和盛花期后101 d(完全成熟期，S4-3)的桃果實(shí)。采摘時選取長勢一致，大小相似，沒有明顯病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)樣品，用蘸有清水脫脂棉將未離體的果實(shí)輕輕擦拭2～3次，去除桃外果皮的桃毛。待水漬自然風(fēng)干后，摘取果實(shí)，迅速分離外果皮和中果皮，將二者切成小塊用錫紙包裹凍于液氮中。

1.2 方 法

1.2.1 桃果實(shí)總RNA的提取及雙鏈cDNA的合成 收集4個時期桃的中果皮和外果皮樣品，混合后液氮研磨成粉末，利用Total RNA提取總RNA，利用Oligotex mRNA Midi Kit對mRNA進(jìn)行分離純化。使用CloneMiner逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。將 cDNA 產(chǎn)物-20 ℃臨時保存，于-80 ℃長期保存，用于cDNA文庫的構(gòu)建。

1.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建及擴(kuò)增 參照Clone Miner說明書合成cDNA第1鏈和 cDNA第2鏈，用104 μL的DEPC水反復(fù)吹打30～40次，溶解cDNA，獲得雙鏈cDNA，將cDNA與三框attB1重組接頭連接(3種接頭分別各連接1份)。對cDNA進(jìn)行分級分離和收集，將雙鏈cDNA與pDONR 222載體通過BP反應(yīng)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，獲得初級文庫菌液。取轉(zhuǎn)化后大腸桿菌原液10 μL，稀釋100倍，吸取50 μL 稀釋液涂布LB培養(yǎng)基(含Kan+)進(jìn)行總庫容量鑒定。隨機(jī)挑取24個單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，對其插入片段長度和重組率進(jìn)行鑒定。庫容量(CFU/mL)=(培養(yǎng)基上的克隆數(shù)/50 μL)×稀釋倍數(shù)(1×103μL)。總庫容量(CFU)=庫容量(CFU/mL)×文庫菌液總體積(mL)。吸取1 mL次級文庫菌液，加入100 mL含有Amp+的肉湯培養(yǎng)液中，置于30 ℃搖床， 220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；將100 mL擴(kuò)增的次級文庫菌液，利用質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行抽提，予以備用。

1.2.3 cDNA文庫質(zhì)量與滴度檢測 按照Microtube配制反應(yīng)液，隨機(jī)挑取24個克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，在Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，1% Agarose膠電泳鑒定。

1.2.4 pGADT7-PpARF4誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建及自激活檢測 通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增PpARF4基因，根據(jù)該基因的功能區(qū)設(shè)計引物：上游引物PpARF4-F是cgccatatgATGGAAATTGATCTGAACC，下游引物PpARF4-R是gcgtcgacTTAGACCCTGATTACTGTTGG。利用無縫克隆連接載體pGADT7，經(jīng)酶切鑒定，測序，成功構(gòu)建PpARF4-pGADT7。將目的基因與pGADT7載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后獲得PpARF4-pGADT7重組質(zhì)粒。將PpARF4-pGADT7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y2H gold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，在SD/-Leu-Ade-His培養(yǎng)基中檢測PpARF4轉(zhuǎn)錄因子的自激活能力。

1.2.5 以PpARF4為誘餌篩選cDNA文庫 采用Mating法將含有PpARF4-pGADT7重組質(zhì)粒的Y2H gold酵母細(xì)胞與cDNA文庫共培養(yǎng)，形成結(jié)合子。在含有X-α-gal的SD/-Leu -Ura-Ade-His培養(yǎng)基中篩選酵母菌株。然后將酵母菌株進(jìn)行菌落PCR試驗，選取其中的陽性克隆進(jìn)行測序。

1.2.6 序列分析 在NCBI中通過Blast的方法獲得基因的全長序列，最后以GDR數(shù)據(jù)庫為依據(jù)對基因功能進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)總RNA的提取及ds cDNA的合成

為建立桃果實(shí)成熟前后的cDNA文庫，收集‘突圍’桃的中果皮和外果皮樣品，用液氮研磨成粉末，利用Total RNA試劑盒提取總RNA，利用Oligotex mRNA Midi Kit對mRNA進(jìn)行分離純化，使用CloneMiner逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，用于后續(xù)的建庫(圖1)。

注：M是marker；1是桃中果皮；2是桃外果皮。Note:M is marker; 1 is mesocarp of peach fruit; 2 is exocarp of peach fruit.圖1 桃果實(shí)總RNA的提取Fig.1 RNA extraction from peach fruit

2.2 cDNA文庫質(zhì)量和滴度檢測

首先進(jìn)行BP重組，將桃的cDNA與pDONR222共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)后獲得初級文庫菌液。將初級文庫菌液稀釋100倍，然后取50 uL涂于LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)后第2天得到初級文庫總庫容量1.04×106CFU(圖2A)，隨機(jī)選取24個克隆進(jìn)行菌落PCR檢測，電泳結(jié)果如圖2B，片段大小差異較為明顯，主要分布在1 000～2 000 bp，重組率為96%，覆蓋率較高，達(dá)到初級文庫要求。

注：A是初級文庫總庫容量鑒定；B是初級文庫插入片段PCR鑒定；M是marker；1-24是挑選的克隆。Note:A is the capacity of primary library; B is PCR identification of inserted fragments in the primary library; M is Marker; 1-24 is selected colonies.圖2 初級文庫總庫容量及插入片段PCR鑒定Fig.2 Identification of the capacity and PCR of inserted fragments in the primary library

抽提初級文庫質(zhì)粒，與PGADT7-DEST載體進(jìn)行LR重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，培養(yǎng)后得到次級文庫菌液，將菌液稀釋100倍，取50 uL涂于LB固體培養(yǎng)基，獲得總庫容量1.6×107CFU(圖3 A)。隨機(jī)選取24個克隆進(jìn)行PCR檢測，主要集中在1 000～2 000 bp，重組率為100%，電泳結(jié)果如圖3 B，所獲結(jié)果滿足次級文庫要求，可進(jìn)行后續(xù)cDNA文庫篩選試驗。

注：A是次級文庫總庫容量鑒定；B是次級文庫插入片段PCR鑒定；M是Marker；1-24是挑選的克隆。Note:A is the capacity of secondary library; B is PCR identification of inserted fragments in the secondary library; M is marker; 1-24 is selected colonies.圖3 次級文庫總庫容量及插入片段PCR鑒定Fig.3 Identification of the capacity and PCR of inserted fragments in the secondary library

2.3 pGBKT7-PpARF4誘餌載體的構(gòu)建與自激活檢測

通過PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增PpARF4基因。對目的基因和pGBKADT7質(zhì)粒進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，通過菌落PCR篩選，再經(jīng)過雙酶切檢驗，將構(gòu)建成功的pGBKT7-PpARF4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入AH109酵母菌株中，置于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后對單菌落重懸，采用GAL4系統(tǒng)檢測自激活，在添加X-gal試劑的SD/-Trp/-Ura-Ade/X-gal/AbAi缺陷型培養(yǎng)基中未長出藍(lán)色酵母菌株，證明PpARF4誘餌蛋白不存在自激活(圖4)，可進(jìn)行下一步試驗。

圖4 pGBKT7-PpARF4誘餌蛋白自激活檢測Fig.4 Self-activation assay of pGBKT7-PpARF4 bait protein

2.4 酵母雙雜交篩選PpARF4的互作蛋白

將構(gòu)建好的pGBKT7- PpARF4 質(zhì)粒和桃果實(shí)cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H Gold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，稀釋100倍涂布于SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d長出菌落，將篩選得到的陽性克隆再次轉(zhuǎn)移到SD/-Trp/-Ura-Ade/X-gal/AbAi選擇性培養(yǎng)基上，得到48個陽性克隆(圖5)，選取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，最終得到測序成功的陽性克隆共26個。

圖5 PpARF4蛋白cDNA文庫篩選獲得的克隆Fig.5 Colonies obtained by PpARF4 screening in cDNA library

2.5 互作蛋白的功能注釋

利用酵母質(zhì)粒提取試劑盒，提取測序成功的陽性克隆的酵母質(zhì)粒。將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，過夜培養(yǎng)，送公司測序。測序后得到26個蛋白，在NCBI上的信息如表1所示，獲得的鑒定蛋白功能涉及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、脅迫應(yīng)答因子、物質(zhì)代謝和形態(tài)建成等因子。通過該試驗建立的cDNA文庫，篩選獲得的PpARF4互作蛋白，為進(jìn)一步研究桃果實(shí)發(fā)育成熟機(jī)制提供了有價值的信息。

表1 篩選獲得的PpARF4互作蛋白及其功能預(yù)測Tab.1 The proteins interacting with PpARF4 by screening and its functional prediction

3 討 論

桃果實(shí)的發(fā)育成熟過程是由多因子調(diào)控的生理代謝過程，該試驗用桃果實(shí)成熟前后果皮樣品成功構(gòu)建cDNA文庫，通過篩選，有利于獲得與果實(shí)成熟相關(guān)的目標(biāo)蛋白因子。構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫是利用酵母雙雜交技術(shù)篩選互作蛋白的重要保證，該試驗構(gòu)建的cDNA文庫有較高的重組率(100%)，較長的插入片段(1 000～2 000 bp)和較大的總庫容量(1.6×107CFU)，屬于高質(zhì)量的cDNA文庫，為后續(xù)篩選與桃果實(shí)成熟相關(guān)的靶蛋白提供重要的試驗體系。

轉(zhuǎn)錄因子ARF是響應(yīng)生長素信號的關(guān)鍵反應(yīng)因子，在桃果實(shí)上存在17個PpARFs基因[21]，在果實(shí)的成熟過程中PpARF4基因的表達(dá)量下調(diào)，是桃果實(shí)成熟過程中果皮花色苷積累的負(fù)調(diào)控因子[22]，而PpARF4調(diào)控的靶基因及其互作的蛋白因子是探究PpARF4功能的關(guān)鍵。該研究利用構(gòu)建好的cDNA文庫，成功篩選到誘餌蛋白PpARF4的26個潛在互作蛋白。其中響應(yīng)逆境脅迫或植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白有9個，分別是蛋白TIFY10b，E3泛素蛋白連接酶RGLG2，E3泛素連接酶PARAQUAT TOLERANCE 3，甘氨酸裂解系統(tǒng)H蛋白2，莖部特異性蛋白TSJT1，激發(fā)子反應(yīng)蛋白3，NADH脫氫酶(泛醌)1β復(fù)合物亞單位10-B，水通道蛋白TIP1-1和組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；與大分子代謝相關(guān)的蛋白7個，分別是?；o酶A硫酯酶13，烯醇化酶，CTP合酶，葉綠素體內(nèi)的伴侶蛋白dnaJ A6，果糖-二磷酸醛縮酶3，UDP-D-木糖合酶2和延伸因子1-α；參與組織器官形成的蛋白有7個，包括patellin-3蛋白，開花基因K同源域，COP9信號體復(fù)合物亞基5a，阿拉伯半乳聚糖蛋白1，微管蛋白β鏈，富含甘氨酸的蛋白2和花粉特異性蛋白C13；參與蛋白合成和修飾的因子有3個，分別是40S核糖體蛋白S17、40S核糖體蛋白S3a和泛素硫酯酶OTU1。目前獲得的26個互作蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)與桃果實(shí)花青苷代謝相關(guān)的因子，可能的原因是該試驗構(gòu)建的誘餌蛋白載體時選取的是PpARF4的功能區(qū)，不是完整的編碼區(qū)序列，對于一些互作較弱的蛋白沒有檢測到。該試驗發(fā)現(xiàn)與花青苷形成的光信號因子COP9信號體復(fù)合物亞基5a，并獲得一些與糖代謝及細(xì)胞壁形成相關(guān)的蛋白，這為進(jìn)一步探究PpARF4在桃果實(shí)品質(zhì)形成中的可能作用提供了重要的信息。

4 結(jié) 論

建立了高質(zhì)量的桃果實(shí)cDNA文庫，初步篩選出與生長素響應(yīng)因子PpARF4互作的蛋白26個。