溫海京，周雙海，吳 瓊，張 濤，周 波，張?chǎng)斡?，張永紅*，崔德鳳*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定071000；3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京100070)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是現(xiàn)今生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)體系中重點(diǎn)防控的傳染病原體之一。PCV2感染后可誘發(fā)一系列疾病，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、增生性壞死性間質(zhì)性肺炎、非化膿性心肌炎與壞死性心肌炎以及繁殖障礙等生殖系統(tǒng)疾病，這些疾病現(xiàn)被統(tǒng)稱豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)，屬中國(guó)二類動(dòng)物疫病[1]。豬罹患PCVAD后，多表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育不良、消瘦，皮膚黏膜等蒼白或黃疸，呼吸障礙，體表淋巴結(jié)腫大，多系統(tǒng)炎癥等。種豬與60日齡以內(nèi)的低齡仔豬均為PCV2感染的高度易感對(duì)象與重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象，尤其是20日齡以內(nèi)的低齡仔豬，在感染PCV2后致死率幾乎可高達(dá)100%[2]。PCV2感染均會(huì)導(dǎo)致病豬產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，現(xiàn)已對(duì)世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成不容小覷的經(jīng)濟(jì)損失。

中藥是中國(guó)燦爛文化的瑰寶，自千年前中藥就已應(yīng)用于強(qiáng)身健體、治療疾病，近年來(lái)，伴隨著近現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)飛速的發(fā)展，單味中藥、復(fù)方藥及中藥單體等制劑在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，臨床上已有多項(xiàng)研究表明，諸如黃芪、苦參、板藍(lán)根等中藥均具有一定程度的抗PCV2感染作用[3-5]。研究表明，中藥桂枝復(fù)方中的桂枝-生姜聯(lián)用具有抗病毒作用[6]；白芍可作為抗流感病毒、皰疹病毒的獸用中草藥[7]。大黃復(fù)方中的大黃、大青葉、黃芪等均為可抑制病毒生長(zhǎng)的中草藥且已投入到畜禽養(yǎng)殖中[7]。鑒于此，該研究采用PCR技術(shù)對(duì)采集某豬場(chǎng)疑似PCV2感染的組織病料分離培養(yǎng)后鑒定，豬腎細(xì)胞(PK-15細(xì)胞)體外感染其病毒，選取桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液處理細(xì)胞，探討桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液對(duì)分離鑒定的PCV2抗病毒效果，目的為生豬養(yǎng)殖業(yè)臨床中對(duì)PCV2的防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征組織病料采集自某豬場(chǎng)并保存于北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；PK-15細(xì)胞由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；桂枝、白芍、白術(shù)、附子、干姜、甘草、大黃、大青葉、蒲公英、青蒿、連翹、梔子、千里光、生石膏、黃苓、黃芪均購(gòu)自北京同仁堂藥店永旺分店；DMEM、胰酶、青鏈霉素雙抗、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；PBS、TAE、GoldenView核酸染料、CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、Marker購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；病毒核酸提取試劑盒、2×Pro Taq預(yù)混液、熒光定量SYBR Green預(yù)混液購(gòu)自湖南艾科瑞生物有限公司；引物及瓊脂糖凝膠粉購(gòu)自北京擎科生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病料的處理及PCR擴(kuò)增 取疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的組織病料，充分剪碎后，加入1 mL生理鹽水于組織勻漿器內(nèi)制成勻漿組織，轉(zhuǎn)移至離心管后，4 ℃ 下6 000 r/min離心10 min，收集上清液，根據(jù)病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品DNA，置于-20 ℃保存。

使用特異性引物(F為GCGGGCCAAAAAAGGTACAGTTCC；R為ACCAGCGCACTTCGGCAGCG GCAG)對(duì)PCV2的ORF2基因進(jìn)行20 μL體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，目的基因片段790 bp。PCR擴(kuò)增體系為2×Pro Taq預(yù)混液10 μL，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，No-RNase水6 μL；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件110 V、30 min。

1.2.2 PCV2的分離與培養(yǎng) 選取PCR結(jié)果為PCV2核酸陽(yáng)性的病料，與含有雙抗的DMEM經(jīng)研磨器制成組織勻漿后，反復(fù)凍融3次，離心獲得的上清液經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后，按照1∶10的比例接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的PK-15細(xì)胞，吸附1.5 h，加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。連續(xù)盲傳6代，收獲F6代細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，1 500 r/min離心7 min，吸取上清液即為培養(yǎng)病毒液。

1.2.3 PCV2分離株ORF2基因序列遺傳進(jìn)化分析 提取病毒培養(yǎng)物內(nèi)50 μL的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：2×Pro Taq預(yù)混液25 μL，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，No-RNase水16 μL；反應(yīng)條件同“1.2.2”。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余產(chǎn)物交由北京擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用MEGA-X 10.2.5軟件將該分離株(命名為BY株)與GenBank中PCV2分離株和其他可引起相似臨床呼吸道癥狀的病毒，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory disease virus，PRRSV)和豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)的ORF2基因、豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)、豬圓環(huán)病毒4型(porcine circovirus type 4，PCV4)、不同基因型的PCV2基因進(jìn)行序列比對(duì)，繪制基因進(jìn)化樹(shù)，分析其同源性。

1.2.4 病毒細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)測(cè)定 將狀態(tài)良好的PK-15細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層后，棄去孔中的培養(yǎng)基，分別向每孔中加入200 μL經(jīng)10倍梯度倍比稀釋的病毒液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7)，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，反復(fù)凍融3次，1 500 r/min 離心7 min，分別吸取上清，提取各孔病毒DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增與電泳，記錄各稀釋度下陽(yáng)性孔數(shù)量，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算出TCID50。

1.2.5 PCV2體外增殖規(guī)律測(cè)定 6孔板內(nèi)接種100TCID50病毒液覆蓋至細(xì)胞表面，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育1.5 h，孵育過(guò)程中每15 min晃動(dòng)1次，1.5 h后加入2%維持培養(yǎng)基繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48和72 h后提取病毒DNA，將不同時(shí)間的病毒培養(yǎng)產(chǎn)物DNA樣品與10倍梯度稀釋的自建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對(duì)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL 的2×SYBR GREEN MIX，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX(20 μmol/L) 0.4 μL，模板2 μL，6.8 μL的RNase free water；程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，66 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。分析不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)病毒載量，繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液的制備 桂枝復(fù)方水煎液：按配比稱取桂枝、白芍、白術(shù)、附子、干姜、甘草共500 g，置于3倍體積超純水中浸泡2 h后，武火煎至沸騰后轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮30 min，過(guò)濾藥渣得到藥液，藥渣繼續(xù)添加3倍體積超純水，同樣方式煎煮30 min，合并2次提取藥液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)水分，將藥液濃縮至500 mL，即得到1 g/mL桂枝復(fù)方水煎液。將藥液先后置于16層紗布脫脂棉、4層濾紙，1 000 r/min離心10 min，吸取藥液上清，先后使用0.45 μm與0.22 μm微孔濾膜除菌，最終得到生藥含量1 g/mL無(wú)菌桂枝復(fù)方水煎液，置于4 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

大黃復(fù)方水煎液：按配比稱取大黃、大青葉、蒲公英、青蒿、連翹、梔子、千里光、生石膏、黃苓、黃芪共500 g，大黃打粉并置于沸水中浸泡30 min，其余各中藥成分置于3倍體積超純水中浸泡2 h后，合并大黃浸出液與其他中藥，同桂枝復(fù)方水煎液的處理方法獲得生藥含量為1 g/mL無(wú)菌大黃復(fù)方水煎液。

1.2.7 桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液安全質(zhì)量濃度測(cè)定 設(shè)置空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組、桂枝復(fù)方水煎液組、大黃復(fù)方水煎液組。

空白對(duì)照組內(nèi)只添加DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞對(duì)照組添加細(xì)胞及DMEM培養(yǎng)液。桂枝復(fù)方水煎液組：將100 mg/mL的桂枝復(fù)方水煎液用DMEM依次進(jìn)行2倍倍比稀釋至100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.20 mg/mL。大黃復(fù)方水煎液組：將20 mg/mL的大黃復(fù)方水煎液用DMEM依次進(jìn)行2倍倍比稀釋至20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、 0.08和0.04 mg/mL。

向96孔板內(nèi)的PK-15細(xì)胞各加入200 μL的桂枝復(fù)方水煎液(質(zhì)量濃度分別為100.00、 50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.20 mg/mL)或大黃復(fù)方水煎液(質(zhì)量濃度分別為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08和0.04 mg/mL)，細(xì)胞對(duì)照組及空白對(duì)照組加入200 μL的DMEM。37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的DMEM與10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h，讀取各孔OD450 nm值，根據(jù)公式計(jì)算各孔細(xì)胞活力，公式如下：

細(xì)胞存活率=(桂枝復(fù)方水煎液組OD450 nm值-空白對(duì)照組OD450 nm值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD450 nm值-空白對(duì)照組OD450 nm值)×100%

細(xì)胞存活率=(大黃復(fù)方水煎液組OD450 nm值-空白對(duì)照組OD450 nm值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD450 nm值-空白對(duì)照組OD450 nm值)×100%

1.2.8 桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液抗PCV2作用試驗(yàn) 在細(xì)胞安全范圍內(nèi)桂枝復(fù)方水煎液分為4組即對(duì)照組(0.00 mg/mL)、低劑量組(1.56 mg/mL)、中劑量組(3.13 mg/mL)和高劑量組(6.25 mg/mL)；大黃復(fù)方水煎液分為4組即對(duì)照組(0.00 mg/mL)、低劑量組(1.25 mg/mL)、中劑量組(2.50 mg/mL)和高劑量組(5.00 mg/mL)。

分別以3種不同方式處理PK-15細(xì)胞，進(jìn)行抗PCV2作用試驗(yàn)。

預(yù)防作用(先加藥后加毒)：低劑量組、中劑量組和高劑量組每孔加入1 mL桂枝復(fù)方水煎液或大黃復(fù)方水煎液，對(duì)照組加入1 mL的DMEM；置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，棄液后每孔加入1 mL的100TCID50PCV2病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后，棄去孔中培養(yǎng)基；將所有孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，1 500 r/min離心10 min獲得上清液，提取病毒核酸，進(jìn)行熒光定量PCR絕對(duì)定量法測(cè)定，比較各孔內(nèi)的病毒載量，分析桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液體外對(duì)PCV2的預(yù)防作用。

殺滅作用(藥與毒同時(shí)作用)：低劑量組、中劑量組和高劑量組的桂枝復(fù)方水煎液或大黃復(fù)方水煎液與100TCID50PCV2病毒液1∶1混合，對(duì)照組使用DMEM與病毒液混合；置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后接種1 mL于PK-15細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，棄去孔中培養(yǎng)基，所有孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融、離心、核酸提取及熒光定量PCR擴(kuò)增，得到各孔內(nèi)病毒載量，分析桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液體外對(duì)PCV2的殺滅作用。

治療作用(先加毒后加藥)：每孔加入1 mL 100TCID50PCV2病毒液，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，棄液。低劑量組、中劑量組和高劑量組每孔加入1 mL桂枝復(fù)方水煎液或大黃復(fù)方水煎液，對(duì)照組加入1 mL的DMEM；繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后棄去孔中培養(yǎng)基，將各孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融、離心、核酸提取和熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)各孔內(nèi)病毒載量比較桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液體外對(duì)PCV2的治療作用。

1.3 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，使用單因素方差分析組間數(shù)據(jù)的差異顯著性，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2分離鑒定及培養(yǎng)

2.1.1 PCV2分離鑒定 采用PCR法對(duì)某豬場(chǎng)采集的組織樣品分離及檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。5份病料中有1份病料組織樣品中出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，約790 bp，與陽(yáng)性對(duì)照引物擴(kuò)增條帶結(jié)果一致，由此判定該豬場(chǎng)有豬感染PCV2(圖1)。將陽(yáng)性樣品PCV2分離株BY株接種于無(wú)PCV污染的PK-15細(xì)胞中連續(xù)盲傳6次，取F6代細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果F6代的擴(kuò)增及電泳結(jié)果與PCV2陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果一致(圖2)。為深入了解陽(yáng)性樣品PCV2分離株基因及株型情況，將PCV2分離株BY株F6代細(xì)胞培養(yǎng)物ORF2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用NCBI內(nèi)的BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因序列比對(duì)分析，圖3是BY株序列系統(tǒng)進(jìn)化情況。采用MEGA-X 10.2.5軟件對(duì)BY株ORF2基因與PCV2、PCV1、PCV3、PCV4、PRRSV、PPV的基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，圖3A顯示BY株ORF2基因序列與GenBank中已收錄的PCV2序列同源性達(dá)到99.47%～99.60%， BY株與PCV2有較近的親緣關(guān)系，BY分離株為PCV2毒株，與其他病毒遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；再次將BY株基因組與GeneBank內(nèi)PCV2的2a-2f不同分型的序列[8-9]進(jìn)行比對(duì)分析，圖3B顯示BY株屬PCV2d型。

注：M是Marker；1是陰性對(duì)照；2是陽(yáng)性對(duì)照；3-7是病料樣品。Note: M is Marker; 1 is negative control; 2 is positive control; 3-7 is samples of diseased materials.圖1 疑似PMWS病料檢測(cè)Fig.1 Detection of suspected PMWS materials

注：M是Marker；1是陽(yáng)性對(duì)照；2是BY株F6代培養(yǎng)物。Note: M is Marker; 1 is positive control; 2 is F6 culture of BY.圖2 BY株F6代培養(yǎng)物PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of F6 culture of BY

2.1.2 PCV2培養(yǎng)及生長(zhǎng)特性分析 采用普通PCR法測(cè)定PCV2 F6代培養(yǎng)物的病毒滴度，計(jì)數(shù)每個(gè)病毒稀釋度下的PCV2陽(yáng)性孔與陰性孔，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算出病毒的TCID50為10-4.3/0.1 mL(表1)。

注：A為BY株ORF2基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析；B為BY株P(guān)CV2基因分型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。Note:A is the phylogenetic tree analysis of ORF2 gene sequence of BY; B is the phylogenetic tree analysis of PCV2 genotyping of BY.圖3 BY株序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of F6 generation of BY

表1 PCV2的TCID50測(cè)定Tab.1 TCID50 determination of PCV2

采用建立的絕對(duì)定量的方法檢測(cè)100TCID50PCV2感染不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)病毒cap基因的表達(dá)量如圖4所示。cap基因的表達(dá)量隨時(shí)間逐漸增加，在48 h達(dá)到高峰后逐漸下降，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中采用48 h作為PCV2感染后的孵育時(shí)間點(diǎn)。

2.2 桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液體外對(duì)分離鑒定的PCV2抗病毒效果

2.2.1 對(duì)PK-15細(xì)胞活力的影響 將不同質(zhì)量濃度的桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液分別作用于生長(zhǎng)良好的PK-15細(xì)胞，根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定的OD450 nm值，計(jì)算細(xì)胞活力(圖5)。12.50 mg/mL的桂枝復(fù)方水煎液可對(duì)細(xì)胞造成一定的毒性損傷作用，且隨著質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞活力逐漸降低；5.00 mg/mL及以下質(zhì)量濃度的大黃復(fù)方水煎液對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)損傷作用。

注：A為PCV2 cap基因絕對(duì)定量檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線；B為PCV2的生長(zhǎng)曲線。Note: A is the standard curve of PCV2 cap gene absolute quantitative detection method; B is the growth curve of PCV2.圖4 PCV2在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制Fig.4 Replication of PCV2 in PK-15 cells

圖5 CCK8法篩選桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液對(duì)PK-15細(xì)胞的安全質(zhì)量濃度Fig.5 CCK8 method for screening the safe concentration of CassiaTwig compound decoction and Rhubarb compound decoction on PK-15 cells

2.2.2 對(duì)PCV2的防治作用 絕對(duì)定量法可獲得每個(gè)樣品中的PCV2載量，6.25 mg/mL的桂枝復(fù)方水煎液體外對(duì)豬圓環(huán)病毒2型具有顯著的預(yù)防作用(P<0.05)(圖6A)及極顯著的治療作用(P<0.01)，3.13 mg/mL的桂枝復(fù)方水煎液可顯著降低細(xì)胞內(nèi)豬圓環(huán)病毒2型的復(fù)制(P<0.05)(圖6C)，桂枝復(fù)方水煎液不具有體外直接殺滅豬圓環(huán)病毒2型的能力(圖6B)。5.00 mg/mL的大黃復(fù)方水煎液體外對(duì)豬圓環(huán)病毒2型具有顯著的預(yù)防作用(P<0.05)(圖6A)及極顯著的殺滅作用(P<0.01)，2.50 mg/mL的大黃復(fù)方水煎液可直接參與殺滅豬圓環(huán)病毒2型，顯著降低細(xì)胞內(nèi)該病毒的載量(P<0.05)(圖6B)，大黃復(fù)方水煎液體外對(duì)豬圓環(huán)病毒2型感染后的治療作用不佳(圖6C)。

注：A為預(yù)防作用；B為殺滅作用；C為治療作用；桂枝復(fù)方水煎液與對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；大黃復(fù)方水煎液與對(duì)照組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。Note: A is thepreventive effect; B is the killing effect; C is the therapeutic effect; compared with the control group and the CassiaTwig compound decoction, * means P<0.05, ** means P<0.01; compared with the control group and the Rhubarb compound decoction, # means P<0.05, ## means P<0.01.圖6 桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液體外對(duì)PCV2的防治作用Fig.6 The preventive effect of PCV2 of Cassia Twig compound decoction and Rhubarb compound decoction in vitro

3 討 論

近20年P(guān)CV2的感染一直處于多地區(qū)、高感染的態(tài)勢(shì)，且顯性、隱性感染均出現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢(shì)，雖然疫苗的使用可在一定時(shí)間內(nèi)顯著減輕感染豬的臨床癥狀，降低PCV2在豬群中的流行性和敗血癥的發(fā)生率，但隨著PCV2的不斷變異，新變異毒株的出現(xiàn)使得PCV2的流行情況有所提升[10]。目前PCV2可分為5個(gè)基因亞型，即2a、2b、2c、2d和2e[11]，2018年又增加了PCV2f型[12]，PCV2流行的毒株在2003年由PCV2a逐漸轉(zhuǎn)型為2b型，直到2012年P(guān)CV2d逐漸取代PCV2b成為近年來(lái)的流行毒株[13-14]。

該研究收集某豬場(chǎng)疑似PMWS病料，經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增，鑒定為PCV2陽(yáng)性，無(wú)菌處理后接種于無(wú)污染的PK-15細(xì)胞中，該病毒可在其中進(jìn)行體外生長(zhǎng)，盲傳6代后，經(jīng)PCR與基因測(cè)序分析確定為PCV2且TCID50可達(dá)到10-4.3/0.1 mL。ORF2基因序列比對(duì)可知，分離的病毒BY株能夠與可引起相似呼吸道疾病的PPV、PRRSV及其他基因分型的豬圓環(huán)病毒區(qū)分開(kāi)來(lái)，由此證明分離到的BY株確定為PCV2，同時(shí)PCV2毒株BY株與GeneBank內(nèi)的不同基因亞型的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果分離株為PCV2d型，與當(dāng)前流行趨勢(shì)相符，其中新增PCV2f分型的加入，增加了分析數(shù)據(jù)的全面性。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪、黃芩、青蒿等位列獸醫(yī)常用十大抗病毒中藥[15]；具有清熱解毒功效的連翹、大青葉、蒲公英等可直接參與殺滅病毒，且在抑制病毒的復(fù)制、阻斷其吸附作用方面具有顯著功效[16]；甘草、白芍、白術(shù)等可調(diào)動(dòng)全身的免疫防御系統(tǒng)，通過(guò)間接作用發(fā)揮其對(duì)宿主細(xì)胞的保護(hù)能力[17]。

該試驗(yàn)選用的桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液包括多種抗病毒中草藥成分，大黃復(fù)方水煎液包含大黃、大青葉、蒲公英、青蒿、連翹、梔子、千里光、生石膏、黃苓、黃芪，桂枝復(fù)方水煎液包含桂枝、白芍、白術(shù)、附子、干姜、甘草。桂枝復(fù)方水煎液和大黃復(fù)方水煎液均具有一定的體外抗PCV2能力，抗病毒效果與使用劑量存在一定關(guān)聯(lián)，不同給藥順序呈現(xiàn)出不同的抗病毒作用，桂枝復(fù)方水煎液以PCV2感染后的治療作用為主，大黃復(fù)方水煎液以對(duì)PCV2殺滅作用為主，二者均可投入到進(jìn)一步的臨床作用研究。