范礦士，張 華，吳 瓊，周 波，姜昕雨，史晶晶，張永紅*，崔德鳳*

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術學院/獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室/動物類國家級實驗教學示范中心，北京 102206；2. 河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071000；3. 中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100070)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是當前養(yǎng)豬業(yè)最流行的傳染病之一，以呼吸窘迫、妊娠母豬流產(chǎn)和仔豬高死亡率為特征[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染豬后在肺巨噬細胞內(nèi)復制擴散至全身出現(xiàn)病毒血癥，對機體免疫器官造成損傷，引發(fā)炎性反應[2-3]，導致免疫抑制，引起持續(xù)感染和繼發(fā)感染，嚴重威脅豬群的健康[4-5]。目前，該病主要是通過疫苗預防，然而，面對PRRSV感染引起的免疫抑制、病毒進化、野生型和修飾活病毒(modified-live vaccine，MLV)之間的多重重組問題，已獲得許可的疫苗不能有效抵御挑戰(zhàn)[6]。迫切需要一種新的抗病毒策略控制PRRSV的傳播。

中藥擁有豐富的活性成分和藥理作用，對動物毒害小，近年廣泛用于抗PRRSV的研究，許多天然化合物和中草藥成分已被證實具有抗PRRSV活性[7]。尤其是黃芩、連翹和金銀花，已被證明能在體外有效抑制PRRSV的增殖。黃芩的主要成分黃酮類化合物黃芩苷和黃芩素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌和抗病毒等多種藥理作用，其提取物黃芩苷對PRRSV具有很好的阻斷吸附效果，且保護率在50%以上[8-9]。連翹可以中和內(nèi)毒素，具有良好的抗炎和解熱作用[10]。從貫葉連翹中提取的具有生物活性的金絲桃素在體外抗PRRSV中能夠提高細胞存活率和抑制PRRSV復制[11]。金銀花對多種常見呼吸道病毒都具有一定的抑制作用，金銀花提取物大孔樹脂600 ml/L的乙醇/水洗脫部位具有良好的體外抗PRRSV活性[12-13]。CHENG等[14]發(fā)現(xiàn)，綠原酸和黃芩素能抑制PRRSV的復制或直接殺滅PRRSV，在最大安全濃度下對PRRSV的抑制率分別達到90.8%和61.1%，而對病毒的吸附?jīng)]有阻斷作用。

單味中藥在改善被PRRSV破壞的免疫系統(tǒng)并發(fā)揮良好的抗病毒效果不如中藥復方[15]。故該研究擬將金銀花、黃芩、連翹按1∶1∶2配比組成雙黃連水煎液，使用建立的熒光定量PCR方法，探索雙黃連水煎液對PRRSV復制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PET-28a-N載體質粒和非洲綠猴胚胎腎細胞(Marc-145細胞)由北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室保存；豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)、豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)、豬博卡病毒(porcine boca virus，PBoV)由北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室保存；黃芩、金銀花、連翹購自北京同仁堂大藥房；CCK8細胞檢測試劑盒購自Solarbio公司；SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒、SteadyPure病毒DNA/RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒均購自湖南艾克瑞生物工程有限公司。倒置顯微鏡為OLYMPUS公司制造；StepOnePlus熒光定量PCR儀為Applied Biosystems公司制造；酶標儀為北京普朗新技術有限公司制造；MLS-3750型高壓滅菌鍋為SANYO公司制造。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)DNA序列數(shù)據(jù)庫公布的PRRSV-N基因序列(EU926974.1)通過primer5.0設計熒光定量PCR特異性引物，并由北京擎科生物科技有限公司合成，擴增產(chǎn)物372 bp。

1.3 熒光定量PCR方法的建立及標準曲線的繪制

將北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室保存的陽性重組質粒測定濃度后計算其拷貝數(shù)值。將陽性重組質粒進行8個連續(xù)的10倍梯度稀釋。根據(jù)SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒說明書以及引物特性和模板濃度進行試驗，探索最佳擴增反應條件和反應體系。反復試驗后，選擇20 μL反應體系：10 μL的2×SYBR Green Pro Tap HS Premix×6；上游引物和下游引物各0.4 μL；模板2.0 μL；ROX Reference Dye (20 μmol/L)0.4 μL；RNase Free dH2O為6.8 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，40個循環(huán)。反應結束后，選取至少5個連續(xù)的不同濃度梯度的結果進行分析，根據(jù)得到的Ct值和擴增曲線得出最佳的檢測區(qū)域和方程，繪制標準曲線。

1.4 熒光定量PCR重復性檢驗

將稀釋好的質粒選擇1×104、1×106、1×108的樣本進行熒光定量PCR反應。同時分批進行3次熒光定量PCR擴增，比較同一批次同一濃度(批內(nèi)試驗)和不同批次同一濃度(批間試驗)Ct值和Tm值的變化情況，驗證重復性和穩(wěn)定性。

1.5 熒光定量PCR特異性檢驗

以提取的豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒1型、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬博卡病毒核酸為模板，RNA病毒需反轉錄，使用優(yōu)化過的最佳反應條件，按照PRRSV的熒光定量PCR反應體系進行擴增，以檢測所建方法的特異性。

1.6 病毒培養(yǎng)及TCID50測定

取出已長成單層、生長良好的Marc-145細胞清洗2～3遍。加入病毒液，細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入2 mL的2%血清維持培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，反復凍融3次，1 000 r/min離心5 min，上清即為病毒液，保存于-80 ℃。

將Marc-145細胞消化成單個懸液，取少量滴加到細胞計數(shù)板上進行計數(shù)，調節(jié)細胞密度為1×105個/mL，均勻添加到96孔板中，每孔100 μL，置于5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中。待細胞長成單層后，棄去培養(yǎng)液，病毒用細胞維持液稀釋到8個稀釋度即10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1，每孔加100 μL，每個稀釋度進行8個重復，72 h后觀察細胞病變(cytopathic effect，CPE)。根據(jù)Reed-Muench公式計算50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。

1.7 雙黃連水煎液的制作

金銀花、黃芩、連翹按1∶1∶2稱取100 g，加水浸泡過夜。慢火水煎煮2次，每次沸騰30 min，合并2次水煎液。旋轉蒸發(fā)濃縮，定容至1 g/mL，離心取上清，用0.45 μm和0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 雙黃連水煎液對Marc-145細胞的安全性測定

為了確定雙黃連水煎液對Marc-145細胞的最大安全質量濃度和最佳作用時間，試驗采用CCK8法。首先對細胞計數(shù)，調節(jié)細胞密度為1×105個/mL，然后均勻添加到96孔板中，每孔100 μL。200.00 mg/mL的雙黃連水煎液用細胞維持液依次進行2倍倍比稀釋后，將稀釋好的雙黃連水煎液100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56和0.78 mg/mL分別加入96孔板中，每孔100 μL，同時設置對照(對照是指具有細胞、CCK8溶液而沒有經(jīng)過雙黃連水煎液處理)。分別培養(yǎng)24、48和72 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加90 μL細胞維持液和10 μL的CCK8(避光)，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，在酶標儀上對OD450 nm進行檢測并記錄。

1.9 雙黃連水煎液對PRRSV感染Marc-145細胞的影響

1.9.1 雙黃連水煎液對PRRSV抑制復制作用 使用100TCID50的PRRSV對長成單層的Marc-145細胞進行攻毒，作用1 h后棄去病毒液，加入雙黃連水煎液1.56、3.12和6.25 mg/mL，PRRSV侵染細胞后沒有添加雙黃連水煎液為病毒對照。孵育1 h后棄去藥液，加入含2%胎牛血清的細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后用熒光定量PCR分別檢測病毒載量。

1.9.2 雙黃連水煎液對PRRSV的阻斷吸附作用 Marc-145細胞長滿單層，加入1.56、3.12 和6.25 mg/mL雙黃連水煎液，PRRSV侵染細胞前沒有添加雙黃連水煎液作用為病毒對照。培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄去藥液，加入100TCID50的PRRSV孵育1 h，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后應用熒光定量PCR分別檢測病毒載量。

1.9.3 雙黃連水煎液對PRRS病毒粒子直接殺滅作用 Marc-145細胞長滿單層后，將1.56、3.12和6.25 mg/mL的雙黃連水煎液與100TCID50的PRRSV作用1 h后感染Marc-145細胞，PRRSV侵染細胞前沒有與雙黃連水煎液相互作用為病毒對照。1 h后更換含2%胎牛血清的細胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后熒光定量PCR檢測病毒載量。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)分析，使用t檢驗法以確定目的基因在不同組別的顯著性差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異非常顯著。

2 試驗結果

2.1 PRRSV-N基因熒光定量PCR標準曲線的建立

PRRSV-N基因的擴增動力學曲線和標準曲線見圖1和圖2。標準曲線斜率-3.26，軸距32.4，方程y=-3.26x+32.4，相關系數(shù)R2>0.999，擴增效率102.668%。溶解曲線在特定范圍內(nèi)顯示單一峰(圖3)，無非特異性峰，無引物二聚體形成，擴增產(chǎn)物均一，符合試驗的要求。

圖1 PRRSV熒光定量擴增動力學曲線Fig.1 Dynamic curve of fluorescence quantitative PCR for PRRSV

圖2 PRRSV熒光定量PCR標準曲線Fig.2 The standard curve of fluorescence quantitative PCR for PRRSV

圖3 熒光定量PCR溶解曲線Fig.3 The melting curve of fluorescence quantitative PCR for PRRSV

2.2 PRRSV-N基因熒光定量PCR重復性檢驗

將選取的3組濃度梯度的質粒標準品，進行重復性檢驗，通過Ct值計算得出標準差小于0.5，變異系數(shù)小于3%(表1)。

2.3 PRRSV-N基因熒光定量PCR特異性檢驗

所擴增的6種病毒模板中只有PRRSV出現(xiàn)了擴增曲線和溶解曲線，證實建立的檢測方法具有很強的特異性。

表1 熒光定量PCR重復性試驗Tab.1 Repeatability test of fluorescence quantitative PCR

2.4 PRRSV在Marc-145細胞上的TCID50測定

Marc-145細胞感染PRRSV 72 h后，在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化，可見病毒感染后期，細胞形態(tài)腫脹變圓，細胞間質模糊，直至細胞死亡脫落。采用Reed-muench法計算病毒對Marc-145細胞的毒力，用TCID50表示，試驗結果見表2，PRRSV在Marc-145細胞的TCID50為10-3.9/0.1 mL。

表2 PRRSV TCID50結果(n=8)Tab.2 PRRSV TCID50 results(n=8)

2.5 雙黃連水煎液對Marc-145細胞安全性測定結果

當雙黃連水煎液在6.25 mg/mL時，與對照無顯著性差異(P>0.05)，對細胞活力無影響。72 h時細胞活力最高，此試驗選取雙黃連水煎液最大安全質量濃度6.25 mg/mL，最佳作用時間72 h(圖4)。

注：*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著。Note: *P<0.05 means significant difference, ** P<0.01 means extremely significant difference.圖4 雙黃連水煎液對Marc-145細胞安全性測定結果Fig.4 Safety of Shuanghuanglian decoction on Marc-145 cells

2.6 雙黃連水煎液體外抗PRRSV的效果測定

2.6.1 雙黃連水煎液對PRRSV抑制復制效果 隨著雙黃連水煎液質量濃度的增加，PRRSV-N基因mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，當雙黃連水煎液作用時間達到72 h，PRRSV-N基因mRNA表達量與病毒對照相比差異非常顯著(P<0.001)，雙黃連水煎液能夠有效抑制PRRSV的復制，且具有時間依賴性和劑量依賴性(圖5和圖6)。

注：*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著，***表示差異非常顯著P<0.001。Note: *P<0.05 means significant difference, ** P<0.01 means extremely significant difference, *** P<0.001 means very significant difference.圖5 雙黃連水煎液對PRRSV的抑制復制作用Fig.5 Inhibitory effect of Shuanghuanglian decoction on PRRSV replication

注：*P<0.05表示差異顯著。Note: *P<0.05 means significant difference.圖6 不同質量濃度雙黃連水煎液對PRRSV的抑制復制作用Fig.6 Inhibition of PRRSV replication by Shuanghuanglian decoction of different mass concentrations

2.6.2 雙黃連水煎液對PRRSV的阻斷吸附效果 與病毒對照相比，PRRSV-N基因mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)，見圖7；隨著雙黃連水煎液質量濃度的增加，PRRSV-N基因mRNA表達量逐漸降低(圖8)，當雙黃連水煎液質量濃度達到6.25 mg/mL時，與病毒對照相比差異極顯著(P<0.01)，表明雙黃連水煎液能夠阻斷PRRSV對Marc-145細胞的吸附。

注：** P<0.01表示差異極顯著。Note: ** P<0.01 means extremely significant difference .圖7 雙黃連水煎液對PRRSV的阻斷吸附作用Fig.7 Inhibition of PRRSV adsorption by Shuanghuanglian decoction

注：*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著。 Note: *P<0.05 means significant difference, ** P<0.01 means extremely significant difference.圖8 不同質量濃度雙黃連水煎液對PRRSV的阻斷吸附作用Fig.8 Inhibition of PRRSV adsorption by Shuanghuanglian decoction with different mass concentrations

2.6.3 雙黃連水煎液對PRRSV病毒粒子的直接殺滅效果 雙黃連水煎液對PRRSV病毒粒子的直接殺滅效果見圖9和圖10。與病毒對照相比，PRRSV-N基因mRNA表達量差異不顯著(P>0.05)，表明雙黃連水煎液對PRRSV病毒粒子沒有影響。

圖9 雙黃連水煎液對PRRSV的直接殺滅作用Fig.9 Direct killing effect of Shuanghuanglian decoction on PRRSV

圖10 不同質量濃度雙黃連水煎液對PRRSV的直接殺滅作用Fig.10 Direct killing effect of Shuanghuanglian decoction with different mass concentration on PRRSV

3 討 論

近幾十年來，中國PPRS的廣泛爆發(fā)與病毒的高頻率重組和免疫抑制的不斷進化有關，現(xiàn)有疫苗對PRRS的保護性免疫僅對同源感染有效，對異源PRRSV的感染不能起到良好的保護作用，因此尋找新的抗病毒治療策略迫在眉睫。

試驗前期建立熒光定量PCR方法，其擴增效率102.668%，決定系數(shù)大于0.999，變異系數(shù)小于3%，均符合熒光定量PCR標準曲線建立需要滿足的3個參數(shù)條件[16]。并對當前比較常見的豬博卡病毒和豬圓環(huán)病毒等進行特異性檢測，證實所建立方法的準確性和特異性。對比普通PCR方法，該試驗建立的熒光定量PCR方法不僅可以定量、還可以提高檢測的特異性，適用于臨床檢測，是國際公認檢測病毒的黃金標準[17]。

PRRSV通過膜蛋白受體介導的內(nèi)吞過程感染宿主，包括病毒附著和結合，膜融合和內(nèi)化[18-19]。 一旦病毒基因組(單鏈正向RNA)被釋放到細胞質中，它就會進行翻譯，從而進行復制并產(chǎn)生轉錄復合體。該試驗首先通過CCK8法篩選出雙黃連水煎液對Marc-145細胞最大安全質量濃度6.25 mg/mL，然后通過對PRRSV進行直接殺滅、抑制病毒復制、阻斷病毒吸附試驗，分析雙黃連水煎液是否影響PRRSV的生命周期。阻斷病毒吸附試驗表明雙黃連水煎液預處理會降低Marc-145細胞對病毒的敏感性，影響病毒的附著。雙黃連水煎液在6.25 mg/mL作用72 h時顯著抑制PRRSV復制(P<0.05)。雙黃連水煎液對PRRSV復制階段的抑制作用更為明顯。

黃芩、金銀花、連翹這三味中藥單獨使用都具有抗病毒的功效，尤其是對于呼吸道病有良好的治療效果。該試驗提取雙黃連水煎液，對其體外抗PRRSV效果進行初步研究，并顯示出體外抗PRRSV能力。然而藥物的抗病毒活性尚未在體內(nèi)得到進一步評估，而且中藥復方水煎液成分復雜，有效成分不明確，在闡明其作用機制和新藥研發(fā)方面還有很多的缺陷尚待解決[20]。