蘇亦鳴， 陳飛龍， 張申奧， 陳紹興

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽 蕪湖 241000)

嗜鹽古菌是一類需要高鹽維持生長的古菌，是古菌的一個重要類群，屬于古菌域(Archaea)的廣古菌門(Euryarchaeota)嗜鹽菌綱(Halobacteria)[1]。嗜鹽古菌的分布廣泛，主要生活在鹽湖、鹽堿地、鹽礦、海水、曬鹽池、鹽井和高鹽食品等高鹽環(huán)境中[2-3]。作為極端微生物，嗜鹽古菌在生命適應(yīng)極限條件的理論研究和特殊生物活性物質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的研究價值。1880 年，F(xiàn)arlow 在研究腌制鱈魚夏季變紅現(xiàn)象時，發(fā)現(xiàn)變紅部位有球狀微生物生長，將其命名為紅色Halococcus(嗜鹽球菌)[4]。自18世紀(jì)以來，學(xué)者們不斷從高鹽食品中分離出嗜鹽菌類群[5]。2007年，Namwong 等從泰國的泰式魚露中分離到Halococcus(鹽球菌屬) 的嗜鹽古菌，隨后又在2011年從泰國魚露中分離到Haloacular和Haloarcula(鹽盒菌屬) 的嗜鹽古菌；2010年，Roh 等從韓國的發(fā)酵貝類中分離到Haladaptatus(適鹽菌屬)的嗜鹽古菌；2011年，Nagaoka 等從日本的商品巖鹽中分離到Halostagnicola(鹽湖菌屬)的嗜鹽古菌[6]。研究發(fā)現(xiàn)，嗜鹽古菌在高鹽食品形成獨特風(fēng)味方面起了重要作用。2014年，高瑞昌等[7]發(fā)現(xiàn)不同嗜鹽古菌對魚露的發(fā)酵效果不同，設(shè)計使用不同嗜鹽古菌發(fā)酵，生產(chǎn)不同風(fēng)味的魚露產(chǎn)品。由此可見，高鹽食品中嗜鹽古菌資源豐富。鹽漬海帶是一種常見的高鹽食品。韓冬[8]從大連鹽漬海帶中分離到來自Halobacterium(鹽桿菌屬)、Haloarcula(鹽盒菌屬)、Halolamina(鹽薄片形菌屬)、Haloterrigena(鹽土生古菌屬)和Halorubrum(鹽紅菌屬)等5個屬的嗜鹽古菌菌株。嗜鹽古菌的胞外酶能在高鹽條件下保持高穩(wěn)定性和高活性[9]。 2007年，顧曉穎等[10]在巴里坤湖和瑪納斯湖分離到多株來自Halobacteriaceae (鹽桿菌科)且具有胞外酯酶和淀粉酶活性的嗜鹽古菌菌株；2011年，劉冰冰等[1]在新疆羅布泊地區(qū)分離到產(chǎn)胞外淀粉酶、明膠酶、蛋白酶和酯酶活性的嗜鹽古菌菌株；2018年，Karray 等[11]從突尼斯南部的杰里德大鹽湖(Chott el-Jerid)中分離到具有分泌纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、果膠酶和脂肪酶活性的嗜鹽古菌菌株。從以上研究結(jié)果可以看出，胞外酶的特性在嗜鹽古菌中較為普遍。嗜鹽古菌的拮抗作用也有不少報道[12-14]，但是少有對嗜鹽古菌抑菌活性物質(zhì)的理化性質(zhì)的研究。本研究將以鹽漬海帶鹽為研究對象，采用高鹽培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)分離，經(jīng)16S rRNA基因測序，對所分離的菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定，并對所分離菌株的物種多樣性組成進(jìn)行分析。按種屬不同，選出代表菌株，對菌株的胞外酶活性以及菌株間拮抗活性進(jìn)行篩查，并對其中拮抗活性較強的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行初步的理化性質(zhì)研究。本研究為進(jìn)一步認(rèn)識鹽漬海帶這一高鹽食品中所生存的嗜鹽古菌的物種多樣性提供依據(jù)；為嗜鹽古菌的資源開發(fā)與利用提供參考，并為嗜鹽古菌在高鹽食品的防腐抑菌等方面的應(yīng)用積累前期數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 鹽漬海帶購自安徽省蕪湖市鏡湖區(qū)世紀(jì)聯(lián)華超市，產(chǎn)自山東煙臺。

1.1.2 培養(yǎng)基 NOM培養(yǎng)基(g/L)[15]：酵母粉 0.05，魚蛋白胨 0.25，丙酮酸鈉 1.0，KCl 5.4，NH4Cl 0.27，CaCl20.29，MgSO4·7H2O 26.8，MgCl2·6H2O 23.0，NaCl 184.0，K2HPO42.0。用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，100 000 Pa滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在滅菌前加入瓊脂粉12.0 g，用于培養(yǎng)海帶鹽中的嗜鹽古菌。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱(GHP9080，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀電源(DYY-2C，北京六一儀器廠)；PCR(MixMT201，北京博邁德基因技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 稱取5.0 g的海帶鹽樣品于100 mL 20%的滅菌鹽水中，利用漩渦混合器將其完全混合溶解，以此作為原液(100)。吸取100 μL的原液與900 μL 20%的滅菌鹽水于1.5 mL無菌EP管內(nèi)，利用漩渦混合器將其充分振蕩混勻，稀釋成10-1的樣品稀釋液。用同樣的方法進(jìn)行梯度稀釋，依次稀釋獲得濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的樣品稀釋液。

1.2.2 菌株分離純化 取不同濃度的樣品稀釋液各200 μL涂布到NOM固體平板，密封后于37 ℃恒溫培養(yǎng)3周。選取菌落形態(tài)不同且生長分布較合適的平板(10-2)，挑取所有單菌落于NOM平板進(jìn)行劃線分離，于37 ℃培養(yǎng)。待菌落形成后，再在平板上進(jìn)行單菌落劃線純化。最后，將菌株單菌落再次挑取至NOM平板，37 ℃培養(yǎng)3周，獲得菌株的純培養(yǎng)。

1.2.3 基于16S rRNA基因的初步分子鑒定 ①模板DNA的提?。涸诔瑑襞_內(nèi)用滅菌牙簽蘸取少量菌苔，懸于20 μL無菌水中，充分混勻使細(xì)胞均勻分布，隨后細(xì)胞吸水漲破裂解，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到無菌水中，得到的細(xì)胞裂解物即作為嗜鹽古菌模板DNA。②PCR技術(shù)擴增16S rRNA基因：以上述制備的嗜鹽古菌模板DNA作為PCR擴增模板，以嗜鹽古菌引物F8/R1462為16S rRNA基因PCR擴增引物，序列如下：F8：5′-TTGATCCTGCCGGAGGCCATTG-3′；R1462：5′-ATCCAGCCGCAGATTCCCCTAC-3′[16]。PCR反應(yīng)體系(50.0 μL)：2×PCR Mix 25.0 μL，引物F8 2.5 μL，引物R1462 2.5 μL，DNA模板2.0 μL，無菌水18.0 μL。PCR產(chǎn)物交由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行正向測序。③測序結(jié)果比對：利用BioEdit[17]軟件查看測序峰圖，選取可信度較高的區(qū)域，將其對應(yīng)的序列在EzBioCloud[18]網(wǎng)站上進(jìn)行基于16S rRNA基因的在線鑒定工具分析測序結(jié)果，對菌株進(jìn)行種屬鑒定。分別以97%和95%的序列一致性作為種和屬的界定標(biāo)準(zhǔn)，從而確定各個分離菌株的分類地位。④構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：使用鄰接法推斷進(jìn)化歷史[19]，顯示分支長度之和為1.670 538 62的最優(yōu)樹。在引導(dǎo)測試中相關(guān)分類群聚集在一起的復(fù)制樹的百分比(500個復(fù)制)顯示在分支旁邊[20]。該樹按比例繪制，分支長度與用于推斷系統(tǒng)發(fā)育樹的進(jìn)化距離的單位相同。使用Kimura 2參數(shù)方法[21]計算進(jìn)化距離，并以每個位點的堿基替換數(shù)為單位，利用伽馬分布(形狀參數(shù)=1)對不同地點之間的速率變化進(jìn)行建模，分析涉及103個核苷酸序列。刪除每個序列所有不明確位置，最終數(shù)據(jù)集中共有1 526個位置。在MEGA7[22]中進(jìn)行進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在所分離的菌株中，有不同種屬的菌株，按菌株種的不同，在相同種的菌株中隨機挑選一株菌株作為代表菌株，進(jìn)行后續(xù)胞外酶活性和菌間拮抗作用實驗的研究。

1.2.4 菌株的胞外酶活性檢測 ①蛋白酶：在NOM培養(yǎng)基中添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的脫脂奶粉，制作牛奶平板。菌種劃線，長出明顯菌落后，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生蛋白水解圈[23]。②酯酶：在NOM培養(yǎng)基中添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60和吐溫-80，制作吐溫平板。劃線，待平板上長出明顯菌落，觀察菌落周圍是否有暈圈產(chǎn)生[23]。③明膠酶：在NOM培養(yǎng)基中添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的明膠，制作明膠平板。劃線長出明顯菌落后，將 Frazier試劑鋪滿平板表面，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈[23]。④淀粉酶：在NOM培養(yǎng)基中添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的可溶性淀粉，制作淀粉平板。菌種劃線接種在平板上，待有明顯菌落長出后，將碘液鋪滿平板表面，觀察菌落周圍是否有透明圈出現(xiàn)[23]。⑤觸酶：用5%(體積分?jǐn)?shù))的 H2O2溶液覆蓋新鮮菌落，觀察有氣泡產(chǎn)生的菌株，以此檢測觸酶活性[23]。⑥氧化酶：用1% (體積分?jǐn)?shù)) 對-氨基二甲基苯胺鹽酸鹽水溶液和1%α-萘酚乙醇溶液的混合溶液，浸潤濾紙，將新鮮菌落劃在濾紙上，菌落30 s內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色，即有氧化酶活性[23]。

1.2.5 菌株的抑菌活性檢測 將所選的18個代表菌株分別接種于NOM液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)。待OD600=1.0時，取10 mL菌懸液與在55 ℃保溫的100 mL的NOM固體培養(yǎng)基混合均勻，倒平板，即混菌平板。將20 μL各菌的菌懸液滴于不同的混菌平板上。37 ℃培養(yǎng)10 d，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，并記錄結(jié)果。

1.2.6 含拮抗活性物質(zhì)溶液制備 選擇較短時間內(nèi)抑菌活性最明顯的菌株ZSA68(測試菌)及其抑制的敏感菌ZSA28(底板菌)進(jìn)行拮抗活性物質(zhì)溶液制備。在混菌平板(平板中含ZSA28菌懸液)和空白NOM平板(平板中不含任何菌懸液)上的相同位置滴20 μL的ZSA68菌懸液，培養(yǎng)7 d，觀察混菌平板上抑菌圈的位置，在空白的NOM平板上，摳出相對應(yīng)位置的瓊脂塊，采用離心固液分離的方法，12 000 r/min離心5 min，提取瓊脂塊中的具有拮抗活性物質(zhì)溶液。

1.2.7 拮抗活性物質(zhì)理化性質(zhì)測定 ①分子量測定：用孔徑約 6 mm的無菌打孔器在混菌平板上打孔，制作帶孔的混菌平板(ZSA28平板)。在截留分子量大小為3、10、30、50 kDa的超濾管中分別加入500 μL的上述拮抗活性物質(zhì)溶液，于4 ℃，4 000 r/min開始離心，待截留液(上部)為250 μL時，停止離心，收集不同規(guī)格超濾離心管內(nèi)的截留液和流出液(下部)。分別將200 μL的截留液和流出液滴入帶孔的混菌平板孔內(nèi)，于37 ℃靜置培養(yǎng)1 d，觀察并測量抑菌圈直徑。②熱穩(wěn)定性測定：取8個1.5 mL的無菌離心管，各加入200 μL上述制備的拮抗活性物質(zhì)溶液，分別在室溫、40、50、60、70、80、90和100 ℃條件下處理30 min，待冷卻后分別加入混菌平板孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)1 d，觀察現(xiàn)象。用ZSA28的混菌平板檢測其熱穩(wěn)定性。③低鹽活性測定：拮抗活性物質(zhì)溶液中NaCl的濃度為20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)。根據(jù)需要在200 μL 拮抗活性物質(zhì)溶液中加入無菌水，調(diào)整NaCl的濃度至2%、4%、6%、8%、10%和15%等6個濃度。用截留分子量大小為3 kDa的超濾管，4 ℃，4 000 r/min開始離心，待截留液溶液體積降到200 μL時，停止離心，用移液槍吹打超濾管的含膜的內(nèi)壁，收集截留液。用ZSA28的混菌平板檢測其在低鹽條件下的拮抗活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株16S rRNA基因序列登錄號

將分離到的131株嗜鹽古菌的16S rRNA序列提交GenBank，獲得以下序列登錄號：MZ496691～MZ496693(3株菌株)、MZ619011～MZ619025(15株菌株)和MZ622035～MZ622147(113株菌株)。

2.2 海帶鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌物種組成分析

因僅用了嗜鹽古菌引物進(jìn)行PCR技術(shù)，故經(jīng)純培養(yǎng)分離后，從海帶鹽樣品中只分離到嗜鹽古菌，共131株。經(jīng)16S rRNA 基因測序和序列同源性分析，建立可培養(yǎng)嗜鹽古菌分子鑒定表(表1)，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。分析表1和圖1，發(fā)現(xiàn)所分離到的嗜鹽古菌分布于Haloarcula、Halorubrum、Halarchaeum、Halobacterium、Halococcus、Halolamina和Haloplanus等7個屬，分別隸屬于鹽桿菌綱(Halobacteria)的Haloferacales 和Halobacteriales 2個目；分布于Halorubraceae、Halobacteriaceae、Haloarculaceae、Halococcaceae 和Haloferacaceae 5個科，未發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌的新屬。

由圖2可知，在分離出的嗜鹽古菌中，Halobacterium為該環(huán)境下的優(yōu)勢物種，共51株，占所分離嗜鹽古菌的39.0%。其次為Halorubrum、Halolamina、Halarchaeum、Haloarcula、Halococcus和Haloplanus的菌株，分別有38、29、7、3、2和1株，分別占所分離菌株的29.0%、22.1%、5.3%、2.3%、1.5%和0.8%。

圖1 根據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建的代表菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of representative strains constructed according to 16S rRNA sequence括號內(nèi)為菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登錄號，分支點上的數(shù)值為1 000次Bootstrap分析所得值，標(biāo)尺0.020為進(jìn)化距離The numbers in parentheses represent the accession numbers in the GenBank for the 16S rRNA gene sequences of those reference strains and screened strains. The value on the branch point is the value obtained by 1 000 bootstrap analysis, and the scale 0.020 is the evolutionary distance

圖2 海帶鹽中嗜鹽古菌組成(屬水平)Fig.2 Composition of halophilic archaea in salted kelp (genus level)

2.3 胞外酶活性檢測

根據(jù)測序結(jié)果，從不同的種屬中選取18株嗜鹽古菌進(jìn)行胞外酶活性檢測。其中產(chǎn)胞外蛋白酶1株，酯酶2株，明膠酶7株，氧化酶1株，觸酶 5 株(表2)。產(chǎn)胞外蛋白酶菌株僅1株為ZSA80(圖3A)，在胞外蛋白酶檢測中，由于脫脂奶粉含80%的酪蛋白，還有一些其他蛋白質(zhì)，而且配置牛奶培養(yǎng)基較簡單, 故使用脫脂奶粉來作為水解底物[1]。酯酶檢測實驗中，吐溫-20、-40、-60、-80代表具有不同類型的酯類，只要有一種酯酶有活性均記作具有酯酶活性，其中有2個菌株具有酯酶活性，分別為ZSA1和ZSA12。菌株ZSA36、ZSA80、ZSA32、ZSA10、ZSA25、ZSA28和ZSA183具有明膠酶活性(圖3B)。 菌株ZSA3具有氧化酶活性，菌株ZSA22、ZSA12、ZSA1、ZSA93和ZSA80具有觸酶活性?？梢娋甑陌饷富钚源嬖诜N屬差異，Haloarcula和Halolamina產(chǎn)胞外酶的菌株較多，且存在一種菌株含多種胞外酶活性，如菌株ZSA1具有酯酶和觸酶雙陽性，菌株ZSA80具有明膠酶、蛋白酶和觸酶三陽性。

表2 代表菌株的胞外酶篩查鑒定表

圖3 胞外酶活和拮抗作用檢測Fig.3 Detection of extracellular enzyme activity and antibacterial effectA:菌株ZSA80胞外蛋白酶活性； B:菌株ZSA10和ZSA36胞外明膠酶活性； C:菌株拮抗作用。菌株ZSA28、ZSA32、ZSA67和ZSA68作為測試菌, 滴在菌株ZSA28的混菌平板上; 菌株ZSA28作為指示菌A:Extracellular protease activity of ZSA80； B:Extracellular gelatinase activity of ZSA10 and ZSA36； C:Antagonism of strains. ZSA28, ZSA32, ZSA67 and ZSA68 were taken as the test strains； ZSA28 was taken as indicating strain

2.4 抑菌活性篩選

采用抑菌圈法對18個代表菌株進(jìn)行菌株之間拮抗作用的檢測，菌株的抑菌活性通過抑菌圈大小來表示(表3)。實驗結(jié)果表明，在測試的18個菌株中，菌株ZSA1、ZSA93、ZSA32、ZSA68、ZSA28和ZSA67表現(xiàn)出拮抗活性，占測試菌株的33.3%，除菌株ZSA32外，其余5個菌株的生長速度均較快，一周之內(nèi)即可看到明顯的菌落形態(tài)，而菌株ZSA32則需2周。拮抗菌株中ZSA68、ZSA28和ZSA67均來自Halorubrum，且Haloru-brum是本研究分離嗜鹽古菌中的第二大優(yōu)勢物種，占比29.0%。菌株ZSA32、ZSA68和ZSA67能對較多的菌株產(chǎn)生拮抗活性，而菌株ZSA28能被較多菌株抑制(圖3C)；菌株ZSA32和ZSA67對菌株的拮抗活性較為相似，可能這兩株菌株間具有較近的親緣關(guān)系；菌株ZSA3、ZSA25、ZSA68和ZSA67被抑制的現(xiàn)象均需培養(yǎng)10 d以上才能觀察到；菌株ZSA1和ZSA93也均需培養(yǎng)10 d以上才能觀察到明顯的抑菌作用；另外，特別有趣的是菌株ZSA67和ZSA68能發(fā)生互相抑制的現(xiàn)象。

由表3可以看出，菌株ZSA22和ZSA28均能被較多菌株抑制，并且較短時間內(nèi)能觀察到明顯的抑菌現(xiàn)象，但菌株ZSA22(14 d)較ZSA28(7 d)生長速度緩慢，故選擇菌株ZSA28作為底板菌株。在ZSA28作底板菌時，菌株ZSA93、ZSA32、ZSA68和ZSA67均能對菌株ZSA28產(chǎn)生抑制作用，其中菌株ZSA68的抑菌活性最好，且菌株ZSA68生長速度較快，易培養(yǎng)。由此可見菌株ZSA68具有較強的抑菌活性和較廣的抑菌譜，故選擇菌株ZSA68作為拮抗活性測試菌株進(jìn)行后續(xù)的實驗。

表3 代表菌株的抑菌活性檢測

2.5 拮抗菌株抑菌物質(zhì)理化性質(zhì)

拮抗菌株ZSA68抑菌物質(zhì)的分子量較大，由圖4A可以看出，抑菌物質(zhì)溶液經(jīng)4種不同規(guī)格的超濾管離心處理后，取不同規(guī)格離心管的截留液和流出液，加入到菌株ZSA28混菌平板孔內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了50 kDa的截留液，3、10和30 kDa的截留液均有抑菌活性，但流出液僅50 kDa有抑菌活性，3、10和30 kDa的流出液均未出現(xiàn)抑菌活性，故判斷抑菌物質(zhì)分子量大小為30～50 kDa(圖4A)。

由圖4B可知，抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較差，抑菌物質(zhì)溶液在室溫、40、50、60、70、80、90和100 ℃等不同溫度下處理30 min后，僅室溫、40和50 ℃處理后的抑菌物質(zhì)溶液出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，從抑菌圈的大小可以看出活性相當(dāng)，而60、70、80、90和100 ℃處理后，基本未見明顯的抑菌現(xiàn)象。這表明室溫、40和50 ℃處理后，抑菌活性基本沒有變化，但在60、70、80、90和100 ℃處理30 min 后，抑菌活性均消失，因此判斷抑菌物質(zhì)在50～60 ℃范圍內(nèi)失活(圖4B)。

觀察抑菌物質(zhì)所產(chǎn)抑菌圈大小(圖4C)可知，抑菌物質(zhì)在6%、8%、10%和15%NaCl濃度時，抑菌圈大小非常接近，抑菌活性基本未變；當(dāng)NaCl濃度降到4%時，抑菌圈明顯縮小，活性明顯降低；當(dāng)降到2%時，已無抑菌圈出現(xiàn)，活性消失。因此，該抑菌物質(zhì)最低耐低鹽活性范圍在2%～4%的NaCl濃度(圖4C)。

綜上可知，在以菌株ZSA28作為敏感菌時，拮抗菌株ZSA68抑菌物質(zhì)的分子量為30～50 kDa，抑菌物質(zhì)在50～60 ℃范圍內(nèi)失活，在鹽度2%～4%范圍內(nèi)失去活性。

圖4 ZSA68所產(chǎn)胞外拮抗活性物質(zhì)理化性質(zhì)Fig.4 Physicochemical properties of ZSA68 antibacterial substance拮抗活性測定均以ZSA28作為底板指示菌, 產(chǎn)生抑菌圈即代表有抑菌活性;A: 抑菌活性物質(zhì)分子量測定, a: 3 kDa截留液, b: 3 kDa流出液, c: 10 kDa截留液, d: 10 kDa流出液, e: 30 kDa截留液, f: 30 kDa流出液, g: 50 kDa截留液, h: 50 kDa流出液; B: 抑菌活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性, i: 室溫, j: 40 ℃, k: 50 ℃, l: 60 ℃, m: 70 ℃, n: 80 ℃, o: 90 ℃, p: 100 ℃;C: 抑菌活性物質(zhì)耐鹽性, 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.15表示抑菌物質(zhì)溶液中NaCl濃度分別為2%、 4%、 6%、 8%、10%和15% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) ZSA28 was taken as the indicating strain, inhibition zone represented the antagonistic activity；A: Molecular weight of antibacterial substance， a: 3 kDa retained solution， b: 3 kDa efflux， c: 10 kDa retained solution， d: 10 kDa efflux， e: 30 kDa retained solution， f: 30 kDa efflux， g: 50 kDa retained solution， h: 50 kDa efflux； B: Thermal stability of antibacterial substance， i: Room temperature， j: 40 ℃， k: 50 ℃， l: 60 ℃， m: 70 ℃， n: 80 ℃， o: 90 ℃， p: 100 ℃； C: Salt tolerance of antibacterial substance， 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10 and 0.15 indicate that the NaCl concentration in the antibacterial substance solution is 2%、 4%、 6%、 8%、 10% and 15% (mass fraction) respectively

3 討 論

目前，國內(nèi)對高鹽食品中嗜鹽細(xì)菌的研究較多。如周煜華[24]在進(jìn)口咸魚中分離到溶藻性弧菌(嗜鹽菌的一種)；梁恒宇等[25]在自然發(fā)酵的黃豆醬樣品中分離出28株嗜鹽細(xì)菌；董玲等[26]在四川冬菜中分離到了中度嗜鹽菌。但對嗜鹽古菌的研究卻相對較少，對高鹽食品中嗜鹽古菌的研究大多數(shù)是國外的。如Roh等[27]在蝦、貝類、烏賊、牡蠣等發(fā)酵海鮮樣品中分離到了Halorubrum、Natrinema、Halococcus、Halobiforma、Halobacterium和Halalkalicoccus等屬的嗜鹽古菌。

本研究從煙臺海帶鹽中分離到來自Haloarcula、Halorubrum、Halarchaeum、Halobacterium、Halococcus、Halolamina和Haloplanus等7個屬的嗜鹽古菌菌株。其中Halococcus和Haloplanus嗜鹽古菌菌株在大連海帶鹽、榮成海帶鹽、連云港海帶鹽中較少見，Halolamina和Haloplanus嗜鹽古菌菌株在霞浦海帶鹽中較少見。而在上述4種海帶鹽中發(fā)現(xiàn)的Haloterrigena、Haloarchaeobius、Halovivax、Natrialba、Haloferax、Salinigranum等多種屬菌株未在本實驗中分離到[8]。本研究的海帶鹽中優(yōu)勢物種為Halobacterium物種，占比39.0%，這與大連海帶鹽中的優(yōu)勢物種一致，而連云港海帶鹽的優(yōu)勢物種為Halarchaeum，榮成和霞浦海帶鹽的優(yōu)勢物種為Haloarcula。這表明雖然不同地方的海帶鹽中所含的嗜鹽古菌種類存在很大差異，但優(yōu)勢物種存在相似之處，如Halobacterium、Halarchaeum、Haloarcula等屬嗜鹽古菌在大部分海帶鹽中均處于優(yōu)勢地位[8]。據(jù)此可以猜測，由于地理環(huán)境的不同，海帶鹽中嗜鹽古菌的生存環(huán)境也隨之改變。長期以來，能適應(yīng)生存環(huán)境的菌株就會存活下來，并不斷地進(jìn)化來適應(yīng)環(huán)境的改變；而不能適應(yīng)的菌株則會不斷地被淘汰，從而導(dǎo)致不同地方的海帶鹽中嗜鹽古菌的優(yōu)勢物種比較統(tǒng)一，物種多樣性產(chǎn)生較大差異。

嗜鹽古菌生活在獨特的高鹽環(huán)境中，因此其胞外酶具有獨特的理化性質(zhì)，表現(xiàn)出極高的耐鹽性，較好的熱穩(wěn)定性，以及較強的催化活性[28]。本研究從18個代表菌株中篩選到了產(chǎn)胞外蛋白酶1株，酯酶2株，明膠酶7株，氧化酶1株，觸酶5株。這與巴里坤湖與瑪納斯湖[10]和新疆羅布泊地區(qū)[1]所分離到的菌株產(chǎn)胞外酶的情況存在較大差異。海帶鹽來源的嗜鹽古菌菌株中具有胞外酯酶和淀粉酶活性菌株比例低于從巴里坤湖、瑪納斯湖和新疆羅布泊地區(qū)分離的嗜鹽古菌菌株，但具有胞外明膠酶和觸酶活性的菌株占比較高。本研究代表菌株具有較豐富的胞外酶特性，部分菌株的酶活性較高，表現(xiàn)出雙陽性甚至三陽性，說明嗜鹽古菌在酶活特性應(yīng)用方面有很大潛力。

嗜鹽古菌能產(chǎn)生豐富的抑制或殺死相近種屬菌株的功能抑菌活性物質(zhì)[29-33]，如嗜鹽菌素等。本研究對18個代表菌株進(jìn)行了嗜鹽古菌之間拮抗活性篩查，從中獲得了6株具有拮抗活性的嗜鹽古菌菌株，分別為菌株ZSA1、ZSA28、ZSA32、ZSA67、ZSA68和ZSA93，除菌株ZSA68和ZSA67，其余4株菌株均具有嗜鹽古菌胞外酶活性。拮抗菌株分別來自Haloarcula、Halobacterium、Halolamina和Halorubrum等4個屬，其中菌株ZSA28、ZSA67和ZSA68均來自Halorubrum，Halorubrum的菌株ZSA68表現(xiàn)出較好的抑菌活性和較廣的抑菌譜。由于菌株ZSA68所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)在60 ℃以上的溫度條件下即失去抑菌活性，因此初步推測該抑菌活性物質(zhì)為多肽或蛋白類抑菌活性物質(zhì)。對菌株ZSA68中抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行了初步的理化性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)菌株ZSA68抑菌活性物質(zhì)的分子量為30～50 kDa，且在溫度達(dá)60 ℃以上或鹽濃度低于2%時失去抑菌活性。菌株ZSA68所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的分子量較大，熱穩(wěn)定性較低，耐鹽性較強，且對其他菌株有較好的抑菌特性，這對高鹽食品防腐抑菌具有較高的參考價值。

綜上所述，海帶鹽中分布有豐富的嗜鹽古菌，其胞外功能酶活性在高鹽食品發(fā)酵、高鹽廢水處理和制革工業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。在抑菌方面具有很大的開發(fā)潛力和商業(yè)價值，高鹽食品中較高的鹽濃度可以抑制多數(shù)細(xì)菌的生長，但仍會腐敗變質(zhì)[34-36]，故嗜鹽古菌的拮抗活性在高鹽食品的防腐方面具有重要應(yīng)用前景。