（長春科技學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，吉林長春130600）

皂苷又名皂素或皂草苷，是螺甾烷及其生源相似的甾類化合物的寡糖苷以及三萜類化合物的寡糖苷，植物皂苷是一種天然生物活性物質(zhì)，由糖和皂苷元組成，大多可溶于水，是許多中草藥的有效成分，如人參皂苷和甘草皂苷等[1-2]。皂苷可以抑制膽固醇在腸道的吸收，具有降低血漿膽固醇的作用[3]；許多皂苷還具有抗菌和抗病毒活性，廣泛應(yīng)用于食品、藥品以及化妝品的添加劑，目前是我國功能性食品常用的功效成分[4]。黑豆為豆科植物大豆的黑色種子，黑豆?fàn)I養(yǎng)豐富，富含粗蛋白、不飽和脂肪酸和人體必需氨基酸，還含有對人體健康有益的多種生理活性物質(zhì)，如低聚糖、皂苷、異黃酮等[5-7]。目前對黑豆的研究主要集中在對黑豆中多酚類物質(zhì)、黃酮、異黃酮和豆色素等成分的提取工藝和抗氧化性研究及生物穩(wěn)定性方面，對黑豆中總皂苷的提取工藝報(bào)道極少[8]。本試驗(yàn)以黑豆為主要原料，優(yōu)化黑豆總皂苷的提取工藝參數(shù)，旨在為黑豆總皂苷的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

黑豆：市售。皂苷標(biāo)準(zhǔn)品：大連美侖生物技術(shù)有限公司。焦性沒食子酸、冰乙酸、鹽酸（36%～38%）、無水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、乙腈、乙酸乙酯（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

TU-1810紫外可見風(fēng)光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；XZ-990旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；202-O臺(tái)式電熱干燥箱：中國天津泰斯特儀器有限公司；SZCL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市科瑞儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總皂苷的提取

原料晾干、除雜、粉碎，過40目篩，儲(chǔ)存于陰涼干燥處。黑豆粉20.0 g，加入乙醇，回流提取。上清液混合，靜置12 h，過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，真空干燥得提取物。

1.2.2 總皂苷的測定

總皂苷提取率參照石麗霞等[9]的人參總皂苷提取工藝法測定。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、液固比、提取次數(shù)和水浴溫度5個(gè)因素，以總皂苷提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對試驗(yàn)影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.05軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對總皂苷提取率的影響

準(zhǔn)確稱取樣品20.0 g，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇160 mL，水浴溫度85℃，提取時(shí)間為1.5 h，提取3次，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對總皂苷提取率的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction rate of total saponins

由圖1可知，曲線呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，總皂苷提取率較低，說明只提取出部分皂苷。乙醇濃度為60%～80%，總皂苷提取率較為穩(wěn)定，70%的乙醇總皂苷提取率最高。當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，總皂苷提取率降低明顯，可能是因?yàn)楦邼舛鹊囊掖紝υ碥杖芙舛扔杏绊憽＞C上所述，選取乙醇濃度60%、70%、80%3個(gè)水平優(yōu)化。

2.1.2 提取時(shí)間對總皂苷提取率的影響

準(zhǔn)確稱取樣品20.0 g，加入80%乙醇160 mL，水浴溫度 85 ℃，提取時(shí)間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取3次，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對總皂苷提取率的影響Fig.2 Influence of extraction time on extraction rate of total saponins

由圖2可知，提取時(shí)間對總皂苷提取率的影響比較明顯，呈現(xiàn)升高、平穩(wěn)、下降的趨勢。0.5 h時(shí)，總皂苷提取率較低。0.5 h～1.0 h，總皂苷提取率增加較多。1.0 h～2.0 h期間，總皂苷提取率變化不大，2.0 h之后，總皂苷提取率下降明顯，可能長時(shí)間的提取，部分雜質(zhì)同時(shí)被提取出來，降低了總皂苷的提取率[10]。綜上所述，選取1.0 h為最佳提取時(shí)間，不進(jìn)行后續(xù)水平優(yōu)化。

2.1.3 液固比對總皂苷提取率的影響

準(zhǔn)確稱取樣品20.0 g，分別按照液固比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1（mL/g）加入 80%乙醇，水浴溫度 85 ℃，提取時(shí)間1.5 h，提取3次，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 液固比對總皂苷提取率的影響Fig.3 Influence of liquid to solid ratio on extraction rate of total saponins

由圖3可知，當(dāng)乙醇添加量逐漸增加時(shí)，總皂苷提取率也逐漸增加，特別是液固比從4∶1（mL/g）到6∶1（mL/g）時(shí)，提取率增加尤其顯著，可能是因?yàn)樯倭康囊掖紵o法全部提取出皂苷類物質(zhì)。液固比6∶1（mL/g）～10∶1（mL/g）時(shí)曲線較為平緩，在乙醇含量達(dá)到200 mL之后，基本沒有太大變化，說明再增加液固比，對皂苷提取意義不大。綜上考慮，選取液固比6∶1、8∶1、10 ∶1（mL/g）3 個(gè)水平優(yōu)化。

2.1.4 提取次數(shù)對總皂苷含量的影響

準(zhǔn)確稱取樣品20.0 g，加入80%乙醇160 mL，水浴溫度 85 ℃，提取時(shí)間為 1.5 h，分別提取 1、2、3、4、5次，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對總皂苷提取率的影響Fig.4 Influence of extraction times on extraction rate of total saponins

由圖4可知，曲線呈現(xiàn)先上升后下降最后平緩趨勢。提取1次，總皂苷提取率低，說明1次提取，總皂苷提取有限。提取2次，總皂苷含量明顯增加。3次～5次提取時(shí)，總皂苷提取率下降明顯，說明提取次數(shù)過多，提取物不純，降低了總皂苷提取率。綜上所述，選取1、2、3次提取3個(gè)水平優(yōu)化。

2.1.5 水浴溫度對總皂苷提取率的影響

準(zhǔn)確稱取樣品20.0 g，加入80%乙醇160 mL，分別設(shè)置水浴溫度 75、80、85、90、95 ℃，提取時(shí)間為 1.5 h，提取3次，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 水浴溫度對總皂苷提取率的影響Fig.5 Influence of water bath temperature on extraction rate of total saponins

由圖5可知，水浴溫度對總皂苷提取率的影響呈現(xiàn)先升高、后降低趨勢。前期隨著溫度的升高，總皂苷提取率增加，可能是因?yàn)闇囟壬?，有利于皂苷類物質(zhì)溶出。溫度85℃時(shí)，總皂苷提取率最大。當(dāng)溫度超過85℃時(shí)，總皂苷含量開始下降，可能是因?yàn)楦邷卮偈乖碥疹愇镔|(zhì)部分降解，導(dǎo)致總皂苷含量降低[11-12]。綜上所述，選取85℃為最佳提取溫度。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化與分析

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、液固比、提取次數(shù)為影響因素，以總皂苷提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，見表1。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Three factors and three levels’response surface methodology design

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Analysis method and results of surface response experiment

2.2.2 顯著性檢驗(yàn)及方差分析

回歸模型方差分析見表3。

應(yīng)用Design-Expert 8.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的二次回歸模型為：Y=3.24+0.36A+0.56B-0.17C+0.13AB-0.075AC-0.27BC-0.56A2-0.26B2-0.39C2。從模型得出，影響總皂苷提取率的因素大小順序?yàn)椋阂汗瘫?提取次數(shù)>乙醇濃度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic polynomial model

由表3方差分析可以看出，該模型差異極顯著（P<0.000 1），表明方程與實(shí)際情況擬合良好；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.199 9>0.05），表明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾小；模型的R2=0.994 2，表明模型可信度良好表明98.68%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋。綜上所述，該模型可以對黑豆總皂苷的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪制交互作用較為明顯的響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖，如圖6、圖7和圖8所示。

液固比、乙醇濃度和提取次數(shù)均對總皂苷提取率有顯著影響（P<0.05）。

圖6 液固比與乙醇濃度交互作用對總皂苷含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface graph and contour map for effects of liquid-solid rate and ethanol concentration on extraction rate of total saponins

圖7 液固比與提取次數(shù)交互作用對總皂苷含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface graph and contour map for effects of liquid-solid rate and extraction times on extraction rate of total saponins

圖8 乙醇濃度與提取次數(shù)交互作用對總皂苷含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface graph and contour map for effects of ethanol concentration and extraction times on extraction rate of total saponins

由圖6可知，液固比對總皂苷提取率的影響比乙醇濃度大。當(dāng)液固比為6∶1（mL/g）時(shí)，隨乙醇濃度增大，總皂苷提取率呈現(xiàn)先增高、后降低的趨勢。由圖6等高線形狀可以確定這兩個(gè)影響因素的較優(yōu)水平范圍為：液固比 7.3 ∶1（mL/g）～10 ∶1（mL/g），乙醇濃度62%～80%。

由圖7可知，液固比對總皂苷提取率的影響比提取次數(shù)大。當(dāng)液固比為6∶1（mL/g）時(shí)，隨提取次數(shù)增多，總皂苷提取率呈現(xiàn)先增高后降低至相對穩(wěn)定。由圖7等高線形狀可以確定這兩個(gè)影響因素的較優(yōu)水平范圍為：液固比 7.5 ∶1（mL/g）～10 ∶1（mL/g），提取次數(shù)1.4次～3次。

由圖8可知，提取次數(shù)對總皂苷提取率的影響比乙醇濃度大。當(dāng)提取次數(shù)為1次時(shí)，隨乙醇濃度增大，總皂苷提取率逐漸增高。由圖8等高線形狀可以確定這兩個(gè)影響因素的較優(yōu)水平范圍為：乙醇濃度60%～80%，提取次數(shù)1.6次～3次。

2.2.4 最優(yōu)條件選擇與驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定黑豆總皂苷提取工藝條件為：乙醇濃度70.1%，液固比8.62∶1（mL/g），提取2.18次，總皂苷提取率為3.34%?？紤]實(shí)際操作，調(diào)整為：乙醇濃度70%，液固比9 ∶1（mL/g），提取 2 次，固定提取時(shí)間 1 h、水浴溫度85℃，以此為提取條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均總皂苷提取率為3.33%，與預(yù)測值基本一致，驗(yàn)證了所建模型的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要對黑豆總皂苷的提取工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對總皂苷含量影響較大的3個(gè)因素做三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出該模型可以對黑豆總皂苷提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。確定總皂苷最佳提取工藝為：乙醇濃度70%，液固比9∶1（mL/g），提取次數(shù)2次，提取時(shí)間1 h，水浴溫度85℃，平均總皂苷提取率為3.33%。