張富坤，孫 媛，高藝菲，王 嬌，高世杰，趙 盼，柯仲成 ，趙東升,

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東濟(jì)南 250355；3.黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山 245041）

柿葉為柿樹(shù)科柿樹(shù)屬植物柿（Diospyros kakiThunb.）的干燥葉，入藥最早見(jiàn)于《滇南本草》[1]，目前已作為一種天然食品添加劑廣泛用于食品生產(chǎn)，如糖果、茶飲、餅干等[2]。柿葉中富含黃酮、多糖、萜類、多酚及香豆素等多種對(duì)人體健康有益的成分[3?4]。黃酮類化合物為柿葉中主要成分之一，在抗氧化、抗菌、抗衰老、調(diào)節(jié)血壓等方面具有顯著療效[5?6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，外源性抗氧化劑可清除活性氧及自由基，防治氧化應(yīng)激給機(jī)體帶來(lái)的損傷[7]。柿葉抗氧化效果顯著，已成為天然抗氧化劑研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。

目前，傳統(tǒng)有機(jī)溶劑在天然活性成分的提取工藝研究中占主導(dǎo)地位，但存在溶劑消耗量大、提取率低等問(wèn)題。表面活性劑作為一種新型綠色、環(huán)保的提取劑，因具有降低固/液表面張力、增加成分溶出、縮短提取時(shí)間、減少有機(jī)試劑用量等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于天然活性成分提取工藝研究中[8?10]。國(guó)內(nèi)雖已有學(xué)者利用超聲提取法[5,11?12]或復(fù)合酶協(xié)同超聲法[13]對(duì)柿葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，但將超聲提取技術(shù)和表面活性劑相結(jié)合提取柿葉總黃酮的研究鮮有報(bào)道。同時(shí)，僅憑借柿葉總黃酮含量高低對(duì)提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)具有一定的局限性，若能將總黃酮得率與生物活性相整合則可綜合全面地評(píng)價(jià)其提取工藝[14?15]。因此，本試驗(yàn)在盧鑫等[5]前期研究的基礎(chǔ)上，采用表面活性劑協(xié)同超聲提取技術(shù)，以總黃酮得率和抗氧化活性為雙指標(biāo)參數(shù)的響應(yīng)面法優(yōu)化柿葉總黃酮提取工藝，旨在為柿葉黃酮類成分資源的深入研究開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿葉（河北易縣） 安國(guó)市御顏坊中藥材有限公司，山東中醫(yī)藥大學(xué)孫稚穎教授鑒定為柿樹(shù)科柿樹(shù)屬植物柿的干燥葉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)B20771） 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2picryl-hydrazyl，DPPH，純度大于97%）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、吐溫80（Tween-80） 均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇 分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津市匯杭化工科技有限公司；亞硝酸鈉 分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；硝酸鋁 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

KQ-500GVDV雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；ST16R高速冷凍離心機(jī)

賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；GFL-230電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；QE-300高速離心機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司；FA1204B電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；UV 9100 B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柿葉總黃酮的提取

1.2.1.1 樣品預(yù)處理 取適量柿葉藥材，置于50 ℃烘箱中，干燥6 h至恒重，用打粉機(jī)粉碎，過(guò)三號(hào)篩，即得柿葉粉末。

1.2.1.2 柿葉總黃酮的提取 參照劉釗等[9]報(bào)道的方法，精確稱取柿葉粉末0.20 g，置于15 mL離心管中，按照一定的液料比加入一定體積的溶劑，在一定溫度下進(jìn)行超聲（固定頻率45 kHz）提取，在溫度25 ℃和轉(zhuǎn)速13000 r/min下離心15 min，取上清液作為總黃酮提取液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 在前期研究報(bào)道的基礎(chǔ)上，固定乙醇濃度70%，超聲功率350 W[5]，分別考察表面活性劑種類、表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度五個(gè)因素對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.1 不同表面活性劑種類對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準(zhǔn)確稱取柿葉粉末0.20 g，在表面活性劑含量0.5%、液料比20:1（mL/g）、超聲溫度30 ℃、超聲時(shí)間10 min的條件下，探究非離子型表面活性劑—吐溫80（Tween-80）、陰離子型表面活性劑—十二烷基硫酸鈉（SDS）、陽(yáng)離子型表面活性劑—十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、70%乙醇對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.2 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準(zhǔn)確稱取柿葉粉末0.20 g，在液料比20:1（mL/g）、超聲時(shí)間10 min、超聲溫度30 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%條件下，探究SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.3 液料比對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準(zhǔn)確稱取柿葉粉末0.20 g，在SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、超聲時(shí)間10 min、超聲溫度30 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%的條件下，探究液料比為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1（mL/g）對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準(zhǔn)確稱取柿葉粉末0.20 g，在SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、液料比20:1（mL/g）、超聲溫度30 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%的條件下，探究超聲時(shí)間為5、10、15、20、25 min對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.5 超聲溫度對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準(zhǔn)確稱取柿葉粉末0.20 g，在SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、液料比20:1（mL/g）、超聲時(shí)間10 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%的條件下，探究超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[5]，選擇影響較大的三個(gè)因素為自變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率為雙響應(yīng)值，進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 總黃酮的測(cè)定 參照秦晶晶等[11]報(bào)道的柿葉總黃酮測(cè)定方法，并稍作修改。依次吸取系列蘆丁對(duì)照品溶液，分別置于10 mL容量瓶，加水至2.5 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加4%氫氧化鈉溶液6 mL，加乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min，于510 nm處測(cè)定吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=11.646C+0.0003，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，表明蘆丁在0~0.05 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

取提取液0.1 mL，加水至2.5 mL，按上述方法測(cè)定，計(jì)算柿葉總黃酮得率。公式如下：

式中：C為根據(jù)回歸方程計(jì)算得到的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為柿葉粉末質(zhì)量，g。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參照文獻(xiàn)報(bào)道的DPPH自由基清除率測(cè)定方法[11]。取提取液1 mL，加入無(wú)水乙醇，稀釋至25 mL。取2 mL稀釋液，加入0.1 mg/mL的DPPH溶液2 mL，混合搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm測(cè)定吸光度A。

式中：A空白為2 mL DPPH溶液加入2 mL乙醇溶液的吸光度；A樣品為2 mL DPPH溶液加入2 mL柿葉樣品稀釋液的吸光度；A對(duì)照為2 mL柿葉樣品稀釋液加入2 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)操作均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±SD表示。采用軟件SPSS26.0、Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。方差分析中P<0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 表面活性劑的種類對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖1可知，不同類型表面活性劑破壞細(xì)胞膜的能力不同，導(dǎo)致提取成分的含量也存在一定的差異[9]，Tween-80總黃酮得率和DPPH自由基清除率最低，SDS總黃酮得率和DPPH自由基清除率最高，CTAB和70%乙醇次之。因此，實(shí)驗(yàn)選擇SDS作為表面活性劑。

圖1 表面活性劑種類對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of surfactant types on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.2 SDS含量對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖2可知，SDS含量在0.0%~0.5%之間，總黃酮得率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，總黃酮得率最高，存在明顯差異；SDS含量在0.5%~2%之間，總黃酮得率呈下降趨勢(shì)。這與前期報(bào)道的現(xiàn)象一致，隨著SDS含量的增加，溶液中形成的膠束數(shù)目增多，對(duì)柿葉總黃酮的增溶作用加大[16]，當(dāng)SDS含量增加到一定數(shù)值時(shí)，膠束形態(tài)發(fā)生改變，總黃酮得率不再增加，而對(duì)其他成分起到較強(qiáng)增溶作用[17]，導(dǎo)致總黃酮得率有所下降。對(duì)于DPPH自由基清除率，其變化趨勢(shì)與總黃酮得率一致。綜合考慮，SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%較為合適。

圖2 SDS含量對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of SDS content on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.3 液料比對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖3可知，柿葉總黃酮得率隨液料比的增大而增加，在20:1 mL/g時(shí)達(dá)到最高值，之后再增大液料比總黃酮得率反而降低。隨著液料比的增加，雖然增大了提取溶劑與柿葉粉末的接觸面積，其他雜質(zhì)、色素的溶出也增多[18?19]，使得總黃酮得率出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。從DPPH清除率角度來(lái)看，其變化趨勢(shì)與總黃酮得率呈現(xiàn)一致性。從節(jié)約成本并保證清除率的角度綜合考慮，選擇液料比為20:1 mL/g。

圖3 液料比對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on rate of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，柿葉總黃酮得率與DPPH清除率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在超聲時(shí)間10 min時(shí)達(dá)到最大值，這與前期報(bào)道的超聲提取柿葉總黃酮工藝相比，大大縮短了提取時(shí)間[5,13]。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，柿葉總黃酮得率增加，但空化效應(yīng)減弱，柿葉對(duì)總黃酮的吸附能力增強(qiáng)[20?21]，從而對(duì)DPPH自由基的清除能力也有所減弱。因此，從柿葉總黃酮得率和DPPH清除率角度綜合考慮，確定超聲時(shí)間為10 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.5 超聲溫度對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖5可知，隨著溫度的升高，總黃酮得率和DPPH清除率均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，溫度在30 ℃時(shí)為最高點(diǎn)，40~60 ℃相對(duì)平穩(wěn)，70 ℃時(shí)明顯下降。此現(xiàn)象與前期研究結(jié)果相一致，溫度過(guò)高會(huì)破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，使形成的部分膠束發(fā)生離解，導(dǎo)致增溶能力下降[22]。因此，從降低能耗和保證DPPH自由基清除率的角度綜合考慮，選擇超聲溫度為30 ℃。

圖5 超聲溫度對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型建立與方差分析 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析基礎(chǔ)上，選取SDS含量（A）、液料比（B）、超聲時(shí)間（C）為自變量，總黃酮得率（Y1）和DPPH自由基清除率（Y2）為響應(yīng)值，運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。運(yùn)用Design-Expert 11.0軟件對(duì)雙響應(yīng)面進(jìn)行分析，得到Y(jié)1和Y2的回歸方程分別為：

表2 雙響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of double response surface analysis

由表3和表4可知，兩模型均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），且失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說(shuō)明模型擬合效果較好，無(wú)失擬因素存在?？傸S酮得率和DPPH自由基清除率的模型決定系數(shù)分別為R2=0.9779、R2=0.9695，說(shuō)明該模型擬合度較好，可以用于表面活性劑輔助超聲提取柿葉總黃酮提取工藝的初步和預(yù)測(cè)。變異系數(shù)CV%是衡量每個(gè)測(cè)量平均值偏離真實(shí)情況的參數(shù)，兩個(gè)模型的變異系數(shù)分別為1.44%和1.70%，均小于5%，說(shuō)明模型的實(shí)驗(yàn)操作可信、重復(fù)性較好[23]。

表3 柿葉總黃酮得率的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance on the extraction rate of total flavonoids from persimmon leaves

表4 DPPH自由基清除率的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance on the radical scavenging rate of DPPH

總黃酮得率和DPPH自由基清除率的分析結(jié)果顯示，一次項(xiàng)A、B、C與二次項(xiàng)A2、B2均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。通過(guò)對(duì)F值的比較，各因素對(duì)總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響程度均為SDS含量（A）>超聲時(shí)間（C）>液料比（B）。其中A、B和C因素以及A2、B2對(duì)柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響具有顯著性意義（P<0.05），而各因素交互作用AB、BC、AC的影響均不具有顯著性（P>0.05）。

2.2.2 響應(yīng)面最佳工藝預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Design Expert11.0.0軟件的分析優(yōu)化，得到的最佳提取工藝?yán)碚撝禐镾DS含量0.63%，液料比22.07:1 mL/g，超聲時(shí)間7.28 min，此時(shí)柿葉總黃酮得率的理論值為103.73 mg/g，DPPH自由基清除率理論值為65.47%。為了便于操作，實(shí)際操作時(shí)將最優(yōu)條件調(diào)整為SDS含量0.6%，液料比22:1 mL/g，超聲時(shí)間7.3 min，在此優(yōu)化條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到柿葉總黃酮得率的實(shí)際值為（103.63±0.10）mg/g，DPPH自由基清除率為（65.35%±0.12%），與理論值無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明此方法可行。這與前期僅采用超聲提取柿葉總黃酮工藝的研究[5,13]結(jié)果相比，表面活性劑大大提高了總黃酮的提取效率。

3 結(jié)論

本研究以總黃酮得率和DPPH自由基清除率為雙指標(biāo)參數(shù)，將化學(xué)成分與生物活性進(jìn)行有機(jī)整合，采用雙響應(yīng)面法優(yōu)化表面活性劑輔助超聲提取柿葉總黃酮工藝。表面活性劑的加入使得柿葉總黃酮提取效率和DPPH自由基清除率大大提高，縮短了提取時(shí)間，并且用量較低，具有經(jīng)濟(jì)和綠色的雙重效果。所得最佳提取工藝參數(shù)穩(wěn)定可行，有利于柿葉總黃酮作為天然抗氧化劑在飲品、藥品、化妝品和食品等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用，為功能性柿葉產(chǎn)品的深入研究與開(kāi)發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。同時(shí)，本研究中仍存在一些尚待解決的問(wèn)題，需先采用質(zhì)譜對(duì)總黃酮粗提物中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，再利用HPLC對(duì)其所含主要黃酮化合物進(jìn)行定量分析，將為后續(xù)進(jìn)一步從柿葉資源中分離、純化天然抗氧化劑提供一定的指導(dǎo)作用。