張愛琳，趙慧娟，遲 越，梁筱妍，李曉丹，郭 梅

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

腰果（Anacardium occidentaleLinnaeus）也稱為長壽果與樹花生，是漆樹科、腰果屬的一種常綠喬木[1]。腰果豐富的營養(yǎng)價值與醫(yī)藥價值使得其備受大眾喜愛[2?3]。但腰果蛋白是八大食物過敏原之一[4?6]。據(jù)研究報道，在我國一些地區(qū)，腰果可占食入性過敏原的8.50%，是引起支氣管哮喘最重要的食入性過敏原[7?8]。Sicherer等[9]研究發(fā)現(xiàn)118名過敏患者中有6%的人對腰果過敏，在后續(xù)跟蹤調(diào)查中發(fā)現(xiàn)145名對堅(jiān)果過敏的人群中有25%對腰果過敏[10?13]。國內(nèi)有研究學(xué)者應(yīng)用回顧性方法對213名對花生和堅(jiān)果過敏兒童進(jìn)行為期42個月的調(diào)查，花生過敏率為30.5%，腰果過敏率為74.1%[14]。目前由于缺乏對食物過敏的具體治療方法，避免食用過敏食物仍然是最好的選擇[15?18]。通過對照腰果過敏原的研究報道發(fā)現(xiàn)：腰果主要的過敏原為：Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3，它們分別是7S豌豆蛋白、11S球蛋白和2S白蛋白，均為種子儲存蛋白，但是Ana o 2分子量理論值有差異，有報道53 kD，也有33 kD[19?20]，分析原因有可能腰果過敏蛋白在加工過程中極易分解、聚集，有可能被水解成n端小亞基和c端大亞基或者是由二硫鍵連接變性還原，包含6、8和10 kDa的三種亞型[21]，所以有必要進(jìn)一步研究腰果主要過敏蛋白，更好地探究腰果過敏蛋白的表位結(jié)構(gòu)和開發(fā)低敏性產(chǎn)品做準(zhǔn)備[22]。隨著高精度質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，通過生物質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)、鑒定肽段已經(jīng)逐漸成為蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)[23?26]，結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫搜索預(yù)測過敏蛋白的過敏位點(diǎn)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一個重要研究方向，閆娟娟等[20]成功地克隆了Ana o 3的基因，朱倩倩等[27]通過生物信息軟件預(yù)測了重組腰果過敏蛋白Ana o 2的結(jié)構(gòu)，但從腰果中分離純化天然Ana o 2與Ana o 3及對其二級結(jié)構(gòu)的分析還有待完善。Ana o 1在腰果中含量低，過敏性弱，不易分離獲得[28]。本研究采用生物信息軟件與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合對致敏性強(qiáng)的腰果主要過敏原Ana o 2與Ana o 3結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以便于為后期深入研究腰果過敏機(jī)理及過敏蛋白Ana o 1提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生腰果仁 產(chǎn)于越南，購于淘寶，品牌悠米；石油醚 分析純，天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；丙酮

分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；碳酸氫鈉 分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；雙色預(yù)染蛋白Marker 10~250 kD、5×上樣緩沖液 上海雅酶生物科技有限公司；葡聚糖凝膠G-150、羊抗人IgG-HRP、BCA蛋白定量檢測試劑盒 索萊寶有限公司；硝酸纖維素膜（CN140）、樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊 上海捷寧生物科技有限公司。

H2050R多功能臺式冷凍離心機(jī) 上海埃德思生物科技有限公司；YA1073透析袋（8000~14000 D）索萊寶有限公司；BT-100純化儀、CBS-B程控多功能全自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；752N紫外分光光度計 上海精科儀器廠；PowerPac Basic電泳儀、GelDocXR+凝膠成像儀美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腰果過敏蛋白分離純化

1.2.1.1 樣品破碎與脫脂處理 取適量腰果去皮后于液氮中研碎成粉末，稱取適量于燒杯中，分別加入5倍體積的石油醚或丙酮于4 ℃下交替脫脂，直到上清液澄清為止。棄去有機(jī)相層，將沉淀置于通風(fēng)櫥中，使有機(jī)溶劑揮發(fā)干凈，稱重計算脫脂率。

1.2.1.2 腰果蛋白粗提取液的制備 參考文獻(xiàn)資料[29]，將脫脂后的腰果粉以1:10 （w/v）的比例加入pH7.0磷酸鹽緩沖液（1 mol/L），在4 ℃下磁力攪拌2 h，隨后4 ℃下10000 r/min離心10 min，過濾取上清液，將樣品冷凍備用。

1.2.1.3 透析 將粗蛋白提取液灌裝在透析袋中置于pH7.0的PBS緩沖液內(nèi)4 ℃下透析，期間2~4、6~8、10~14 h更換PBS緩沖液，直至緩沖液中不出現(xiàn)絮狀沉淀，收集透析液于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 蛋白的純化 將葡聚糖凝膠 Sephadex G-150干粉浸泡于蒸餾水中24 h后，煮沸12 h直到完全溶脹，在濕態(tài)下一次性灌裝到普通親和層析柱內(nèi)（操作方法參考說明書）。上樣前用pH7.0 PBS緩沖溶液平衡層析柱5個柱體積。樣品上樣，設(shè)置壓力為0.4 ba，過0.45 μm水膜，洗脫液為pH7.0、0.01 mol/L的PBS（含0.15 NaCl）在0.2 mL/min流速進(jìn)行洗脫，等體積收集，每管1 mL。將收集的蛋白含量高的溶液合并備用。

1.2.2 腰果過敏蛋白鑒定及過敏原性驗(yàn)證

1.2.2.1 BCA測定 蛋白濃度采用BCA蛋白定量試劑盒中微孔酶標(biāo)法測定蛋白濃度，具體操作方法參考說明書。

1.2.2.2 聚丙烯酰胺SDS-PAGE電泳 參照文獻(xiàn)[30]，選用Omni_PAGETM預(yù)制膠4%~15%。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液進(jìn)行4:1混合均勻，加熱處理5 min，室溫冷卻。每孔加10 μL樣品，最大上樣量為60 μL，設(shè)置電壓150 V，電泳時間40~50 min，當(dāng)溴酚藍(lán)指示帶至膠板底部時結(jié)束電泳，取出凝膠，在搖床上染色30 min，倒掉染色液，后進(jìn)行脫色。待完全褪色后用凝膠成像儀拍照保存。

1.2.2.3 免疫印跡（Western-Blotting） 腰果過敏患者及陰性血清由山西省某人民醫(yī)院提供。納入標(biāo)準(zhǔn):具有蕁麻疹、皮炎、哮喘或胃腸道不適等典型的臨床過敏癥的18~59歲的人群（不分性別），具體操作方法參考文獻(xiàn)[31]。一抗：過敏陽性血清，稀釋倍數(shù)1:100；二抗：羊抗人IgG-HRP，稀釋倍數(shù)1:5000；SDS-PAGE電泳膠：濃度15%。

1.2.3 腰果過敏蛋白結(jié)構(gòu)測定

1.2.3.1 腰果過敏蛋白質(zhì)譜測序分析 用甲醇潤濕2張聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，然后在小型轉(zhuǎn)移裝置中組裝轉(zhuǎn)印夾層，夾層順序?yàn)椋核芰峡?、海綿、濾紙、凝膠、2張PVDF膜、濾紙、海綿、塑料框，夾好放到PBS緩沖溶液中，將電壓設(shè)置為6 V/cm，轉(zhuǎn)移時間因目標(biāo)蛋白和凝膠的濃度而異；0.1%考馬斯亮藍(lán)的50%甲醇染色5 min后用含10%乙酸的50%甲醇脫色，參考1.2.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對目的蛋白進(jìn)行切膠（每次切膠都使用新的刀片）；全酶解：加入2 mol/L尿素（Urea） 20 μL酶解30 min；10 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）（25 mmol/L NH4HCO3溶解）20 μL，37 ℃水浴1 h；加55 mmol/L吲哚乙酸（IAA）（25 mmol/L NH4HCO3溶解）20 μL，置于暗室30 min；加入0.2 μg胰蛋白酶（200 U/mgP），混勻，37 ℃過夜；離心真空凍干，C18ziptip除鹽柱除鹽，離心真空凍干，?20 ℃保存。將凍干肽段用20 μL 2%甲醇、0.1%甲酸復(fù)溶。1200 r/min離心10 min，吸取上清上樣。上樣體積10 μL，采取夾心法上樣。Loading Pump流速350 nL/min，15 min。將數(shù)據(jù)與Uniprot-Anacardium occidentale（2019.4.20Download）和NCBI-Anacardium occidentale數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對[32]。

1.2.3.2 圓二色譜（CD）測定腰果過敏蛋白二級結(jié)構(gòu)

首先樣品池中不放任何物體，采集背景；后取腰果目的蛋白，分別注入比色皿，置樣品池中，按照帶寬0.5 nm、步進(jìn)1.0 nm、波長范圍180~260 nm、Timeper-Point 0.5 s、采集三次數(shù)據(jù)。

1.2.3.3 生物信息軟件分析預(yù)測 通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢過敏原序列與質(zhì)譜測序進(jìn)行比較（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAN76862.1?report=genpe pt）。通過DNAstar中的Protean程序預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)與圓二色譜測定的蛋白結(jié)構(gòu)比對分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2007統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，計算誤差并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腰果蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用BCA試劑盒微孔酶標(biāo)法測定蛋白濃度，如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.7343x?0.1009，R2=0.999，方程線性良好。

圖1 BCA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 BCA protein standard curve

2.2 Sephadex G-150葡聚糖凝膠純化蛋白

腰果蛋白溶液經(jīng)脫脂、鹽析透析處理后采用Sephadex G-150 葡聚糖凝膠柱進(jìn)行純化，用紫外分光光度計檢測蛋白含量，根據(jù)吸收光譜最大吸收峰波長的位置或吸收峰形狀和數(shù)量，判斷該物質(zhì)的純度。將過柱純化后的蛋白液體每30 s收集一管，依次編號，在 280 nm 波長下檢測紫外吸收峰，結(jié)果如圖2所示。

圖2 腰果純化蛋白溶液紫外圖Fig.2 UV image of cashew purified protein solution

如圖2所示，葡聚糖凝膠柱層析純化。根據(jù)郎伯-比爾定律，蛋白溶液在最大吸收波長處的吸光度與濃度成正比。蛋白通過凝膠柱層析純化后收集合并3~5管蛋白液，備用。

2.3 腰果過敏蛋白電泳及免疫印跡鑒定

將葡聚糖凝膠純化后的腰果蛋白收集后采用SDS-PAGE電泳分析蛋白分子量，采用Western-Blotting評價腰果蛋白過敏性。

結(jié)果如圖3~圖4所示，目標(biāo)蛋白在SDS-PAGE電泳圖中呈現(xiàn)四條蛋白聚集條帶和一些彌散性的蛋白條帶，通過Western-Blotting免疫印跡圖譜顯示在33和17 kD出現(xiàn)印跡條帶，分析目標(biāo)蛋白的過敏原組分，可知在33與17 kD與陽性血清有免疫學(xué)反應(yīng)和特異性結(jié)合反應(yīng)，與相關(guān)文獻(xiàn)報道[20]的腰果的過敏蛋白Ana o 2與Ana o 3分子條帶接近，可以初步判斷該蛋白為目標(biāo)天然腰果過敏蛋白Ana o 2與Ana o 3。

圖3 腰果過敏蛋白SDS-PAGE分析圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of allergic protein

圖4 腰果過敏蛋白免疫印跡鑒定圖Fig.4 Western-Blotting identification of allergic protein

2.4 腰果過敏蛋白質(zhì)譜序列分析

如圖5、表1和表2可知，將質(zhì)譜圖所得數(shù)據(jù)與

表1 腰果過敏蛋白Ana o 2匹配肽段Table 1 Sequence analysis of cashew allergy protein Ana o 2

表2 腰果過敏蛋白Ana o 3匹配肽段Table 2 Sequence analysis of cashew allergy protein Ana o 3

圖5 腰果過敏蛋白質(zhì)譜測序分析圖譜Fig.5 Protein profile sequencing analysis of cashew allergy （ESI）

Uniprot-Anacardium occidentale （2019.4.20 Download）和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫NCBI-Anacardium occidentale進(jìn)行比對可知，圖譜總數(shù)為60842，與鑒定肽段所對應(yīng)的蛋白個數(shù)為5，鑒定譜圖所對應(yīng)的肽段去重復(fù)之后的個數(shù)Uniprot-Anacardium occidentale為147，NCBI-Anacardium occidentale為148，其中測得的片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)其中兩個與數(shù)據(jù)庫中Ana o 2與Ana o 3過敏原序列相匹配。通過腰果過敏蛋白質(zhì)譜測序分析再次驗(yàn)證了腰果主要過敏原為Ana o 2與Ana o 3，氨基酸序列共有16條易形成過敏表位。

2.5 腰果過敏原二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是按多肽鏈本身通過氫鍵沿一定方向盤繞、折疊而形成的構(gòu)象。故二級結(jié)構(gòu)不同，則圓二色譜的色譜帶不同，通過圓二色譜區(qū)了解蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。運(yùn)用CD光譜對腰果過敏蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，如圖6為過敏蛋白在180~260 nm范圍的CD圖譜。二級結(jié)構(gòu)特征對抗原表位有很大的影響，通過圓二色譜及DNAstar中的Protean預(yù)測將傳統(tǒng)分析方法與生物信息方法相結(jié)合使得其相互驗(yàn)證，從而提高腰果天然過敏蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測準(zhǔn)確性[32]。

圖6 腰果過敏蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Secondary structure analysis of cashew allergy protein

如圖6所示，運(yùn)用CD光譜對純化后的蛋白溶液進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，在180~260 nm范圍的CD圖譜，從195~260 nm開始ɑ-螺旋從微分區(qū)域0.307降到0.122，β-轉(zhuǎn)角從0.177上升到0.224，無規(guī)則卷曲從0.328上升到0.540，整體趨勢為ɑ-螺旋下降時β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲同時呈上升趨勢，且β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲多位于蛋白質(zhì)表面，鍵能較低，容易與抗體結(jié)合，成為抗原表位的可能性大。其中蛋白表面可及性、柔韌性越多的區(qū)域，則表示其越易折疊，且暴露在表面；而抗原性指數(shù)則代表了其形成表位能力的強(qiáng)弱，抗原指數(shù)高的區(qū)域更可能形成表位。

通過DNAstar中的Protean程序預(yù)測的Ana o 2與Ana o 3過敏原二級結(jié)構(gòu)圖7~圖10可知，利用DNAstar Protean軟件分析腰果主要過敏蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原性：用Garnier-Robson、Chou-Fasman 方法對二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等進(jìn)行預(yù)測；用 Kyte-Doolittle、Eisenberg方法對蛋白的親水性進(jìn)行了預(yù)測；用 Karplus-Schulz方法分析蛋白質(zhì)骨架區(qū)柔韌性，預(yù)測形成表位與抗體結(jié)合的可能性；用Jameson-Wolf方法預(yù)測了腰果過敏蛋白的B細(xì)胞抗原表位；用Emini方法預(yù)測了腰果過敏蛋白的表面可及性。

圖10 Ana o 3親水性、柔韌性、抗原性指數(shù)和表面可及性Fig.10 Ana o 3 hydrophilicity, flexibility, antigenicity index and surface accessibility

一般暴露在過敏原分子外部易成為抗原的構(gòu)象表位，位于疏水性區(qū)域內(nèi)的易形成抗原的線性表位，且蛋白質(zhì)的親水性、表面可及性、柔韌性等在形成抗原方面起著重要作用，當(dāng)親水性>0，抗原指數(shù)>0，表面可及性>1時形成表位的可能性大[31]。從圖7~圖8可以看出，Ana o 2中有10個主要的區(qū)域親水性較好，6個主要的區(qū)域表面可及性好，有 16個區(qū)域的抗原指數(shù)較高，柔韌性區(qū)域分布相對平均。

從圖9~圖10 可以看出，Ana o 3中有3個主要的區(qū)域親水性較好，5個主要的區(qū)域表面可及性好，絕大多數(shù)區(qū)域的抗原指數(shù)較高，柔韌性區(qū)域分布在中間波長50~120 nm部位。

圖9 Ana o 3二級結(jié)構(gòu)分析Fig.9 Ana o 3 secondary structure analysis

綜合分析Ana o 2與 Anao3過敏原蛋白骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，該蛋白肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的概率升高，容易與抗體在空間上產(chǎn)生結(jié)合，形成抗原表位的可能性較大。Ana o 2 N-C 端α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊區(qū)段和轉(zhuǎn)角區(qū)域均存在，所以Ana o 2是致敏性較強(qiáng)的一種親水性蛋白。Ana o 3的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，N端有僅有少量的β-折疊區(qū)段和轉(zhuǎn)角區(qū)域，為過敏性較弱的親水性蛋白。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離純化腰果過敏蛋白并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過SDS-PAGE電泳結(jié)合Western-Blotting免疫印跡獲得腰果主要過敏蛋白Ana o 2與Ana o 3，其分子量為33與17 kD左右。應(yīng)用Uniprot-Anacardium occidentale質(zhì)譜分析所得數(shù)據(jù)與和NCBIAnacardium occidentale數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可知圖譜總數(shù)為60842，與鑒定肽段所對應(yīng)的蛋白個數(shù)為5，鑒定譜圖所對應(yīng)的肽段數(shù)Uniprot-Anacardium occidentale為147，NCBI-Anacardium occidentale為148。圓二色譜結(jié)果與DNAstar中的Protean程序預(yù)測可知，Ana o 2α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊區(qū)段和轉(zhuǎn)角區(qū)域均存在，是致敏性較強(qiáng)的一種親水性蛋白，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲在Ana o 2氨基酸序列中出現(xiàn)率總和54%，所在區(qū)域?yàn)閮?yōu)勢抗原表位區(qū)。Ana o 3 N 端有僅有少量的β-折疊區(qū)段和轉(zhuǎn)角區(qū)域，出現(xiàn)率總和12%，Ana o 3的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，也為親水性過敏蛋白，但形成過敏性表位相對弱。本研究為探究腰果主要過敏原的分子結(jié)構(gòu)和表位預(yù)測提供研究基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步明確天然腰果主要過敏原結(jié)構(gòu)并對探索腰果致敏機(jī)理提供參考。