任媛媛，王 超，謝 勇，郭光鵬，黃勤挽, ，王 瑾,

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611137；2.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川成都 610042；3.吉林省北域紅藥業(yè)有限公司，吉林通化 134000；4.四川利民中藥飲片有限責(zé)任公司，四川成都 611331）

非酒精脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的慢性肝病，世界范圍內(nèi)非酒精脂肪肝的發(fā)病率和流行率正在迅速上升。非酒精脂肪肝全球患病率約為25%，影響著全球四分之一的成年人[1?2]。非酒精脂肪肝包括一系列疾病，包括單純性脂肪肝（NAFL）或單純性脂肪變性（其病程為良性）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），可進(jìn)展為肝細(xì)胞癌（HCC）和肝硬化[3?6]。非酒精脂肪肝既可以導(dǎo)致肝病殘疾和死亡，還與代謝綜合征、肥胖、Ⅱ型糖尿?。═ype 2 diabetes, T2DM）、心血管疾病及結(jié)直腸腫瘤等的高發(fā)密切相關(guān)[7?8]。藥食同源具有綜合保健治療作用，副作用小，可以調(diào)節(jié)人體生理活動(dòng)、預(yù)防疾病、長(zhǎng)期服用，在醫(yī)療保健和食品行業(yè)廣泛應(yīng)用[9]。因此，探索來(lái)源于食品或藥食同源具有預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝病作用的原輔料十分重要。

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子具有抗炎、抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力及保護(hù)肝臟等作用[10?14]，主要包含木脂素類、三萜類、黃酮類等物質(zhì)[15?16]。五味子是一種藥食兼用型原料，營(yíng)養(yǎng)豐富，對(duì)人體有較好的保健作用，可用于多種產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。如將五味子保護(hù)肝腎的功效與果醋具有的降脂減肥、促進(jìn)新陳代謝、抗菌、抗疲勞等功能結(jié)合生產(chǎn)出的具有保健作用的五味子果醋[17]，具有提高免疫力、改善睡眠等功能的五味子酒[14]，有較強(qiáng)的抗氧化活性石榴五味子復(fù)合保健酒[18]，此外還有五味子飲料產(chǎn)品、五味子酸奶產(chǎn)品及五味子果醬產(chǎn)品等[19?21]。研究表明，五味子保肝護(hù)肝作用明顯[22]，由此，五味子治療非酒精脂肪肝的相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和研究具有重要意義。但是，目前對(duì)五味子治療非酒精脂肪肝的研究較少，尤其在物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究方面。因此，研究五味子活性成分治療非酒精性脂肪肝的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制具十分必要。本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出五味子治療非酒精性脂肪肝的核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)，并應(yīng)用分子對(duì)接驗(yàn)證分析，系統(tǒng)的分析了五味子治療非酒精性脂肪肝的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，以期為尋找治療非酒精性脂肪肝的植物來(lái)源的天然化合物的保健食品開(kāi)發(fā)提供高效篩選的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子甲素（批號(hào)：MUST-19092908，純度為99.35%）、五味子乙素（批號(hào)：MUST-19041810，純度為99.11%）、五味子酯甲（批號(hào)：MUST-19062302，純度為99.38）、五味子醇甲（批號(hào)：MUST-19031905，純度為99.46%） 成都曼思特生物科技有限公司；五味子酯乙（批號(hào)：DST201218-011，純度≥98%）、五味子醇乙（批號(hào)：DST201129-013，純度≥98%）、五味子酚（批號(hào)：DST200825-015，純度≥98%） 成都德思特生物科技有限公司；乙腈、甲酸 色譜級(jí)，Thermo Fisher Scientific；采用屈臣氏蒸餾水制備樣品和流動(dòng)相，其他所有試劑均為分析純；五味子飲片 吉林省北域紅藥業(yè)有限公司，批號(hào)20201206，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)黃勤挽教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥成熟果實(shí)。

Vanquish型超高效液相色譜-Q-Exactive型四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；UPH-I-10T型超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司；FA1204C型1/1萬(wàn)電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；AUW220D型1/10萬(wàn)電子分析天平 日本島津公司；KS-500DE型液晶超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酚、五味子酯甲、五味子酯乙對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為702、376、970、652、516、402、632 mg/L的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取上述儲(chǔ)備液適量，加甲醇混勻，即得混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取五味子樣品（粉碎，過(guò)三號(hào)篩）0.5 g，置25 mL容量瓶中，甲醇定容，超聲波水浴30 min（頻率40 kHz，功率100 W），冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足體積，混勻，過(guò)濾，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3 UPLC-Q-Orbitrap HRMS數(shù)據(jù)采集

1.3.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動(dòng)相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫：0~15 min，5%~30% B；15~30 min，30%~65% B；30~45 min，65%~95% B，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，柱溫30 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式檢測(cè)，全掃描的主分辨率為70000，掃描范圍為m/z=100~1500。噴涂電壓的正模式和負(fù)模式分別設(shè)定為3500 V與3000 V，正模式和負(fù)模式的探針加熱器溫度都設(shè)置為350 ℃，正模式和負(fù)模式的毛細(xì)管溫度均設(shè)置在300 ℃，正模式和負(fù)模式的鞘氣均設(shè)定在35 arb，正模式和負(fù)模式的輔助氣體都設(shè)定在10 arb。S-Lens射頻電平設(shè)置為50。全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（Full MS/dd MS2），一級(jí)分辨率35000，二次分辨率為17500，碰撞能量梯度設(shè)定為20、40和60 eV。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 利用Compound Discoverer3.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行需求和處理[23]。軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊和峰提取，得到分子離子峰，及同位素?cái)M合的可能分子式。并將測(cè)得的二級(jí)光譜片段分別與mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)和mzVault本地中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配。保留化學(xué)成分符合峰面積閾值大于80000，質(zhì)量偏差小于5 ppm，匹配得分大于80。最后，參考對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步確證該化合物[24]。

1.4 構(gòu)建和分析五味子“藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點(diǎn)途徑”交互網(wǎng)絡(luò)

1.4.1 潛在靶點(diǎn)的收集 成分相關(guān)靶點(diǎn)：以UPLCQ-Orbitrap HRMS鑒定出的化學(xué)成分為研究對(duì)象，導(dǎo)入PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得Canonical SMILES。在TCMSP （ http://tcmspw.com/tcmsp.php）與SwissTarget Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）在線平臺(tái)中查找各個(gè)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，得到成分相關(guān)靶點(diǎn)[25]。

疾病相關(guān)靶點(diǎn)：在包括GeneCards (https://www.genecards.org/)，CTD (http://ctdbase.org/)，OMIM(https://www.omim.org/)，Dis-GeNET (https://www.disgenet.org/)，GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

在內(nèi)的五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集相關(guān)的目標(biāo)，得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)[26]。

利用交互式韋恩圖制作平臺(tái)（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）進(jìn)行韋恩分析，繪制成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的Venn圖。重疊的共同靶點(diǎn)可能是五味子治療非酒精脂肪肝的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

所有靶點(diǎn)，無(wú)論是成分靶點(diǎn)還是疾病靶點(diǎn)，都刪除了重復(fù)值和無(wú)效值，然后全部進(jìn)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）校準(zhǔn)靶蛋白和基因信息，它們都是被核對(duì)的人類基因名稱。

1.4.2 活性成分和潛在靶點(diǎn)的篩選 將成分和非酒精性脂肪肝相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化分析。使用“Network Analyzer”插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，按度值（degree）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)排序，并將高于中值（median）的成分作為核心成分。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）分析成分和非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)[27]，并將物種定義為“Homo sapiens”，選擇0.9的高置信度以保證數(shù)據(jù)的可靠性，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)連接的節(jié)點(diǎn)，然后導(dǎo)出結(jié)果。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件對(duì)所建PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，使用“Network Analyzer”插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?，取高于中值的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)[28]。

1.4.3 富集分析和通路分析 利用R 4.3.0對(duì)選擇的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。選取P<0.05的相關(guān)結(jié)果，對(duì)前20個(gè)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4.4 “藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點(diǎn)途徑”網(wǎng)絡(luò)模構(gòu)建

基于核心成分與蛋白靶點(diǎn)的關(guān)系及蛋白靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，利用Cystocape軟件進(jìn)行可視化，得到五味子治療非酒精脂肪肝的“藥物-核心活性成分-靶點(diǎn)-部分通路”網(wǎng)絡(luò)模型圖。

1.5 分子對(duì)接

為了驗(yàn)證篩選出的化合物和靶標(biāo)的有效性，對(duì)前5個(gè)活性化合物和前4個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對(duì)接。臨床上療效肯定的降脂藥非諾貝特作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)PubChem ( https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分的2D結(jié)構(gòu)，利用Chem3D 19.0軟件將其轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行能量最小化操作，以mol2格式保存。4個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白均取自RCSB PDB（https://www1.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，來(lái)源設(shè)置為人類，晶體選擇信息（Resolution、PDB ID）詳見(jiàn)表 3，以此獲得靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，以pdb格式保存。利用PyMOL 4.6.0軟件對(duì)蛋白進(jìn)行去除水分子、去殘基等操作，使用spdbv 4.1.0軟件使蛋白能量最小化。然后使用AutoDock Tools 1.5.6軟件對(duì)蛋白（受體）和成分（配體）進(jìn)行加氫和加電荷處理，并轉(zhuǎn)換為pdbqt格式。接著在AutoDock Tools中設(shè)置對(duì)接的網(wǎng)格點(diǎn)和尺寸，使對(duì)接盒子（grid box）包裹整個(gè)蛋白。再利用AutoDock Tools中AutoDock Vina進(jìn)行半柔性分子對(duì)接，分別預(yù)測(cè)了化合物的9種不同的模式（modes）并以pdbqt格式保存。具有最高結(jié)合親和力并與受體具有相應(yīng)相互作用的模式被保存并在PyMOL中可視化[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-Q-Orbitrap HRMS鑒定五味子的化學(xué)成分

利用Compound Discoverer 3.0軟件計(jì)算出在5 ppm質(zhì)量偏差范圍內(nèi)的分子式，然后結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)mzCloud和mzVault數(shù)據(jù)庫(kù)，以及參考文獻(xiàn)[30?37]，對(duì)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間（tR）和碎片離子信息進(jìn)行識(shí)別，結(jié)果初步鑒定出了50個(gè)化學(xué)成分，其中包含11個(gè)木脂素類成分，9個(gè)黃酮類成分，9個(gè)氨基酸類成分，7個(gè)有機(jī)酸類成分，3個(gè)核苷類成分，7個(gè)酚酸類成分，和4個(gè)其它成分。其中，經(jīng)對(duì)照品鑒定了7個(gè)木脂素類成分，分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酚、五味子酯甲及五味子酯乙，且在樣品中相應(yīng)峰的響應(yīng)值較高。結(jié)果表明，樣品中的所含的木脂素類成分的種類最多?？傠x子流圖（Total ion chromatogram，TIC）見(jiàn)圖1，鑒定的化合物的最終結(jié)果如表1所示。

表1 五味子化學(xué)成分的UPLC-Q-Orbitrap HRMS鑒定Table 1 Identified compounds of SC by UHPLC-Q-Orbitrap HRMS

2.2 五味子關(guān)鍵活性化合物及治療非酒精性脂肪肝潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

通過(guò)聯(lián)合使用多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，在刪除重復(fù)和無(wú)效目標(biāo)后，共獲得747個(gè)成分靶點(diǎn)和2178個(gè)非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點(diǎn)。Venn圖發(fā)現(xiàn)有246個(gè)相交靶點(diǎn)（圖2），說(shuō)明五味子具有治療非酒精性脂肪肝的作用。在成分-非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中（圖3），有295個(gè)節(jié)點(diǎn)和880個(gè)邊與五味子的49個(gè)化合物相關(guān)，246個(gè)靶點(diǎn)與非酒精性脂肪肝相關(guān)。度值（Degree）越大說(shuō)明相連節(jié)點(diǎn)越多，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控作用也就越大。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?，將高于中值的化合物視為核心活性成分，共鑒定出23個(gè)化合物，按度值由大到小分別為：槲皮素、山柰酚、五味子甲素、α-亞麻酸、五味子醇乙、五味子酯乙、戈米辛J、當(dāng)歸酰戈米辛H、戈米辛G、五味子酯甲、五味子醇甲、小檗堿、原花青素B1、原花青素B2、奎尼酸、腺苷、蘆丁、苯丙氨酸、天冬氨酸、富馬酸、對(duì)香豆酸、表兒茶素和原兒茶酸。其中，槲皮素的度值最大，且中間中心性（Betweenness centrality）和接近中心性（Closeness centrality）也最大，平均最短路徑長(zhǎng)度（Average shortest path length）也很小，說(shuō)明這個(gè)化合物在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中非常重要。

圖2 五味子治療非酒精性脂肪肝潛在靶點(diǎn)的韋恩分析Fig.2 Venn’s analysis of potential targets for the treatment of the NAFLD with SC

圖3 化合物和非酒精性脂肪肝相交靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The network of compounds and NAFLD intersection targets

續(xù)表 1

將246個(gè)相交靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。選擇物種為智人（Homo sapiens），設(shè)置目標(biāo)之間所需的最低連接分?jǐn)?shù)為0.9，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)的節(jié)點(diǎn),構(gòu)建一個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化分析，顯示217個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯罱K的分析結(jié)果顯示，22個(gè)靶點(diǎn)的度值高于中值14（圖4）。此外，根據(jù)度值由大到小，發(fā)現(xiàn)前12個(gè)靶點(diǎn)之間存在相對(duì)復(fù)雜的關(guān)系。除了SRC、PI3KR1、EGFR、VEGFA、TP53和ESR1外，其他目標(biāo)AKT1、HSP90AA1、PIK3CA、MAPK1、MAPK3和JUN的中介中心度（Betweenness centrality）和接近中心度（Closeness centrality）都排名靠前，表明這些靶點(diǎn)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。將成分-非酒精性脂肪肝靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析度值前10的靶點(diǎn)與PPI靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析篩選的前10個(gè)靶點(diǎn)相交，得到2個(gè)靶標(biāo)，即為SRC和EGFR，這意味著這2個(gè)靶點(diǎn)可能起著非常關(guān)鍵的作用。

圖4 五味子治療非酒精性脂肪肝相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Protein-protein interaction network of potential targets for SC treatment of NAFLD

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析

將化合物和非酒精性脂肪肝相交靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中度值前10的靶點(diǎn)和PPI網(wǎng)絡(luò)中度值高于中值的22個(gè)靶點(diǎn)，共30個(gè)靶點(diǎn)（表2）作為核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析分析。通過(guò)GO富集分析，共獲得935個(gè)生物過(guò)程（Biological process，BP）條目，主要涉及蛋白激酶B信號(hào)的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路和T細(xì)胞共刺激等方面；50個(gè)細(xì)胞組成（Cell composition，CC）條目，膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔和膜區(qū)的占比較大；54個(gè)分子功能項(xiàng)（Molecular function，MF），其中磷酸酶結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性及磷蛋白結(jié)合等較為顯著。KEGG通路富集分析共鑒定出119個(gè)結(jié)果，主要涉及癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）、Rap1信號(hào)通路（Rap1 signaling pathway）、VEGF信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）和雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）等。研究組將前20個(gè)結(jié)果可視化，見(jiàn)圖5。氣泡越大，富含的基因越多。P調(diào)整值越小，氣泡的顏色越紅。

圖5 五味子治療非酒精性脂肪肝核心靶點(diǎn)的GO富集和KEGG通路分析Fig.5 GO enrichment and KEGG pathway analysis of SC treatment of NAFLD core targets

表2 五味子治療非酒精性脂肪肝的核心靶點(diǎn)Table 2 Key target of SC for the treatment of NAFLD

為了更好地展示藥材、活性成分、靶點(diǎn)和途徑之間的關(guān)系，根據(jù)藥物、成分、潛在靶點(diǎn)及信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，選取鑒定出的23個(gè)核心活性成分與五味子治療非酒精性脂肪肝潛在靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，將核心靶點(diǎn)的前4名AKT1、HSP90AA1、SRC和MAPK1與關(guān)鍵信號(hào)通路的前20條進(jìn)行匹配，共匹配得到14條信號(hào)通路。使用Cytoscape構(gòu)建“藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點(diǎn)-部分途徑”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6。

圖6 五味子治療非酒精性脂肪肝的“藥物-關(guān)鍵活性成分-靶點(diǎn)-部分途徑”網(wǎng)絡(luò)模型Fig.6 Herb-core active component-target-partial pathway network of SC for the treatment of NAFLD

2.4 分子對(duì)接

為了表征非酒精性脂肪肝相關(guān)蛋白與五味子活性成分的分子相互作用和結(jié)合親和力，本文使用AutoDock Tools中的AutoDock Vina將篩選出的前5個(gè)活性成分及非諾貝特分別與PPI網(wǎng)絡(luò)中前4的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接（圖7，表3）。一般認(rèn)為若結(jié)合能<0，表明配體分子能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合，若結(jié)合能≤?5.0 kcal/mol，表明其結(jié)合性好。結(jié)合能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定?；衔镩纹に睾偷鞍譙RC的MET344、GLU342、ASP407、LYS298和GLU313形成氫鍵，結(jié)合能為-10.1 kcal/mol，如圖7A所示。山柰酚和蛋白SRC的GLU342和MET344形成氫鍵，結(jié)合能為-10.0 kcal/mol，如圖7B所示。五味子甲素與蛋白HSP90AA1的LYS58 形成氫鍵，結(jié)合能為-7.2 kcal/mol，如圖7C所示。α-亞麻酸和蛋白HSP90AA1的SGLY135、PHE138和ASN51形成氫鍵，結(jié)合能為-7.4 kcal/mol，如圖7D所示。五味子醇乙和蛋白MAPK1的LYS151、THR190、TYR36形成氫鍵，結(jié)合能為-6.5 kcal/mol，如圖7E所示。非諾貝特和蛋白HSP90AA1的TRP162和ASN51形成氫鍵，結(jié)合能為-8.7 kcal/mol，如圖7F所示。此外，上述活性化合物與相關(guān)蛋白結(jié)合至少形成了一個(gè)氫鍵相互作用力。結(jié)果表明，上述5個(gè)活性成分及非諾貝特與目標(biāo)蛋白之間均有穩(wěn)定的結(jié)合（結(jié)合能<-5.0 kcal/mol）。

表3 分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results

圖7 部分分子對(duì)接結(jié)果Fig.7 Partial results of molecular docking

3 討論與結(jié)論

非酒精脂肪肝與肝臟脂肪細(xì)胞過(guò)度堆積及炎癥等有著緊密的關(guān)聯(lián)[38]，是全球最嚴(yán)重的代謝疾病之一[39]，對(duì)眾多患者的生活質(zhì)量與生命安全產(chǎn)生影響。目前對(duì)于非酒精脂肪肝的發(fā)病機(jī)制尚未清晰，醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)可“二次打擊學(xué)說(shuō)”，即以胰島素抵抗（Insulin resistance, IR）為主要環(huán)節(jié)的“第一次打擊”和以肝細(xì)胞大量凋亡、氧化應(yīng)激和纖維化為主的“二次打擊”[40]?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子可以保護(hù)肝臟，明顯改善肝纖維化等[41]。因此，研究五味子治療非酒精性脂肪肝的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為尋找治療非酒精性脂肪肝的植物來(lái)源的天然化合物的保健食品和治療藥物開(kāi)發(fā)提供高效篩選的方法具有重要意義。

為此，本研究利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)從五味子中共鑒定了50個(gè)成分，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理分析，最終得到23種主要活性成分。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)其中的一些成分可以通過(guò)脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)途徑等對(duì)非酒精脂肪肝發(fā)揮保護(hù)或治療作用[42?44]。例如，在高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的非酒精脂肪肝的小鼠模型中，五味子甲素可以通過(guò)降低肝臟中脂肪酸和甘油三酯合成酶的活性來(lái)降低高脂飲食小鼠血漿和肝臟中FFA和甘油三酯的含量。同時(shí)增加肝臟脂肪酸氧化和糞便游離脂肪酸和甘油三酯排泄。并且，這些對(duì)肝臟的有益作用也與五味子甲素改善氧化應(yīng)激有關(guān)[45]。在非酒精脂肪肝細(xì)胞模型中，五味子乙素可以劑量依賴性抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的激活，進(jìn)而影響脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)，從而降低脂質(zhì)堆積[40]。在T2DM誘導(dǎo)非酒精脂肪肝小鼠模型中，槲皮素治療可以明顯緩解Lepdb/Lepdb小鼠的肝腫脹，恢復(fù)異常的肝酶，降低肝臟中的高血糖和脂質(zhì)積累。進(jìn)一步研究表明，槲皮素治療可通過(guò)抗氧化、抗炎和激活FXR1/TGR5信號(hào)通路改善TD2M誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝[46]。

同時(shí)，本文通過(guò)分析藥物相關(guān)靶點(diǎn)和非酒精脂肪肝相關(guān)靶點(diǎn)，確定了246個(gè)交叉靶點(diǎn)。去除29個(gè)自由靶標(biāo)后，以217個(gè)相交靶標(biāo)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，從中識(shí)別出22個(gè)核心靶標(biāo)，將它們與成分-非酒精性脂肪肝靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析篩選的前10個(gè)靶點(diǎn)相交共得到30個(gè)靶點(diǎn)，其中重復(fù)的SRC和EGFR可能起著非常關(guān)鍵的作用，它們或多或少被認(rèn)為會(huì)影響非酒精脂肪肝。例如，研究表明，SRC通路的激活，增加了IP3R1蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)了IP3R1的Tyr353磷酸化，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體Ca2+超載和線粒體功能障礙。因此，抑制SRC/IP3R1通路，可能是一種新的潛在的治療非酒精脂肪肝的方法[47]。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是肝細(xì)胞增殖和肝再生的重要調(diào)節(jié)因子。EGFR還可以調(diào)節(jié)肝部分切除術(shù)后肝再生過(guò)程中的脂質(zhì)代謝，抑制EGFR也可以改善已經(jīng)發(fā)展的纖維化[48?49]。同時(shí)，研究表明，在非酒精脂肪肝小鼠模型中，抑制EGFR可顯著降低脂肪變性、肝損傷、肝纖維化，改善糖耐量。表明了EGFR在非酒精脂肪肝中的作用，以及EGFR抑制作為非酒精脂肪肝治療策略的潛力[50]。此外，MAPK1是炎癥評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。VEGFA是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、增殖和血管形成等作用，參與了非酒精脂肪肝的病理生理過(guò)程[51]。

為了進(jìn)一步探索五味子的作用機(jī)制，本文對(duì)選擇的30個(gè)潛在核心靶點(diǎn)進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果表明，五味子的有效成分主要影響了蛋白激酶B信號(hào)的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路和T細(xì)胞共刺激等方面。KEGG通路富集分析表明，五味子主要參與癌癥中的蛋白聚糖、內(nèi)分泌抵抗、Rap1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路等。既往研究表明，非酒精脂肪肝的發(fā)展與內(nèi)分泌，血管新生和糖尿病并發(fā)癥中的信號(hào)通路密切相關(guān)[51?54]。

本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)共鑒定出五味子中的50種成分，其中包含11個(gè)木脂素類成分，9個(gè)黃酮類成分，9個(gè)氨基酸類成分，7個(gè)有機(jī)酸類成分，3個(gè)核苷類成分，7個(gè)酚酸類成分，和4個(gè)其它成分。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，確定了23個(gè)潛在的關(guān)鍵活性成分和30個(gè)潛在靶點(diǎn)，這23個(gè)核心活性成分可能主要通過(guò)作用于脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)途徑等來(lái)改善非酒精脂肪肝的癥狀。進(jìn)一步分析表明，五味子可能通過(guò)影響內(nèi)分泌、血管新生和糖尿病并發(fā)癥中的信號(hào)通路影響非酒精脂肪肝，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，五味子可能通過(guò)多成分多靶點(diǎn)的方式影響非酒精性脂肪肝的病理生理過(guò)程。該研究為進(jìn)一步研究五味子治療非酒精性脂肪肝提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。