杜椅楠，閻佳楠，王昱喬，姜昕昱，許詩琦，吳海濤,2,

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧大連 116034）

大黃魚是我國近海主要經(jīng)濟魚類，其因味道鮮美，營養(yǎng)豐富而深受廣大消費者喜愛。2020年，我國大黃魚產(chǎn)量高達25.4萬噸。目前，大黃魚的主要加工方式是鮮食或加工成魚罐頭等，魚卵約占魚體總質(zhì)量的15%~20%[1]，加工過程中，大黃魚卵大多作為副產(chǎn)物被丟棄或制備成低值飼料，而魚卵中蛋白含量豐富，這就造成了嚴重的資源浪費。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過鹽溶法可以從大黃魚卵中獲得分離蛋白。經(jīng)鑒定，分離蛋白的主要組成為卵黃蛋白原、卵黃蛋白原B和卵黃蛋白原C，且其具有良好的持水特性[2]。因此，進一步研究大黃魚卵分離蛋白的凝膠特性對大黃魚的高值化利用具有重要意義。

近年來，有關蛋白質(zhì)凝膠特性的研究日益增多。凝膠特性是蛋白質(zhì)的重要特性之一，在食品工業(yè)中，蛋白質(zhì)的凝膠化會影響產(chǎn)品的感官特性，尤其是產(chǎn)品質(zhì)地，因此適當添加具有凝膠能力的蛋白質(zhì)可以改善食品品質(zhì)[3]。研究顯示，大豆蛋白[4]、花生蛋白[4]、乳清蛋白[5]、豬肉[6]、雞肉[7]、魚類肌原纖維蛋白[8]、雞蛋蛋白[9]等均具有良好的凝膠特性。LI等[10]研究發(fā)現(xiàn)從大黃魚（Pseudosciaena crocea）肌肉中獲取的肌原纖維蛋白表現(xiàn)出較好的凝膠特性。然而，關于大黃魚卵分離蛋白凝膠特性的研究，還未見報道。

因此，本研究以大黃魚卵分離蛋白為研究對象，利用熱誘導凝膠化的方法制備大黃魚卵分離蛋白凝膠，并對其成膠條件和凝膠特性進行研究，以期為進一步開發(fā)利用大黃魚卵奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚卵 山東青島魚姐有限公司，經(jīng)勻漿、冷凍干燥后獲得均勻的大黃魚卵凍干粉，于?30 ℃冷凍保存；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Discovery HR-1流變儀 美國TA公司；Meso-MR23-060V-1核磁共振成像分析儀 上海紐邁公司；Hitachi冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本株式會社日立制作所；PP3010T cryo-SEM掃描電鏡冷凍傳輸系統(tǒng) 英國Quorum科技公司；PHS-3精密pH計

上海雷磁儀器公司；Frontier紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃魚卵分離蛋白的制備 參照前期的研究方法制備大黃魚卵分離蛋白[2]。取10 g大黃魚卵凍干粉，按照1:10（w/v）的料液比加入0.6 mol/L的NaCl溶液，攪拌浸提2 h，離心（8000 r/min，15 min）后除去上層油脂并收集中間層清液。剩余固體物質(zhì)再按照1:10（w/v）的料液比加入相同溶液攪拌浸提1 h后再次離心，混合兩次離心以后的中間層清液。將溶液于4 ℃條件下用去離子水透析除鹽72 h后凍干，即得大黃魚卵分離蛋白。

1.2.2 大黃魚卵分離蛋白最低凝膠濃度的確定 制備濃度為50、75和100 mg/mL的大黃魚卵分離蛋白溶液，并用0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至9.0，將溶液置于85 ℃水浴中加熱20 min，于室溫下放置12 h穩(wěn)定凝膠后測定其流變特性。

1.2.3 大黃魚卵分離蛋白凝膠的制備 參照DàVILA等[11]的方法制備大黃魚卵分離蛋白凝膠。首先制備濃度為100 mg/mL的大黃魚卵分離蛋白溶液，并用0.5 mol/L的HCl溶液或0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，后將溶液置于85 ℃水浴中加熱20 min使其凝膠化制得大黃魚卵分離蛋白凝膠，在進行其他實驗前將大黃魚卵分離蛋白凝膠于室溫下放置12 h使其穩(wěn)定。

1.2.4 大黃魚卵分離蛋白凝膠的特性分析

1.2.4.1 流變特性 參照YAN等[12]的方法進行測定。用流變儀對不同pH條件下制備的大黃魚卵分離蛋白凝膠的流變特性進行分析。測試參數(shù)為：40 mm的平行板夾具，溫度：25 ℃，進行頻率掃描模式的測量，掃描范圍分別為：頻率：0.1~10 Hz，應變：0.3%。此外還探究了溫度對大黃魚卵分離蛋白凝膠的影響，將樣品直接放置于流變儀上，測試參數(shù)設置為：40 mm的平行板夾具，溫度范圍：4~80 ℃，升溫/降溫速率：4 ℃/min，保留時間：3 min，頻率：1 Hz，應變：0.3%，進行溫度掃描模式的測量。所設應變值在蛋白凝膠的線性黏彈區(qū)內(nèi)。

1.2.4.2 大黃魚卵分離蛋白凝膠中的水分分布測定

參照YAN等[13]的方法進行測定。將2 g凝膠樣

品放入特定塑料管中，并插入核磁共振成像分析儀的樣品床中，設定參數(shù)分別為：τ值：100，回波NECH的數(shù)量：5000，TW：3000 ms，掃描之間的重復時間：8 s。每個樣品至少重復測定三次并通過MultiExp Inv分析軟件擬合Carr-Purcell-Meiboom-Gill衰變曲線的NMR T2數(shù)據(jù)分布。

1.2.4.3 掃描電鏡（SEM）測定 將不同處理的凝膠樣品用液氮淬斷，在Hitachi冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡下放大5000倍，觀察凝膠截面的微觀形態(tài)。每組不同部位重復掃描3次。

1.2.4.4 紅外光譜測定 將1 mg凝膠凍干粉與100 mg干燥的溴化鉀粉末混勻，研磨并壓制成薄盤。通過紅外光譜儀記錄樣品在4000~400 cm?1之間的紅外光譜，并使用OMNIC 8.2軟件分析光譜中的峰值信號。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均進行3次重復試驗，進行平均值計算，利用Origin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚卵分離蛋白的最低凝膠濃度

采用流變儀對不同濃度制備的大黃魚卵分離蛋白的流變特性進行分析。由圖1可知，隨著分離蛋白濃度的增加，凝膠的儲能模量（G’）和損耗模量（G”）都增加，表明凝膠的黏性和彈性都與濃度呈現(xiàn)出一定的依賴關系。且在75及100 mg/mL的濃度條件下，G’和G”平行且與頻率之間呈現(xiàn)出線性相關關系，這是一種典型的凝膠頻率掃描結(jié)果[14]。此外，在50 mg/mL的濃度條件下，樣品的tanδ不穩(wěn)定，而75、100 mg/mL條件下制得的樣品其tanδ分別穩(wěn)定在0.50和0.14左右，表明75 mg/mL的樣品相對黏性較強，因而呈現(xiàn)出一定的流動狀態(tài)，而在100 mg/mL濃度條件下凝膠的tanδ值較小，表明凝膠形成更為緊密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，使得蛋白熱誘導凝膠傾向于固體，更有彈性。因此，這些結(jié)果表明本實驗探究的大黃魚卵分離蛋白最低凝膠濃度是100 mg/mL。

圖1 不同濃度下大黃魚卵分離蛋白凝膠的頻率掃描Fig.1 The frequency sweep of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels at different concentration

2.2 大黃魚卵分離蛋白凝膠的流變特性分析

在大黃魚卵分離蛋白濃度為100 mg/mL的條件下，分離蛋白在pH4.0~6.0的條件下無法形成凝膠，呈現(xiàn)流動狀態(tài)，在pH7.0~9.0的條件下可以形成凝膠，結(jié)果如圖2所示。因此進一步探究pH對大黃魚卵分離蛋白凝膠特性的影響。

圖2 不同pH下大黃魚卵分離蛋白的外觀形態(tài)Fig.2 The visual appearance of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolates at different pH

流變特性是膠體的重要特性之一，可以用來表現(xiàn)流體的彈性特征和黏性特征[15?16]。圖3a是不同pH條件下制備的大黃魚卵分離蛋白凝膠的儲能模量（G’）和損耗模量（G”）與振蕩頻率關系的實驗結(jié)果。在pH8.0條件下制得的蛋白質(zhì)凝膠的儲能模量和損耗模量均高于其他pH條件下制得的分離蛋白凝膠。這主要是由于大黃魚卵分離蛋白的等電點約為pH6.0左右，溶液的pH增加會促進蛋白質(zhì)的溶解度，從而改善凝膠性質(zhì)[17]。但是，當溶液的pH較高時，會產(chǎn)生更多的負電荷，這會影響蛋白質(zhì)分子之間的靜電相互作用，而靜電相互作用是形成凝膠的主要動力[18]。所以大黃魚卵分離蛋白的黏性和彈性隨著pH的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。

圖3 不同pH下大黃魚卵分離蛋白凝膠的頻率掃描（a）和溫度掃描（b）Fig.3 The frequency sweep（a） and temperature sweep（b） of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels prepared at different pH

溫度掃描進一步評估了溫度變化對大黃魚卵分離蛋白凝膠流變特性的影響。如圖3b所示，在加熱過程中，大黃魚卵分離蛋白凝膠的儲能模量均有所下降，但是在冷卻后能夠再次升高，甚至高于初始的模量強度，除了在pH9.0條件下制備的大黃魚卵分離蛋白凝膠在經(jīng)過加熱冷卻后的儲能模量稍低于初始狀態(tài)。這是由于隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)凝膠體系的黏度降低，流動性增大，蛋白質(zhì)分子間的相互作用減弱，其儲能模量隨之降低，但是一直維持在100 Pa以上，隨后隨著溫度的下降，蛋白質(zhì)分子間相互作用逐漸增強，使其能夠恢復到初始的凝膠狀態(tài)。此外，在pH8.0條件下制備的大黃魚卵分離蛋白凝膠的儲能模量明顯高于在其他pH條件下制備的分離蛋白凝膠，這與頻率掃描的結(jié)果相一致。RENKEMA等[19]發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白凝膠的儲能模量也在加熱過程中下降，在冷卻后會再次增加。這些結(jié)果表明，大黃魚卵分離蛋白凝膠在加熱和冷卻條件下是比較穩(wěn)定的，可應用于某些需要加熱制備的食品中以改善其凝膠特性。

2.3 大黃魚卵分離蛋白凝膠的水分分布

低場核磁共振技術已被廣泛應用于肉制品、果蔬等食品領域的檢測，可以無損高效的檢測產(chǎn)品的水分狀態(tài)及含量[20?21]。從大黃魚卵分離蛋白凝膠的弛豫時間圖譜(圖4)可以看出，大黃魚卵分離蛋白凝膠的T2在0.01~10000 ms范圍內(nèi)只有一個峰，出現(xiàn)于100~1000 ms之間，代表自由水[13]。進一步通過在8000 r/min離心10 min的方法檢測其持水性，結(jié)果表明，在pH7.0條件下制得的凝膠持水力為（94.1%±0.4%），而在pH8.0和pH9.0條件下制得的凝膠經(jīng)過離心后無水分析出，持水力接近100%，該結(jié)果表明

圖4 不同pH下大黃魚卵分離蛋白凝膠的弛豫時間T2Fig.4 The relaxation time（T2） of of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels prepared at different pH

盡管樣品中含有的水分組成主要為自由水，但蛋白凝膠仍具有較好的持水能力，這可能主要是由于蛋白質(zhì)通過凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)而截留了較多的水分子。此外，隨著pH的增加，大黃魚卵分離蛋白凝膠的弛豫時間曲線向左偏移，表明分離蛋白凝膠與水的結(jié)合力增加。這一結(jié)果與LI等[22]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加，熱誘導制備的雞蛋清蛋白凝膠的弛豫時間曲線也呈現(xiàn)向左偏移的趨勢。前期研究表明，大黃魚卵分離蛋白的等電點約為pH6.0，在溶液的pH逐漸遠離等電點時，蛋白質(zhì)具有更大的溶解性，且在pH7.0~9.0的條件下，蛋白質(zhì)溶解度為86.9%~97.4%[2]。因此，隨著成膠pH的增大，蛋白質(zhì)溶解度增加可能會促進了更多的水分子與蛋白質(zhì)結(jié)合。此外，pH的上升增加了蛋白質(zhì)攜帶的凈電荷數(shù)量，促進蛋白質(zhì)之間形成了更加致密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，從而增強了凝膠的保水能力[17]。

2.4 大黃魚卵分離蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

冷場掃描電鏡因其可以直觀地顯示蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)而被廣泛用于研究蛋白質(zhì)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)[23?24]。如圖5所示，大黃魚卵分離蛋白經(jīng)熱誘導后可以形成具有連續(xù)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的凝膠。在pH7.0條件下制備的分離蛋白凝膠表面相對粗糙，出現(xiàn)斷裂，但是在pH8.0和pH9.0條件下制備的凝膠具有更加光滑的表面，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更加連續(xù)。這主要是由于pH可以影響蛋白質(zhì)的溶解度并改變蛋白質(zhì)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。此外，大黃魚卵分離蛋白凝膠結(jié)構(gòu)在較高pH條件下更加細化緊致，對水分流動的阻滯能力更強，因而持水力更強，這與持水力的結(jié)果一致。熱誘導的羊肌原纖維蛋白[25]、乳清蛋白和大豆蛋白的混合物[26]、血漿蛋白和雞肉肌原纖維的混合蛋白[27]凝膠也表現(xiàn)出與本研究相似的多孔結(jié)構(gòu)。ZHANG等[28]也發(fā)現(xiàn)，pH的增加會導致雞肉肌原纖維蛋白凝膠形成更加有序、多孔的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明在堿性條件下制備的大黃魚卵分離蛋白凝膠結(jié)構(gòu)更加連續(xù)，這也可能是其能夠保留更多自由水的原因。

圖5 pH對大黃魚卵分離蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 The effect of pH on the microstructures of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels

2.5 大黃魚卵分離蛋白凝膠的紅外光譜

紅外光譜可以進一步用來探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變及其特征基團的變化[29]。如圖6所示，大黃魚卵分離蛋白紅外光譜特征峰出現(xiàn)于1531 cm?1（酰胺II帶），1657 cm?1（酰胺I帶）和3293 cm?1（酰胺A帶）。與大黃魚卵分離蛋白凍干粉的紅外光譜相比，在不同pH下制備的分離蛋白凝膠光譜中特征峰的位置沒有明顯變化，表明溶液的pH改變對分離蛋白的特征基團沒有明顯的作用。SONG等[30]的研究也發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的FTIR譜圖中特征峰位置與其熱誘導凝膠之間沒有明顯差異。

圖6 不同pH下大黃魚卵分離蛋白凝膠的紅外光譜Fig.6 The FTIR spectra of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels prepared at different pH

3 結(jié)論

本文研究了pH對大黃魚卵分離蛋白凝膠特性的影響，結(jié)果表明，大黃魚卵分離蛋白在pH4.0~6.0的條件下無法形成凝膠，在pH7.0~9.0的條件下可以形成熱誘導凝膠，且分離蛋白最低成膠濃度為100 mg/mL，在pH8.0條件下制備的分離蛋白凝膠具有最大的儲能模量G’。此外隨著成膠pH的增加，蛋白凝膠具有更高的持水能力和更加致密均勻的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。因此，后續(xù)研究將圍繞大黃魚卵分離蛋白的成膠機制及其在食品加工中的應用進行深入探討。