王育嫻 李淑婷 陳斯佳 羅叢偉 龍海波 彭芬芬

腹膜透析因其具有保護(hù)殘余腎功能等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于終末期腎病患者[1]。腹膜纖維化是導(dǎo)致腹膜超濾衰竭的主要原因之一[2],目前認(rèn)為,腹膜纖維化的核心機(jī)制是腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(MMT)[2]。最初在人胚胎初級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的異黏蛋白metadherin(Mtdh),又名星形細(xì)胞上調(diào)基因1(AEG-1)與腫瘤進(jìn)展和遷移關(guān)系密切[3]。研究發(fā)現(xiàn)Mtdh在糖尿病腎病模型[4-5]、單側(cè)輸尿管梗阻模型[6]的腎臟中高表達(dá),參與腎臟纖維化[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)Mtdh參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬水平[7-10]。因此,我們推測(cè)Mtdh有可能通過(guò)調(diào)控自噬參與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展。

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB) 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制血管緊張素Ⅱ與血管緊張素受體Ⅰ結(jié)合,阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)[11]。已證實(shí)ARB可緩解腎臟纖維化[12-13]、肝纖維化[14]和腹膜纖維化[15],但其對(duì)Mtdh的影響以及與自噬的關(guān)系尚不明確。因此,我們采用4.25%葡萄糖腹膜透析液小鼠腹膜纖維化模型和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的細(xì)胞MMT模型,探究替米沙坦對(duì)Mtdh表達(dá)和自噬的影響,為腹膜纖維化的防治提供新依據(jù)。

材料和方法

主要材料

試劑 4.25%葡萄糖腹膜透析液(中國(guó)百特);抗小鼠β-actin抗體(EarthOx)、抗兔纖維連接蛋白(Fib)抗體、抗兔Mtdh抗體(Abcam)、抗小鼠E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(BD)、抗兔Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)(博士德)、抗兔微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3A/B)抗體(CST);抗兔TGF-β1抗體(abcam);重組人TGF-β1細(xì)胞因子(R&D);鼠兔通用免疫組化試劑盒(DAKO);Masson染色試劑盒(廣州浩碼生物); lipofectamineTM2000(Invitrogen);胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12(Gibco),Mtdh siRNA序列由吉瑪公司合成:(正義鏈5'-GCUCUUCCAACUGGGAAAUTT-3', 反義鏈5'-AUUUCCCAGUUGGAAGAGCTT-3')。

小鼠腹膜纖維化動(dòng)物模型建立 SPF級(jí)8～10周齡C57BL/6J同窩小鼠18只(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心),按隨機(jī)分為3組(n=6,雌雄各3只),即對(duì)照組,模型組(采用4.25 %葡萄糖腹膜透析液腹腔注射,3 ml/只)和替米沙坦干預(yù)組[4.25 %葡萄糖腹膜透析液腹腔注射,然后予替米沙坦10 mg/(kg·d)灌胃]),于28d后收集壁層腹膜和臟層腹膜。

標(biāo)本收集實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠,沿正中開(kāi)腹,將壁層腹膜沿正中十字剪開(kāi),分為4小塊,每塊約1 cm×1 cm,用冷PBS清洗后,立刻放入碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛固定液固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,切成3μm的石蠟切片,進(jìn)行Masson染色和免疫組織化學(xué)染色。臟層腹膜取出后立刻置于液氮里保存?zhèn)溆?用于Western Blot檢測(cè)。

WesternBlot檢測(cè)提取動(dòng)物組織總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白98℃變性10 min,行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉常溫封閉1h,分別加入一抗抗體,β-actin(1∶5 000)、ColⅠ(1∶400)、Fib(1∶5 000)、E-cadherin(1∶2 500)、Mtdh(1∶5 000)、TGF-β1(1∶1 000)、LC3A/B(1∶1 000),4℃孵育過(guò)夜,次日TBST洗3次,每次5 min,加入對(duì)應(yīng)HRP抗兔或小鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育1h,TBST洗3次,每次5 min,化學(xué)發(fā)光儀發(fā)光并攝像。以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次平行實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)人腹膜間皮細(xì)胞(HMrSV5)使用含10%胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基,在37℃、5%培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,首先分別將陰性對(duì)照(siNC)和下調(diào)Mtdh的siRNA(siMtdh)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞里,轉(zhuǎn)染6h后換液,換液時(shí)按照實(shí)驗(yàn)分組給予或者不給予TGF-β1(5 ng/ml)干預(yù)。干預(yù)48h提取細(xì)胞總蛋白并行Western Blot檢測(cè)LC3A/B、ColⅠ、Mtdh的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次平行實(shí)驗(yàn)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用《SPSS 20.0》統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用One-way ANOVA分析法,進(jìn)一步組間多重比較用LSD(假定方差齊性時(shí))或 Dunnett(未假定方差齊時(shí)),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

小鼠壁層腹膜厚度變化Masson染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠壁層腹膜厚度為13.497 6±2.239 9 μm,模型組腹膜厚度為55.266 4±9.446 84 μm,兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P=0.026);替米沙坦組腹膜厚度為17.521 8±1.793 16 μm,明顯低于模型組(P=0.038),腹膜纖維化改善(圖1A)。

小鼠腹膜纖維化的變化免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,模型組Fib和ColⅠ的染色強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組;替米沙坦干預(yù)組Fib和ColⅠ的染色強(qiáng)度明顯低于模型組(圖1B)。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型組Fib(P=0.048)、ColⅠ(P<0.001)、TGF-β1(P=0.002)的蛋白水平明顯高于正常組,E-cadherin的表達(dá)水平明顯低于正常組(P=0.031);與模型組對(duì)比,替米沙坦干預(yù)組Fib(P=0.046)、ColⅠ(P<0.001)、TGF-β1(P=0.009)的蛋白水平降低,E-cadherin(P=0.015)的表達(dá)水平升高 (圖2)。

圖1 替米沙坦減少小鼠壁層腹膜厚度及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積Fib:纖維連接蛋白;ColⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;A:各組小鼠壁層腹膜變化(Masson,×200);與對(duì)照組對(duì)比,模型組小鼠壁層腹膜厚度明顯增厚,替米沙坦可減輕小鼠壁層腹膜增厚;標(biāo)尺：50 μM。B:各組小鼠壁層腹膜免疫組化染色(IH,×200);與對(duì)照組對(duì)比,模型組Fib、Col Ⅰ表達(dá)明顯升高,替米沙坦可下調(diào)Fib、Col Ⅰ表達(dá);標(biāo)尺：50 μM

圖2 替米沙坦減輕腹膜纖維化Fib:纖維連接蛋白;ColⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;E-cadherin:E-鈣黏蛋白;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;A: Western Blot結(jié)果顯示各組Fib, ColⅠ和E-cadherin的表達(dá)水平;B～D:對(duì)應(yīng)的灰度統(tǒng)計(jì)圖;E: Western Blot結(jié)果顯示各組TGF-β1的表達(dá)水平;F:對(duì)應(yīng)的灰度統(tǒng)計(jì)圖;與對(duì)照組對(duì)比,*P<0.05,**P<0.01;與模型組對(duì)比,#P<0.05,##P<0.01

腹膜Mtdh的變化Western Blot結(jié)果顯示,模型組Mtdh的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P=0.015);替米沙坦干預(yù)組可下調(diào)Mtdh的表達(dá)水平(P=0.037)(圖3)。

自噬水平的變化LC3A/B-Ⅱ的表達(dá)升高是自噬水平上調(diào)的一個(gè)關(guān)鍵現(xiàn)象[16]。Western Blot結(jié)果顯示,模型組LC3A/B-Ⅱ的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P=0.007),提示腹膜纖維化中自噬受到抑制;替米沙坦干預(yù)組可上調(diào)LC3A/B-Ⅱ的表達(dá)(P=0.001)(圖3)。

圖3 替米沙坦抑制Mtdh表達(dá)和促進(jìn)自噬水平A:Western Blot結(jié)果顯示各組Mtdh的表達(dá)水平;B:對(duì)應(yīng)的灰度統(tǒng)計(jì)圖;C:Western Blot結(jié)果顯示各組LC3A/B-Ⅱ的表達(dá)水平;D:對(duì)應(yīng)的灰度統(tǒng)計(jì)圖;與對(duì)照組對(duì)比,*P<0.05, **P<0.01;與模型組對(duì)比, #P<0.05,##P<0.01

Mtdh抑制自噬和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積Western Blot結(jié)果顯示,使用siRNA下調(diào)Mtdh后,Mtdh表達(dá)水平明顯降低(P=0.001),與此同時(shí),Col Ⅰ的表達(dá)水平降低(P<0.001),LC3A/B-Ⅱ表達(dá)水平升高(P<0.001)(圖4)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在4.25%葡萄糖腹膜透析液誘導(dǎo)的小鼠腹膜纖維化模型中,Mtdh的表達(dá)水平明顯上調(diào);而替米沙坦可下調(diào)Mtdh的表達(dá)水平,并同時(shí)改善腹膜纖維化。Mtdh是位于8q22染色體上的原癌基因,目前認(rèn)為它能夠和PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、NF-κB、TLR、MAPK等多個(gè)信號(hào)通路相互作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程[17-22]。Mtdh通過(guò)促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬,增加惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β誘導(dǎo)EMT的敏感性[7],提示Mtdh可能與自噬存在密切的關(guān)系。Mtdh高表達(dá)于腎臟組織,與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展或存在重要聯(lián)系[4-6,12]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Mtdh在腹膜中高表達(dá),與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,替米沙坦可能通過(guò)影響Mtdh的表達(dá)緩解小鼠腹膜纖維化的發(fā)生。

圖4 siMtdh促進(jìn)自噬和抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;ColⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;A: Western Blot結(jié)果顯示各組Mtdh的表達(dá)水平;B: 對(duì)應(yīng)的灰度統(tǒng)計(jì)圖;C: Western Blot結(jié)果顯示各組LC3A/B、Col Ⅰ的表達(dá)水平;D、E:對(duì)應(yīng)的灰度統(tǒng)計(jì)圖;*：siNC+TGF-β1組與siNC組比較，P<0.05，#：siMtdh+TGF-β組與siNC+TGF-β1組比較，P<0.05

自噬通過(guò)對(duì)清除胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損衰老的細(xì)胞器,在細(xì)胞的內(nèi)部穩(wěn)態(tài)起著十分重要的作用[23-26]。根據(jù)本課題組已發(fā)表的文章的結(jié)果[27],在腹膜纖維化小鼠模型中,自噬水平明顯下調(diào),使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素干預(yù)后,小鼠腹膜厚度得到明顯減輕,細(xì)胞外基質(zhì)沉積減少,腹膜纖維化明顯改善,證明促進(jìn)自噬對(duì)腹膜纖維化起保護(hù)作用。類似地,在小鼠單側(cè)輸尿管梗阻術(shù)模型中,Kim等[28]研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用自噬抑制劑干預(yù)后,自噬活性被抑制,促進(jìn)腎臟纖維化的進(jìn)展;Li等[29]發(fā)現(xiàn)下調(diào)自噬相關(guān)基因ATG5加重腎臟纖維化;Ding等[30]發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)自噬可降解在腎小管上皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)成熟的TGF-β1蛋白水平,從而抑制腎纖維化。而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Mtdh可影響自噬的水平,表現(xiàn)為抑制Mtdh表達(dá)可上調(diào)自噬的水平,提示替米沙坦抑制Mtdh的表達(dá)改善腹膜纖維化的機(jī)制與Mtdh參與調(diào)控自噬水平關(guān)系密切。

在腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展中,TGF-β1是重要的細(xì)胞因子[2, 31-32]。TGF-β1以自分泌和旁分泌方式使成纖維細(xì)胞增長(zhǎng),從多個(gè)環(huán)節(jié)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。TGF-β1在腎臟、腹膜上明顯表達(dá)。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)阻斷劑血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和ARB不但能阻斷RAS通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)對(duì)腎臟的損傷作用,還能阻斷 RAS的非血流動(dòng)力學(xué)作用,即減少TGF-β1的生成以防止腎臟纖維化、腹膜纖維化的發(fā)生[11,33-34]。本實(shí)驗(yàn)研究的替米沙坦,是一類通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制血管緊張素Ⅱ與血管緊張素受體Ⅰ結(jié)合,從而阻斷RAAS,改善腎損傷的一種重要藥物。既往很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,ACEI或ARB類藥物在慢性腎衰動(dòng)物模型中起到腎保護(hù)作用,能更有效的抑制腎臟局部RAS的活性,改善蛋白尿和腎功能[33-34]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)替米沙坦可降低小鼠腹膜厚度,減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,改善腹膜纖維化;此外,替米沙坦可下調(diào)Mtdh的表達(dá)和促進(jìn)自噬水平,且下調(diào)Mtdh可促進(jìn)自噬和減少TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積,提示替米沙坦可能通過(guò)抑制Mtdh表達(dá)激活自噬而改善小鼠腹膜纖維化,具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)為ARB類藥物防治腹膜纖維化提供新的分子機(jī)制。

小結(jié):本實(shí)驗(yàn)旨在探究替米沙坦對(duì)腹膜纖維化的作用,以及其對(duì)Mtdh表達(dá)和自噬的影響,為腹膜纖維化的防治提供新的依據(jù)。我們發(fā)現(xiàn),替米沙坦不僅可減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積,改善腹膜纖維化,還可以抑制Mtdh的表達(dá)和上調(diào)細(xì)胞自噬的水平,且下調(diào)Mtdh可上調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平和減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。因此,我們推測(cè)替米沙坦可能通過(guò)抑制Mtdh表達(dá)、激活自噬,進(jìn)而改善腹膜纖維化。