孫利軍，周佳婧，韓笑，唐義舜，奎秋宇，徐松芝，朱素琴*，顧海鷹*

（1.南通大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226019；2.南通大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南通 226019）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常受到干旱、高鹽、病原菌等非生物和生物脅迫的影響。通常，這些外界的負(fù)面影響會(huì)引起植物內(nèi)在細(xì)胞的損傷和植物外表的改變，從而破壞植物生長(zhǎng)的規(guī)律和影響作物產(chǎn)量[1]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物形成了一系列的防御機(jī)制來適應(yīng)和抵抗各種外界條件脅迫[2]。在眾多的機(jī)制中，以基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用最為明顯，并且在植物的抗逆響應(yīng)中起著重要作用。

NAC 轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大且特有的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[1，3-5]。生物信息學(xué)分析表明，水稻基因組中有149 個(gè)成員，擬南芥有117 個(gè)，煙草和大豆有152 個(gè)成員[6-9]。NAC 家族已被發(fā)現(xiàn)在植物各個(gè)過程包括功能葉片衰老[10-11]、細(xì)胞壁的形成[12-13]等方面發(fā)揮著重要的作用。在多種生物和非生物脅迫響應(yīng)中，NAC 轉(zhuǎn)錄因子同樣也起著至關(guān)重要的作用[14-15]。

NAC 基因家族的功能鑒定和分析研究目前主要集中在擬南芥和水稻[14-15]，番茄中大多數(shù)成員的生物學(xué)功能仍然未知。研究發(fā)現(xiàn)，番茄SLNAC1、SLNAC3、SLNAM1 等轉(zhuǎn)錄因子有參與番茄抗逆反應(yīng)功能[16-17]。在前期研究中，我們利用植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）和SOL數(shù)據(jù)庫(kù)（http://solgenomics.net/）鑒定了番茄NAC 轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)NAC 保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，共獲得了101 個(gè)NAC 保守結(jié)構(gòu)域，分析了氨基酸序列及其氨基酸長(zhǎng)度，cDNA 的分子量、等電點(diǎn)，不穩(wěn)定指數(shù)，脂肪族氨基酸指數(shù)，總平均親水性等[18]。在此基礎(chǔ)上，我們初步鑒定了8 個(gè)番茄NAC 基因可能與植物所參與的滲透脅迫和衰老有關(guān)，24 個(gè)番茄NAC 基因可能與發(fā)育相關(guān)，20 個(gè)番茄NAC 基因可能與植物抗逆相關(guān)，并命名為Stress-SLNAC（SSLNAC）[18]。本研究將對(duì)鑒定的20 個(gè)SSLNACs 基因?qū)Σ煌巧锩{迫的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在為番茄NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族抗逆基因功能的進(jìn)一步分析提供信息基礎(chǔ)，為番茄抗逆品種的選育提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物生長(zhǎng)

番茄品種選擇蘇紅2003。將番茄種子散布于濕潤(rùn)濾紙上，25 ℃培養(yǎng)2～3 d，待發(fā)芽后轉(zhuǎn)移至跖石、泥炭土、珍珠巖（體積比6∶2∶1）的混合基質(zhì)中，培養(yǎng)溫度為20～25 °C，光照強(qiáng)度為30 000 lux，光照14 h/黑暗10 h。

1.2 非生物脅迫處理

4 周齡番茄幼苗用于干旱、高鹽和低溫處理。干旱處理：對(duì)正常生長(zhǎng)的番茄幼苗停止?jié)菜?，使其自然失水，根?jù)番茄幼苗的干旱程度，分別于第3 天（輕度干旱，番茄生長(zhǎng)狀態(tài)良好）、第6 天（中度干旱，番茄部分葉片開始萎蔫）和第9 天（重度干旱，番茄大部分葉片萎蔫）采集番茄葉片備用。高鹽處理：對(duì)葉片噴施200 mmol/L 的NaCl，使幼苗葉片上充滿了微小的液滴，分別在3，6 和12 h 采集番茄葉片備用。低溫處理：將番茄置于4 °C 的冰箱，分別在3，6 和12 h 采集番茄葉片備用。不經(jīng)任何處理的番茄葉片作為對(duì)照組。采集不同時(shí)間的番茄葉片樣品，液氮冷卻后-70 °C 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA 提取

番茄葉片總RNA 的提取主要采用RNAiso 法。將0.2 g 冰凍葉片磨成粉末，放入1.5 mL 離心管中，在離心管中加入1 mL RNAiso，蓋上管蓋，劇烈振蕩15 s，然后將其放置在室溫下10 min，4 ℃12 000 g離心10 min，取溶液于新的離心管加200 μL 氯仿，劇烈振蕩15 s，放置在室溫下10 min，4 ℃12 000 g離心10 min，取上層水相加入新離心管重復(fù)上一步，之后再次取上層水相加入新的離心管，加異丙醇至0.5 mL，室溫下放置10 min，4 ℃12 000 g 離心10 min，收集RNA 沉淀。用0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的酒精洗滌沉淀，振蕩，4 ℃7 500 g 離心5 min，室溫下放置5 min 進(jìn)行干燥，之后加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA 沉淀，-70 °C 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 cDNA 合成

第一鏈cDNA 合成試劑盒由AMV Reverse kit（Takara）、0.25 mL PCR 管組成，反應(yīng)體系為20 μL，依次加入1 μL Oligo（dT）18 primer、10 μL 2 ×TS反應(yīng)混合、1 μL Trans Scipt RT/RI Enzyme、2 μL RNA、RNase-free 水至20 μL 混合均勻。反應(yīng)過程為：30 ℃10 min、50 ℃30 min、95 ℃5 min、5 ℃5 min，將新合成的c-DNA 鏈-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

為了研究脅迫相關(guān)SSLNACs 基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)，設(shè)計(jì)了20 個(gè)SSLNACs 基因的引物，并以β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參[17]。所用的實(shí)時(shí)定量引物序列詳見表1。qRT 采用PCR 儀cfx96 系統(tǒng)進(jìn)行，采用20 μL 反應(yīng)體系，包含1 μLcDNA 模板、10 μL TransStart Tip green qPCR super mix、PCR 正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min、60 ℃15 s、72 ℃延伸40 s，40 個(gè)循環(huán)后使用溶解曲線進(jìn)行分析，采用公式2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 番茄脅迫相關(guān)SSLNACs 基因的實(shí)時(shí)定量引物Tab.1 The qRT-PCR primers of SSLNAC genes

1.6 方差分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了對(duì)照組和處理組，每組處理3 株，3次生物學(xué)重復(fù)。采用的RNA 樣品來自于3 個(gè)生物重復(fù)，每一個(gè)生物重復(fù)來自兩株番茄葉位相同的兩片葉片，技術(shù)重復(fù)3 次。處理間的顯著性差異分析采用SPSS 軟件的t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSLNACs 基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)

研究了不同的干旱時(shí)間下，干旱脅迫對(duì)SSLNACs 基因表達(dá)的影響（圖1）。與對(duì)照組相比，SSLNAC1、SSLNAC4、SSLNAC5、SSLNAC6、SSLNAC8、SSLNAC9、SSLNAC13、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC17、SSLNAC18、SSLNAC19、和SSLNAC20 上調(diào)表達(dá)超過3 倍，表達(dá)差異達(dá)到極顯著水平。其中，SSLNAC1、SSLNAC5、SSLNAC8、SSLNAC9、SSLNAC13、SSLNAC14 和SSLNAC17 在輕度干旱的條件下，就表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。

圖1 SSLNACs 在干旱脅迫下的表達(dá)模式Fig.1 The expression pattern of the SSLNAC genes under the drought stress

2.2 SSLNACs 基因?qū)Ω啕}脅迫的響應(yīng)

用0.15 mol/L NaCl 溶液噴施番茄葉片后，分別在3，6 和12 h 進(jìn)行表達(dá)研究，結(jié)果如圖2 所示。與對(duì)照組相比，SSLNAC1、SSLNAC2、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC9、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC16、SSLNAC17 和SSLNAC20 上調(diào)表達(dá)超過3 倍，表達(dá)差異達(dá)到極顯著水平，且這些基因?qū)Ω啕}處理較為敏感，表達(dá)量在3 h 就可以達(dá)到高峰。

圖2 SSLNACs 在高鹽脅迫下的表達(dá)模式Fig.2 The expression pattern of the SSLNAC genes under the high salinity stress

2.3 SSLNACs 基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)

對(duì)番茄進(jìn)行低溫處理，分別在3，6 和12 h 進(jìn)行表達(dá)研究，結(jié)果如圖3 所示。與對(duì)照組相比，SSLNAC1、SSLNAC2、SSLNAC3、SSLNAC4、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC8、SSLNAC9、SSLNAC11、SSLNAC12、SSLNAC13、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC16、SSLNAC17、SSLNAC18 和SSLNAC20 上調(diào)表達(dá)超過3 倍，表達(dá)差異達(dá)到極顯著水平。

圖3 SSLNACs 在低溫下的表達(dá)特性Fig.3 The expression pattern of the SSLNAC genes under the cold stress

2.4 SSLNACs 重疊表達(dá)特性研究

研究發(fā)現(xiàn)，SSLNAC1、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC9、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC17 和SSLNAC20 基因?qū)Ω珊怠⒏啕}和低溫的脅迫都有響應(yīng)。SSLNAC4、SSLNAC8、SSLNAC13 和SSLNAC18對(duì)干旱和低溫脅迫都有響應(yīng)，SSLNAC2 對(duì)高鹽和低溫脅迫都有響應(yīng)。

3 討論

基因的差異表達(dá)與其生物學(xué)功能有著緊密的聯(lián)系。如我們前期利用水稻基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了水稻OsNACs 家族基因在高鹽、干旱、低溫脅迫后的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)有50，45 和44 個(gè)OsNACs 基因分別對(duì)干旱、高鹽以及低溫脅迫作出響應(yīng)[9]。在這些水稻脅迫響應(yīng)基因中，SNAC1、SLNAC2（OSNAC6）、OsNAC5、OsNAC10（ONAC122）或OsNAC045的轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)體，顯著增強(qiáng)了水稻對(duì)干旱、高鹽的耐受性[19-23]。此外，過表達(dá)水稻OsNAC6 基因，可以增強(qiáng)植物對(duì)真菌病害稻瘟病菌的抗性[20]。應(yīng)用病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）系統(tǒng)證實(shí)了ONAC122 和ONAC131 基因在水稻抗稻瘟菌中的正向調(diào)控作用[24]。Jiang等[25]分析了擬南芥NAC 家族基因?qū)}脅迫的響應(yīng)，從鹽脅迫處理后的擬南芥根部組織中發(fā)現(xiàn)33 個(gè)NAC 基因的表達(dá)發(fā)生改變。在ANAC019、ANAC055、ANAC072/RD26 或ATAF1的轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)體中，增加了擬南芥對(duì)干旱的耐受性[26-27]。擬南芥中ATAF1 和ATAF2 基因已被證明是針對(duì)不同病原體防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子[27-28]。在本研究中，鑒定的20 個(gè)與逆境相關(guān)的番茄SSLNACs 基因中，13個(gè)SSLNACs 基因可以被干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，10個(gè)SSLNACs 基因可以被高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，17 個(gè)SSLNACs 基因可以被低溫誘導(dǎo)表達(dá)，預(yù)示其在應(yīng)對(duì)不同的非生物脅迫中具有重要的生物學(xué)功能。更為重要的是，SSLNAC1、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC9、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC17 和SSLNAC20 基因的表達(dá)可以被干旱、高鹽和低溫脅迫所誘導(dǎo)，表現(xiàn)出重疊的表達(dá)特性，這種重疊表達(dá)的特性預(yù)示其在不同非生物脅迫中的功能多效性。

4 結(jié)論

盡管NAC轉(zhuǎn)錄因子在不同逆境脅迫中發(fā)揮了重要作用，但作為一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族，只有少數(shù)幾個(gè)NAC 轉(zhuǎn)錄因子的作用是清晰的，大多數(shù)NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆機(jī)制中的功能，仍需要進(jìn)一步探討。這也表現(xiàn)出NAC 轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因育種中的廣泛應(yīng)用前景。我們研究了20 個(gè)與抗逆相關(guān)的SSLNACs 基因在不同非生物脅迫作用下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，這些基因?qū)Σ煌姆巧锬婢潮憩F(xiàn)出重疊的表達(dá)特性，這種重疊的表達(dá)特性預(yù)示其在不同的非生物脅迫中的功能多效性，為進(jìn)一步的功能分析提供了依據(jù)。因此，通過改變番茄抗逆相關(guān)NAC 蛋白活性以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能得到新的有價(jià)值的品種和轉(zhuǎn)基因番茄新材料。