王凱悅，邵心依，顧學(xué)芳，姚 勇，田澍

（南通大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南通 226019）

萊克多巴胺是一種β-腎上腺受體激動劑，臨床上用于治療支氣管哮喘、充血性心力衰竭癥等疾病[1]。另外，萊克多巴胺可控制蛋白質(zhì)合成，實現(xiàn)動物營養(yǎng)的再分配，提高瘦肉率[2]，俗稱“瘦肉精”。然而，肉制品中的過量殘留可導(dǎo)致食用者出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、惡心和嘔吐等癥狀[3]。盡管萊克多巴胺作為飼料添加劑在我國和歐盟早已被嚴(yán)格禁止，但非法添加事件仍時有發(fā)生。因此，建立一種簡便、靈敏的萊克多巴胺檢測方法具有重要意義。

色質(zhì)聯(lián)用方法及酶聯(lián)免疫法是最常用的萊克多巴胺檢測方法[4-6]。免疫分析法可結(jié)合諸如比色法、熒光法、電化學(xué)和表面增強(qiáng)拉曼（surface-enhanced Raman scattering，SERS）等讀出方法[7-10]，因其特異性和靈敏度高，已成為食品、環(huán)境和生物領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的分析方法之一。SERS 是指當(dāng)分子位于金、銀等貴金屬粗糙表面附近時，其拉曼信號得到極大增強(qiáng)的現(xiàn)象。近年來，基于SERS 的免疫分析受到越來越多的關(guān)注，其超高靈敏度和光譜分辨率，單一光源下檢測多組分的能力，以及水分子可忽略的微弱信號使得SERS 尤其適合于生物領(lǐng)域的分析[11-14]。

金納米顆粒具有良好的生物相容性，銀納米顆粒則具有極強(qiáng)的SERS 增強(qiáng)效果，因而金、銀納米顆粒成為生物分析中最常用的SERS 基底[15]。然而，在實際應(yīng)用中，金、銀納米顆粒的大小以及聚集狀態(tài)的不確定性影響了定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度[16]。為此，制備規(guī)整的二維或三維金屬納米陣列是較好的解決方案[17-18]。首先，金屬納米顆粒之間的強(qiáng)電磁耦合會使長程納米陣列結(jié)構(gòu)的SERS 增強(qiáng)效果顯著提升；其次，通過控制周期性有序納米結(jié)構(gòu)的形貌，可以使金屬表面的局域表面等離子體共振（local plasmon resonance frequency，LSPR）在可見光甚至近紅外區(qū)域內(nèi)實現(xiàn)調(diào)諧[19]。這對于SERS 在生物分析中的應(yīng)用尤為重要，因為該區(qū)域可以有效避免熒光干擾和光誘導(dǎo)的生物變性。

本文以密堆積的二維聚苯乙烯（PS）微球為模板，采用電沉積方法（多電流階躍）制備了金/銀雙金屬球腔陣列（bimetallic cavity arrays，BMCA），該基底展示出極佳的SERS 增強(qiáng)效果和信號重復(fù)性。將BMCA 基底與競爭免疫分析相結(jié)合，對標(biāo)準(zhǔn)溶液和豬肝樣品中的萊克多巴胺進(jìn)行高通量的初步篩選和定量分析。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

萊克多巴胺（RAC）、亞甲基藍(lán)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），sigma-Aldrich；硝酸銀（AgNO3）、氯金酸（HAuCl4），百靈威（J&K）；其余試劑均為分析純。用于負(fù)載標(biāo)記分子的DNA 訂購自上海生工生物技術(shù)有限公司（Sangon Biotech，Shanghai），其序列如下：

包被抗原RAC-OVA 及單克隆抗體anti-RAC由蘇州大學(xué)鄧安平教授課題組提供?？贵w效價1∶10 000，最優(yōu)條件下基于該單克隆抗體對RAC 的IC50 為0.56 ng/mL，LOD 為0.049 ng/mL。所有溶液均采用電阻率大于18.2 MΩ·cm 的超純水配制。CHI660E 電化學(xué)工作站（上海辰華）及Hitachi S-4700 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）分別用于金銀球腔陣列的制備和形貌表征，島津UV-3600 用于測量球腔陣列的反射紫外光譜，Raman 測量則采用Horiba iHR320 共聚焦顯微拉曼光譜儀（Jobin Yvon technology），激發(fā)光波長為633 nm，采用D2 衰減片，使到達(dá)樣品表面的激光功率為0.1 mW。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀雙金屬陣列基底的制備

聚苯乙烯微球模板及電沉積方法見本課題組早期工作[17-18，20]。為實現(xiàn)金銀納米顆粒的同時沉積，電解液組成略作調(diào)整：以濃氨水調(diào)節(jié)不同體積的0.1 mol/L AgNO3+0.1 mol/L EDTA 溶液pH 為10.0，緩慢滴加0.1 mol/L HAuCl4溶液，使電解液金銀組分總濃度為0.05 mol/L。

1.2.2 金納米探針的制備

向預(yù)先制備的金溶膠中滴加適量0.2 mol/L 的Na2CO3，調(diào)節(jié)溶液pH 為9.0～9.5。隨后向1 mL 金溶膠（檸檬酸鈉還原氯金酸制得）中加入200 μL 50 μg/mL 的anti-RAC，室溫下孵育0.5 h 后加入50 μL 40 μmol/L 的CDNA，4 ℃下孵育過夜。離心去除多余的抗體和捕獲DNA，重新分散于pH=8.0 的tris-HCl 緩沖溶液中。隨后，加入20 μL 10 μmol/L的TDNA并在37 ℃下孵育1 h，加入20 μL 10 μmol/L的TDNA和SDNA混合液，4 ℃反應(yīng)12 h 以形成DNA多聯(lián)體。再次離心去除多余的DNA，隨后加入100 μL 1 mmol/L TMB 溶液，吸附反應(yīng)2 h 后離心去除多余的TMB 并重新分散于tris-HCl 緩沖溶液備用。

1.2.3 RAC 免疫傳感器的構(gòu)建

將10 μL 50 μg/mL RAC-OVA 滴加于BMCA表面指定區(qū)域，4 ℃下靜置24 h。然后，將20 μL 含有金納米探針和不同濃度的RAC 標(biāo)準(zhǔn)溶液（真實樣品溶液）滴加至覆蓋有包被抗原的區(qū)域，室溫下反應(yīng)1 h。免疫競爭反應(yīng)后，滴加20 μL 銀溶膠于上述區(qū)域銀染反應(yīng)1 h，銀納米顆粒則因靜電相互作用吸附至免疫復(fù)合物表面。

1.2.4 真實樣品的處理

將準(zhǔn)確稱重的豬肉或豬肝樣品（2～3 g）切割并充分均質(zhì)化，加入10 mL 甲醇超聲攪拌30 min。然后將樣品在4 ℃下10 000 r/min 離心15 min，取上清液以tris-HCl 緩沖溶液稀釋定容至100.00 mL。于稀釋提取液1.0 mL 中加入一定量的RAC 標(biāo)準(zhǔn)溶液，這些不同濃度的加標(biāo)樣品用于SERS 檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 金/銀雙金屬球腔陣列基底的制備和表征

自組裝是一種制備陣列結(jié)構(gòu)的簡便有效的方法。由SEM 圖（圖1（a））可見，二維PS 模板由水面轉(zhuǎn)移至ITO 電極表面后仍保持著高度有序的陣列結(jié)構(gòu)。在平方厘米面積范圍內(nèi)PS 微球呈單層分布，未出現(xiàn)明顯的位錯缺陷和多層堆積。傾斜視圖進(jìn)一步證實了模板的規(guī)整性。圖1（b）所示為電沉積和去除PS 模板后所得的BMCA 的SEM 圖。多電流階躍法中的大電流脈沖用以生成粒徑細(xì)小的納米“種子”，而小脈沖則使金/銀金屬在其上有序生長，并能通過控制小脈沖次數(shù)實現(xiàn)對球腔形貌的控制[17-18]。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以通過控制電沉積過程中所通過的電量（小脈沖的次數(shù)）實現(xiàn)對所得球腔形貌的控制。由圖可見，球腔陣列保持了模板的原始形貌特征。EDX 能譜證明了在BMCA 中共存有Au 和Ag 兩種金屬，而XRD 圖則表明了組成球腔的多晶金/銀納米顆粒具有面心立方（fcc）結(jié)構(gòu)和（111）擇優(yōu)取向。為進(jìn)一步分析陣列基底中金、銀元素的分布，對其進(jìn)行EDX 元素面掃描（圖1（c））。由圖可見，Au 和Ag 原子均勻分布在腔陣列表面，兩種元素的疊加清晰地反映了BMCA 的形貌。

圖1 雙金屬球腔陣列基底的形貌表征及元素成分分析Fig.1 Morphological characterization and element composition analysis of gold/silver bimetallic cavity arrays

圖2 所示SEM 圖闡明了電解液中HAuCl4與AgNO3摩爾比（nAu∶nAg）對BMCA中金、銀元素組成及形貌的影響。當(dāng)nAu∶nAg>8∶2 時，SEM 圖中只觀察到一些散亂的金屬顆粒，這可能是因為此時Au（III）處于一種欠電位沉積的狀態(tài)，而銀雖然能夠?qū)崿F(xiàn)電沉積，但由于含量過低，無法在模板縫隙里形成規(guī)整的陣列結(jié)構(gòu)。隨電解液中AgNO3含量逐漸增大（nAu∶nAg由8∶2 連續(xù)改變?yōu)?∶5），球腔陣列的形貌變得愈發(fā)清晰。繼續(xù)增大電解液中nAg，球腔的規(guī)整性反而降低，直至出現(xiàn)大量的銀納米顆粒覆蓋在陣列基底的表面。BMCA 陣列中金、銀的原子分?jǐn)?shù)也隨電解液不同組成而明顯變化。經(jīng)EDX 分析估算可得，隨電解液中nAu∶nAg由8∶2 變?yōu)?∶4，所得BMCA中金原子的比例（從70.1%到24.2%）迅速下降。然而，當(dāng)電解液中Au（III）和Ag（I）的濃度接近相等時，這種下降趨勢會減慢。繼續(xù)增加電解液中Ag（I）的含量（nAu∶nAg<3∶7），最終的BMCA 基本由銀構(gòu)成（銀含量為98.1%）。

圖2 不同nAu∶nAg 電解液制得的雙金屬球腔陣列的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of BMCA obtained from electrolytes with different nAu∶nAg

2.2 BMCA 基底的SERS 性能

為進(jìn)一步闡明BMCA 的組成與其表面的LSPR及拉曼增強(qiáng)效果之間的聯(lián)系，以確定最佳制備條件，制備了一系列不同組成的陣列基底，測量了它們的紫外-可見反射光譜（此處將縱坐標(biāo)由反射率轉(zhuǎn)為吸收以方便觀察）及亞甲基藍(lán)在其表面的SERS 信號。由圖3（a）可見，隨電解液中銀含量增加，較短波長處連續(xù)紅移的吸收峰代表了銀的LSPR，意味著BMCA 中銀含量和銀納米粒子尺寸的增加；長波長處的吸收峰則代表了BMCA 中金、銀納米顆粒耦合產(chǎn)生的LSPR，隨著金在陣列結(jié)構(gòu)中原子分?jǐn)?shù)的增加，LSPR 也呈現(xiàn)紅移趨勢和增強(qiáng)。圖3（b）為亞甲基藍(lán)在對應(yīng)基底上的SERS 光譜。正如預(yù)期的那樣，SERS 強(qiáng)度隨著基底中銀比例的升高而增強(qiáng)。當(dāng)電解液中nAu∶nAg=2∶8 時，所得BMCA 表面亞甲基藍(lán)的SERS 信號最強(qiáng)，然而其信號重現(xiàn)性也最差（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=21.9%）。相比之下，當(dāng)選擇nAu∶nAg=6∶4 的電解液來制備BMCA 時，亦可得理想的SERS 增強(qiáng)效果。更重要的，陣列結(jié)構(gòu)基底制備的可重復(fù)性和形狀的規(guī)整性是獲得良好的信號重現(xiàn)性并保證結(jié)果可信度的基礎(chǔ)。為此，我們通過保持電沉積電量一致的方法平行制備了4 個陣列基底，并在每個基底表面隨機(jī)選取15 個測試點(diǎn)，測試了吸附于其上的TMB 分子的SERS 信號，對應(yīng)圖譜以二維拉曼圖的形式表示（圖3（c））。由圖可見，在4 個基底表面所獲得的信號展示出令人滿意的重現(xiàn)性（RSD=9.4%），證明了該制備方法的高度可重復(fù)性。與此同時，在同一基底上以亞甲基藍(lán)為探針分子，隨機(jī)選取30 個測試點(diǎn)，同樣將對應(yīng)圖譜以二維拉曼圖的形式表示出來（圖3（d）），所得結(jié)果證明了基底具有極佳的表面規(guī)整度。以苯硫酚鈉為探針分子，按式（1）[21]對所得BMCA 基底的增強(qiáng)因子進(jìn)行計算，結(jié)果為6.7 × 106。

圖3 金/銀雙金屬球腔陣列基底的局域等離子體共振及其SERS 性能Fig.3 Localized plasmon resonance and SERS performance of gold/silver bimetallic cavity arrays

2.3 實驗條件的優(yōu)化

利用單因素優(yōu)選法，分別以1 ng/mL RAC 溶液和空白溶液為考察對象，通過對比不同條件下傳感器信號強(qiáng)度，確定金免疫探針和競爭性免疫傳感器的制備條件。本工作中，金納米顆粒表面的DNA 鏈節(jié)連環(huán)起到信號放大器的作用。在這一策略中，CDNA通過末端的巰基共價鍵合至金納米顆粒的表面，帶有特定序列的SDNA和TDNA的兩個互補(bǔ)區(qū)域雜交后，引發(fā)雜交反應(yīng)。TMB 屬于芳香族陽離子染料，可以通過與帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)之間的靜電作用吸附于DNA 表面，或直接嵌入DNA 雙螺旋中實現(xiàn)對納米探針的標(biāo)記[22]，從而增加標(biāo)記分子的負(fù)載量而使信號得到極大增強(qiáng)。由圖4（a）可見，隨著CDNA濃度的增加，SERS 強(qiáng)度顯著增加并在濃度為2.0 μmol/L時達(dá)到最大值。圖4（b）所示的抗RAC 濃度與所得信號強(qiáng)度變化趨勢圖（4（a））相似，在濃度為10.0 μg/mL時達(dá)到最大值。進(jìn)一步增加抗體或CDNA的濃度導(dǎo)致免疫傳感器的強(qiáng)度略有下降，這可能是由于抗體與DNA 在AuNPs 表面的競爭吸附所致。包被抗原和免疫探針的濃度則以空白溶液為考察對象加以確定。如圖4（c）所示，SERS 強(qiáng)度隨著包被抗原濃度的增加而逐漸提高，直到在100 μg/mL 時達(dá)到穩(wěn)定，表明此時包被抗原在BMCA 表面達(dá)到飽和吸附。免疫探針濃度（圖4（d））在0.5～2.5 nmol/L 范圍內(nèi)變化趨勢與圖4（c）相同，當(dāng)免疫探針濃度大于3.0 nmol/L時達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定。在隨后的實驗中，將包被抗原和免疫探針的最佳濃度分別設(shè)為100 μg/mL和3.0 nmol/L。

圖4 競爭免疫傳感器構(gòu)建條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of construction conditions of the ractopamine competitive immunosensor

2.4 RAC 的定量分析

為了考察該RAC 競爭免疫傳感器在定量檢測中的可行性，首先以打孔的雙面膠覆蓋BMCA 表面，暴露出若干（3 × 6）直徑為2 mm 的圓形區(qū)域，用于進(jìn)行樣品的預(yù)篩查和定量分析。此操作可幫助我們在同一基底表面獲得若干平行測定數(shù)據(jù)，從而提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。繼而配制不同濃度的RAC 標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實驗步驟進(jìn)行相應(yīng)處理，測量標(biāo)記分子TMB 的SERS 信號，結(jié)果見圖5（a）。由圖可見，TMB的拉曼信號隨RAC 濃度的增加持續(xù)衰減。以SERS強(qiáng)度與待測物濃度對數(shù)值進(jìn)行作圖和線性擬合后得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5（b））。其中，每一個數(shù)據(jù)點(diǎn)及誤差棒分別代表5 個隨機(jī)測量點(diǎn)SERS 強(qiáng)度的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差?？梢钥闯?，在10 pg/mL 到100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，RAC 濃度的對數(shù)值與TMB分子1 608 cm-1處SERS 峰強(qiáng)度存在線性關(guān)系，線性方程為y=4 835.4 -2 568.7lg[C]，方法的檢出限低至3.0 pg/mL。

圖5 萊克多巴胺濃度與SERS 強(qiáng)度的線性相關(guān)性Fig.5 Linear correlation between ractopamine concentration and SERS intensity

選擇溴布特羅、克侖特羅和西馬特羅為干擾物對方法的特異性進(jìn)行評估，測試了不同濃度（0.1，1.0 和10.0 ng/mL）的RAC 和干擾物的混合液。結(jié)果表明，隨著RAC 濃度的增加，觀察到SERS 強(qiáng)度顯著降低，而隨著干擾物濃度的增加，信號沒有明顯變化。RAC 在1.0 和5.0 ng/mL 濃度下的批內(nèi)測定（n=6）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為7.7%和9.3%。同時，在平行制備的BMCA（n=4）上，RAC 的批間RSD（1.0 和5.0 ng/mL）分別為10.4%和9.1%。以上結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性和精密度。

2.5 真實樣品的檢測

以本地菜市場售賣的豬肝為真實樣品，按實驗方法進(jìn)行篩查，未見RAC 檢出。進(jìn)而，往樣品中添加0.1，0.4 和2 ng/mL 的RAC，通過計算回收率來驗證這種競爭性免疫測定法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表1。計算結(jié)果表明，該方法的回收率為94.7%～107.8%，RSD 為8.9%～11.7%（n=5）。這些結(jié)果表明，該競爭免疫分析方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，可用于測定實際樣品中的痕量β-腎上腺受體激動劑。

表1 方法用于檢測真實樣品中RAC 的加標(biāo)回收率Tab.1 The recoveries of the proposed immunoassay for the detection of RAC in spiked samples

3 結(jié)論

以密堆積聚苯乙烯微球為模板，結(jié)合電沉積方法，制備了高度有序的二維金/銀雙金屬球腔陣列。通過改變前驅(qū)體中金、銀組分的摩爾比，可以實現(xiàn)對該陣列基底形態(tài)和組成的調(diào)節(jié)，從而在其上獲得優(yōu)異的SERS 增強(qiáng)和信號重現(xiàn)性。固定于免疫金納米探針表面的DNA 雜交鏈用作信號放大器以吸附帶正電荷的標(biāo)記分子。在10～100 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)記分子TMB 的拉曼信號與RAC 濃度的對數(shù)值呈負(fù)線性相關(guān)，其檢出限為3.0 pg/mL。該方法可用于市售肉制品中萊克多巴胺的定性定量測定。另外，制備更多材質(zhì)的有序球腔陣列結(jié)構(gòu)有利于開展基于SERS 的理論研究；結(jié)合DNA 雜交鏈對標(biāo)記分子的負(fù)載方式以及SERS 的高靈敏度和多路復(fù)用特性，有望將該方法拓展至對大分子蛋白的高通量檢測及對生物小分子代謝的監(jiān)測。