徐靜娟，陳麗先，李向玲

（南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 210023）

乙酰膽堿（ACh）是一種神經(jīng)遞質(zhì)[1]，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著非常重要的作用[2-3]。在神經(jīng)元中，ACh 可調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉接頭處的肌肉收縮，所以其在人體內(nèi)的濃度與人的行為活動(dòng)、學(xué)習(xí)、睡眠等生理過(guò)程息息相關(guān)[4]。此外，大腦中ACh 的代謝異常與帕金森病、阿爾茨海默病[5]、精神分裂癥[6]和運(yùn)動(dòng)功能異常[7]等神經(jīng)精神疾病有關(guān)。因此，科學(xué)研究者們投入了大量精力在ACh 的檢測(cè)上[8-10]，以實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷。但是，ACh 不僅缺少電活性基團(tuán)、發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)，而且還缺少易于偶聯(lián)的官能團(tuán)[11]，所以利用傳統(tǒng)的分析方法檢測(cè)ACh 比較困難。近年來(lái)，生物傳感器的快速發(fā)展為高靈敏的ACh 檢測(cè)提供了新契機(jī)。在此類ACh 檢測(cè)的生物傳感器[12-13]中，乙酰膽堿酯酶（AChE）或膽堿氧化酶（ChOx）對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行催化，以形成電化學(xué)活性產(chǎn)物（H2O2）或熒光產(chǎn)物[14-15]，基于催化產(chǎn)物的敏感性和可識(shí)別性，實(shí)現(xiàn)了ACh 的高靈敏檢測(cè)。因此，基于酶催化原理，構(gòu)建簡(jiǎn)易可行的檢測(cè)探針，是實(shí)現(xiàn)ACh 此類生物功能分子靈敏檢測(cè)的關(guān)鍵因素。

性能優(yōu)異的貴金屬納米顆粒（如金和銀納米粒子）是構(gòu)建生物傳感器的優(yōu)良選擇，其除了具有納米材料的基本特性之外，還具有獨(dú)特的局域表面等離子體共振（local surface plasmons resonance，LSPR）性質(zhì)。LSPR 特性除了與貴金屬納米顆粒自身的尺寸、形狀、組成相關(guān)以外，還與其周圍的環(huán)境介質(zhì)、粒子間距等息息相關(guān)[16]。這一性質(zhì)使得貴金屬納米材料有著良好的光學(xué)特性。金、銀貴金屬納米顆粒等離子體吸收帶通常位于可見光區(qū)域[17-18]，這使其適用于生物成像檢測(cè)[19]。在給定外部介電常數(shù)的情況下，銀納米顆粒（AgNPs）通?？梢蕴峁┍冉鸺{米顆粒（AuNPs）更高的檢測(cè)靈敏度[20]；然而，AuNPs 的表面穩(wěn)定性和生物安全性會(huì)比AgNPs 更好[21-22]。

本文制備了一種金核銀殼的棒狀（Au@AgNRs）復(fù)合納米材料，并將其運(yùn)用于ACh 的檢測(cè)當(dāng)中。如圖1 所示，使用AChE 和ChOx 催化底物ACh 產(chǎn)生H2O2；用血紅素/G-四聯(lián)體催化所生成的H2O2，使之生成羥基自由基（·OH）；所生成的羥基自由基刻蝕掉金納米棒表面的銀殼，在暗場(chǎng)顯微鏡下表現(xiàn)出散射信號(hào)的變化，用光譜儀記錄其光譜的移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)乙酰膽堿的靈敏檢測(cè)。

圖1 等離子體探針Au@AgNRs 檢測(cè)乙酰膽堿的示意圖Fig.1 Schematic illustration of the detection of ACh via plasmonic probe Au@AgNRs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見吸收光譜使用Nanodrop 2000 C 紫外-可見光譜儀（Nanodrop，美國(guó)）測(cè)量；透射電鏡圖使用JOEL JEM 200 CX 透射電子顯微鏡拍攝；暗場(chǎng)圖像在有暗場(chǎng)聚光器（0.8 ＜NA ＜0.92）及60 倍物鏡（NA=0.7）的倒置顯微鏡（IX71，Olympus）下 獲得，所用光源為100 W 鹵素?zé)?，由彩色CCD（DP 80，日本Olympus）捕獲暗場(chǎng)彩色圖像，分辨率為4 800像素×3 600 像素；金納米粒子的散射光譜通過(guò)配備有光柵（光柵刻線為300 線/mm，發(fā)光波長(zhǎng)為500 nm）的單色儀（Acton SP 2358，PI，美國(guó)）采集。

氯金酸（HAuCl4·3H2O）、無(wú)水乙醇、丙酮、氫氧化鈉（NaOH）、油酸鈉、鹽酸、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，30k），上海阿拉丁試劑有限公司；硝酸銀（AgNO3），Sigma-Aldrich 有限公司；Tris-acetate緩沖液、乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿氧化酶（ChOx），Invitrogen（Eugene，OR，USA）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm，Milli-Q MiUipore，USA）；ITO，蕪湖晶輝電子科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金納米棒的合成

首先，使用經(jīng)典的種子生長(zhǎng)法合成了尺寸均一的金納米種子（約13 nm）溶液[23]。在50 mL 的單口瓶中，將10 mL 0.5 mmol/L 的氯金酸和10 mL 0.2 mol/L 的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液混合，然后在快速攪拌的條件下加入12 mL 新鮮配置的0.01 mol/L 的硼氫化鈉溶液（在冰水浴中配置），此時(shí)，溶液的顏色迅速由黃色變?yōu)楹稚?，繼續(xù)攪拌2 min后得到的種子液，在28 ℃下靜置1 h 后待用。

金納米棒的合成：將1.5 g 油酸鈉和8.0 g CTAB用250 mL 熱水溶解在500 mL 的三角燒瓶中緩慢攪拌，向其中加入0.05 mol 5-溴水楊酸，在水浴鍋中待溫度降至30 ℃，加入18 mL 4 mmol/L 的硝酸銀溶液，在無(wú)攪動(dòng)的條件下保持30 min。隨后加入250 mL 1 mmol/L 的氯金酸溶液，緩慢攪拌30 min，此時(shí)溶液變成無(wú)色，隨后加入2.1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的鹽酸攪拌15 min，然后將轉(zhuǎn)速調(diào)至最大并快速加入1.25 mL 0.064 mmol/L 的抗壞血酸，攪拌至無(wú)色。最后加入0.4 mL 已經(jīng)制備完成的金種子溶液，充分?jǐn)嚢韬髮⒎磻?yīng)液靜置于28 ℃反應(yīng)18 h，用于金納米棒的生長(zhǎng)。制備完成的金納米棒溶液于20 ℃、7 500 r/min 離心20 min，洗滌5 次后分散在0.05 mol/L 的CTAB 溶液中。

1.2.2 金核銀殼納米材料（Au@AgNRs）的合成

合成的金納米棒用于繼續(xù)合成金核銀殼納米棒，具體方法參考了文獻(xiàn)[24]并做了一定的優(yōu)化。取0.8 mL 已合成的金納米棒溶液于7 500 r/min 離心5 min，去掉上清液，加入0.8 mL 0.1 mmol/L 的CTAB重新分散。在25 mL 的單口燒瓶中加入0.8 mL 的金納米棒溶液、2.4 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的PVP 和0.24 mL 1 mmol/L 的AgNO3，在30 ℃緩慢攪拌下，加入0.12 mL 0.1 mol/L 的抗壞血酸，溶液從棕褐色迅速變?yōu)樗{(lán)綠色。合成的金核銀殼納米棒放置于20 ℃、7 000 r/min 離心，洗滌3 次后重新分散在0.05 mol/L 的CTAB 中。

1.2.3 Au@AgNRs 納米探針在ITO 上的固定

ITO 的處理：將購(gòu)買的ITO 用玻璃切割器切割成1.5 cm × 3.5 cm 的長(zhǎng)方形片狀，用洗衣粉搓洗表面至光滑，去除表面油污，然后用純凈水沖掉洗衣粉。將ITO 依次置于乙醇、丙酮、乙醇、純凈水超聲15 min，烘干。將烘干的ITO 放入大燒杯中并向其中加入11.2 g KOH、100 mL 異丙醇，蓋上表面皿蒸煮20 min，使異丙醇在容器內(nèi)回流、KOH 完全溶解，其目的是使ITO 表面的羥基充分暴露出來(lái)，使表面帶有充足的負(fù)電荷。洗滌過(guò)后用大量的水沖洗ITO，此時(shí)ITO 表面變得柔滑，烘干待用。

Au@AgNRs 在ITO 表面的固定：將合成的Au@AgNRs 于7 000 r/min 離心，加入等量純凈水重新分散，以洗掉其表面大量的CTAB 分子。稀釋100倍后超聲5 min 使Au@AgNRs 均勻分散在水中，將制作好的圓孔聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜鋪在ITO表面，取100 μL Au@AgNRs 稀釋液緩慢均勻地滴到ITO 上的PDMS 膜的圓孔中，靜置鋪板10 min，用移液槍吸走未吸附在ITO 表面上的Au@AgNRs，用超純水沖洗ITO 表面3 遍，用N2吹干ITO 表面，此時(shí)Au@AgNRs 已經(jīng)被固定在ITO 表面。

1.2.4 Au@AgNRs 納米探針對(duì)乙酰膽堿的檢測(cè)

將固定好Au@AgNRs 探針的ITO 放在暗場(chǎng)顯微鏡下觀察，可以清楚拍攝到Au@AgNRs 探針的暗場(chǎng)散射信號(hào)。為了實(shí)現(xiàn)該探針對(duì)乙酰膽堿的檢測(cè)，在37 °C 緩慢震蕩的條件下，用含有AChE（0.5 U/mL）、ChOx（0.5 U/mL）的Tris-acetate 緩沖液（5 mmol/L，pH=7.0）配置了一系列不同濃度（5～25 nmol/L）的ACh 溶液，并向其中加入血紅素/G-四聯(lián)體（最終濃度為50 μmol/L），在37 °C 的條件下孵育30 min。最后，將混合物加入到Au@AgNRs 檢測(cè)體系中，在暗場(chǎng)顯微鏡下觀察，并且用彩色CCD 拍照記錄，用光譜儀采集Au@AgNRs 反應(yīng)前后的散射光譜，探究檢測(cè)過(guò)程中納米檢測(cè)探針散射信號(hào)的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNRs 和Au@AgNRs 納米探針的表征

為了確定所合成AuNRs 和Au@AgNRs 探針的形貌特征，對(duì)合成的材料進(jìn)行了透射電子顯微鏡（TEM）的表征。如圖2 所示，實(shí)驗(yàn)中所合成的金納米棒尺寸約為20 nm × 47 nm（長(zhǎng)徑比約為1∶2.3），尺寸形貌均一；金核銀殼納米棒尺寸為25 nm×51 nm，Ag 殼的平均厚度為5.7 nm，圖2（b）下方顆粒顏色明顯偏深是由于兩個(gè)納米棒重疊在一起所導(dǎo)致。從TEM 表征可以得出我們成功制備了Au@AgNRs 納米探針，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

利用紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）對(duì)材料進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖3 所示。AuNRs 的吸收峰在620 nm左右，合成的溶液顏色呈紅褐色，而包裹了銀殼之后吸收峰藍(lán)移到550 nm 左右，此時(shí)與之對(duì)應(yīng)的溶液顏色變?yōu)樗{(lán)綠色，吸收光譜的變化進(jìn)一步驗(yàn)證了納米材料成功制備。

圖3 AuNRs 和Au@AgNRs 的紫外-可見光譜（插圖為材料實(shí)物照片）Fig.3 UV-Vis spectra of AuNRs and Au@AgNRs（inset: the photos of nanomaterials）

對(duì)于超靈敏的暗場(chǎng)散射信號(hào)分析，貴金屬等離子體納米材料的選擇至關(guān)重要。該方法中選擇AuNRs 作為核心材料，由于貴金屬納米材料的局域等離子體共振性能與材料的形貌及周圍介電常數(shù)密切相關(guān)，可以通過(guò)調(diào)控AuNRs 長(zhǎng)徑比和外層銀層的厚度，以期實(shí)現(xiàn)Au@AgNRs 刻蝕前后散射光譜有明顯的變化。首先考察所合成的等離子納米材料是否符合此要求，分別將納米材料固定在ITO 上，并置于暗場(chǎng)顯微鏡下觀察其相對(duì)應(yīng)的散射信號(hào)。由圖4可以看出，AuNRs 在暗場(chǎng)下散射光呈紅色，Au@AgNRs 散射光呈綠色，兩種納米材料散射信號(hào)之間的明顯顏色差異為刻蝕反應(yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測(cè)提供了可行性。

圖4 AuNRs 和Au@AgNRs 的暗場(chǎng)散射圖像Fig.4 DFM images of AuNRs and Au@AgNRs

2.2 Au@AgNRs 納米探針刻蝕時(shí)間的優(yōu)化

為了探究實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的進(jìn)程，首先向體系中加入血紅素/G-四聯(lián)體，在暗場(chǎng)顯微鏡下，研究其催化H2O2（濃度為0.1 μmol/L）產(chǎn)生的·OH 對(duì)Au@AgNRs納米探針的刻蝕過(guò)程，并用彩色CCD 實(shí)時(shí)拍照記錄。從圖5 中可以看到，在被·OH 刻蝕前，等離子體納米探針的散射光呈綠色；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，金納米棒表面的銀殼逐漸被刻蝕掉，此時(shí)該等離子體納米探針散射光呈現(xiàn)綠色—黃色—紅色的變化，且散射強(qiáng)度有一定的降低，這也側(cè)面證實(shí)了銀殼從金納米棒表面被刻蝕。

圖5 不同時(shí)間下酶催化產(chǎn)物引起Au@AgNRs 的暗場(chǎng)散射圖像變化Fig.5 The variety of Au@AgNRs DFM images during the catalytic reaction of enzyme over the time

隨后對(duì)整幅圖像中的納米顆粒進(jìn)行RGB 分析，每隔2 min 采集該點(diǎn)的RGB 值，并且用Image J 軟件對(duì)此斑點(diǎn)的R、G、B 3 個(gè)色彩通道分離（圖6），并對(duì)其強(qiáng)度進(jìn)行分析?？梢钥吹?，隨著刻蝕反應(yīng)的進(jìn)行，紅色（R）值不斷增大，綠色（G）值不斷減小，藍(lán)色（B）值保持穩(wěn)定。在該濃度下暗場(chǎng)散射光的顏色在15 min 左右不再改變。因此，在下面的定量分析中采用15 min 的刻蝕時(shí)間。

圖6 時(shí)間相關(guān)的DFM 圖像與分離通道的RGB 強(qiáng)度（左）和刻蝕過(guò)程中Au@AgNRs 點(diǎn)的R/G 擬合曲線（右）Fig.6 Time-dependent DFM images and RGB intensities with split channels (left) and R/G of Au@AgNRs spots during etching (right)

2.3 乙酰膽堿濃度的測(cè)量

在最佳反應(yīng)條件下，使用該方法檢測(cè)ACh，隨著濃度的升高（5～25 nmol/L），每種濃度都隨機(jī)選取20 個(gè)點(diǎn)采集其光譜，獲得其光譜位移最大值的高斯分布。在相同的條件下光譜位移值的差異可能是由于每個(gè)核殼結(jié)構(gòu)形貌、尺寸、殼厚度的微小差異導(dǎo)致。如圖7 所示，隨著ACh 濃度的增大，探針光譜的平均最大位移也不斷變大，Δλmax的平均值在5～25 nmol/L 之間呈良好的線性關(guān)系=-5.66 +1.95 CACh，R=0.997，實(shí)現(xiàn)了生物功能分子ACh 的定量分析檢測(cè)（圖8）。

圖7 不同ACh 濃度下的Au@AgNRs 的Δλmax 分布情況（左）和所對(duì)應(yīng)的暗場(chǎng)散射圖像（右）Fig.7 Δλmax distributions (left) and DFM images (right)of Au@AgNRs upon treatment with different concentration of ACh

圖8 Δλmax 的平均值與乙酰膽堿濃度的關(guān)系曲線Fig.8 Calibration plot corresponding to the mean Δλmax with the ACh concentration

3 結(jié)論

本工作合成了一種金核銀殼的納米棒材料，基于該材料的等離子體共振特性和生物酶對(duì)生物功能分子ACh 的催化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)散射光譜的變化對(duì)乙酰膽堿的定量檢測(cè)分析。該方法簡(jiǎn)便易行，所需探針設(shè)計(jì)及制備方便，成本低，為構(gòu)建高靈敏的檢測(cè)探針提供了新思路。