李曉芳 劉慧燕 潘琳 艾治宇 李一鳴 張恒 方海田

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

L-異亮氨酸是支鏈氨基酸之一，也是人體必需氨基酸，在食品、醫(yī)藥、化工和飼料領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，而且它的需求量逐年增加［1］。目前L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法主要是發(fā)酵法，增加L-異亮氨酸產(chǎn)量的方法主要通過(guò)代謝途徑進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，Shi 等［2］通過(guò)過(guò)表達(dá)ppc和lysC來(lái)增加L-異亮氨酸的前體物質(zhì)產(chǎn)量從而提高L-異亮氨酸產(chǎn)量；Dong等［3］通過(guò)敲除ddh和 lysE解除蘇氨酸和L-異亮氨酸的反饋抑制來(lái)提高L-異亮氨酸的產(chǎn)量；還有研究通過(guò)控制當(dāng)量生物素、分析代謝流上的關(guān)鍵酶及分子能量作用，來(lái)進(jìn)一步提高L-異亮氨酸產(chǎn)量［4-6］。目前國(guó)內(nèi)L-異亮氨酸的生產(chǎn)效率并不能滿足當(dāng)前我國(guó)日益增長(zhǎng)的需求，與日本等國(guó)家還有很大的差距，因此選育高產(chǎn)量的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題［7］。

常溫常壓等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種技術(shù)是一種微生物基因組高效快速誘變育種技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、成本低、效率高、突變條件溫和，目前已被用于多種微生物的生物育種［8］，Cheng 等［9］利用 ARTP成功選育了高產(chǎn)L-精氨酸菌株；Qiang 等［10］利用ARTP成功選育高產(chǎn)番茄紅素菌株；Li 等［11］利用ARTP成功選育高產(chǎn)花生四烯酸菌株；Zhang 等［12］利用ARTP成功選育高產(chǎn)木糖醇酵母菌。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)主要以搖瓶、多孔板、深孔板等容器為主，難于控制實(shí)驗(yàn)操作的一致性，目前高通量篩選主要應(yīng)用在藥物上［13］，而食品上應(yīng)用的高通量篩選仍是傳統(tǒng)的多孔篩選［14］。MMC的微液滴培養(yǎng)體系能充分實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)操作的一致性，精準(zhǔn)高效的控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程，是高通量篩選的新技術(shù)，目前應(yīng)用非常少，幾乎沒(méi)有報(bào)導(dǎo)。在L-異亮氨酸的合成途徑中，蘇氨酸脫氫酶是L-異亮氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，異亮氨酸對(duì)其有反饋抑制作用［15］，選育α-AB的抗性突變菌，可解除異亮氨酸對(duì)蘇氨酸脫氫酶的反饋抑制作用，從而提高異亮氨酸的產(chǎn)量［16］，在得到大量突變菌體的基礎(chǔ)上，利用MMC實(shí)現(xiàn)高通量篩選。

本研究以大腸桿菌K12（Met-）作為出發(fā)菌株，采用ARTP誘變技術(shù)進(jìn)行多輪誘變，以異亮氨酸的結(jié)構(gòu)類似物α-AB作為抗性標(biāo)記，使用MMC進(jìn)行高通量液滴篩選，進(jìn)行高通量適應(yīng)性進(jìn)化和發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩，獲得一株高產(chǎn)L-異亮氨酸的誘變大腸桿菌突變菌株，對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，并在搖瓶發(fā)酵條件下對(duì)L-異亮氨酸進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株與試劑 大腸桿菌K12（Met-），寧夏大學(xué)食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

無(wú)水乙醇、冰乙酸、乙腈、2，4 - 二硝基氟苯（均為分析純）。

1.1.2 培養(yǎng)基（g/L） （1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，瓊脂粉 15.0，pH7.0-7.2，121℃ 條件下滅菌15 min。（2）種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH7.0-7.2，121℃條件下滅菌15 min。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100.0，磷酸二氫鉀3.0，玉米漿20.0，碳酸鈣2.0，硫酸銨20.0，硫酸鎂 2.5，硫酸亞鐵 0.01，pH7.0-7.2，121℃ 條件下滅菌 15 min［17］。

1.1.3 相關(guān)溶液配制 L-異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液、α-AB母液、NaCO3-NaHCO3緩沖液、10%乙酸溶液、苯酚紅溶液。

1.1.4 儀器與設(shè)備 ARTP常溫常壓等離子體誘變育種儀、全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)儀：無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；SBA生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；Easysep1010高效液相色譜儀：上海通微分析技術(shù)有限公司；AgilentC18（25 mm×4.6 mm，3.5 μm）：安捷倫科技有限公司；WFZ UV-2000紫外分光光度計(jì)：尤尼科儀器有限公司；生化恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；恒溫?fù)u床：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備；超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；LDZX-40滅菌鍋：上海三申。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及培養(yǎng) 將保存在 -80℃ 冰箱的大腸桿菌K12（Met-）劃線接種于LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)1 d；挑去平板上的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)16 h，制成OD600值為0.6-0.8的菌懸液，加入10%甘油，放入超凈工作臺(tái)備用。

1.2.2 菌株ARTP誘變時(shí)間的確定 將ARTP的溫度保持在20℃，調(diào)節(jié)功率100 W，氦氣流量為10 L/min［18］。吸取10 μL菌懸液均勻涂在金屬載片上，將載片用鑷子放入誘變室內(nèi)，采用不同的時(shí)間（0 s、30 s、60 s、90 s、150 s、180 s、240 s）對(duì)菌液進(jìn)行誘變處理，誘變后的菌體在1 mL超純水中充分洗脫1 min后，取100 μL涂布于LB培養(yǎng)基平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)［19］，根據(jù)計(jì)算的致死率，確定最佳誘變時(shí)間。

1.2.3 單因素多水平確定α-AB最高使用濃度 將配制好的1 mol/L的α-AB按要求裝入MMC 化學(xué)因子進(jìn)樣瓶中，菌液進(jìn)樣瓶裝好菌液，培養(yǎng)基進(jìn)樣瓶裝好液體LB培養(yǎng)基。按照儀器操作流程進(jìn)行操作，將化學(xué)因子進(jìn)樣瓶中溶液設(shè)置8個(gè)濃度梯度分別為 0%、9.375%、19.5312%、29.6875%、39.8438%、50%、59.375%、100%，每個(gè)濃度梯度設(shè)置5個(gè)平行，共創(chuàng)建40個(gè)液滴。液滴培養(yǎng)24 h后，選擇最高適應(yīng)濃度長(zhǎng)得比較好的液滴進(jìn)行液滴收集，將收集好的液滴用生理鹽水稀釋至10-2，將其分別涂布于抗性篩選平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取比較圓而且大的單菌落接至液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，備用。

1.2.4 突變菌株的適應(yīng)性進(jìn)化 將單因素多水平篩選培養(yǎng)好的菌液吸取600 μL于10 mL液體培養(yǎng)基中，裝入MMC 菌液進(jìn)樣瓶中，化學(xué)因子進(jìn)樣瓶裝入1 mol/L的α-AB，培養(yǎng)基進(jìn)樣瓶裝好液體LB培養(yǎng)基，按照儀器操作流程進(jìn)行操作，將化學(xué)因子進(jìn)樣瓶中溶液設(shè)置8個(gè)濃度梯度分別為0%、2.778%、9.735%、16.667%、28.054、48.002%、58%、98.883%，每個(gè)濃度梯度3個(gè)平行，8 h傳一代，共創(chuàng)建48個(gè)液滴。液滴培養(yǎng)48 h后，收集在最高濃度梯度長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株經(jīng)稀釋后涂布在抗性平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取比較圓而且大的單菌落接至液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，備用，并將該收集好的菌株送至上海生工測(cè)序。

1.2.5 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 將原始菌株和篩選得到的高產(chǎn)L-異亮氨酸的誘變菌株分別接于種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h；按10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，利用高效液相色譜儀分別測(cè)定其L-異亮氨酸的產(chǎn)量。

1.2.6 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變株的遺傳穩(wěn)定性 將誘變后的菌株活化后配制OD600值不超過(guò)1.0的菌懸液裝入MMC機(jī)器的菌液進(jìn)樣瓶中，化學(xué)因子進(jìn)樣瓶、培養(yǎng)基進(jìn)樣瓶按照儀器操作要求只裝LB液體培養(yǎng)基，將適應(yīng)性進(jìn)化頁(yè)面的化學(xué)因子濃度梯度都設(shè)為0%，傳代時(shí)間設(shè)為8 h，連續(xù)傳10代觀察其生長(zhǎng)狀況，分析生長(zhǎng)曲線同時(shí)收集每一代長(zhǎng)勢(shì)較好的液滴保存進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ARTP最佳誘變時(shí)間的確定

致死率的選擇直接影響菌株的突變率，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同的誘變時(shí)間，計(jì)算誘變時(shí)間對(duì)大腸桿菌致死率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，當(dāng)誘變時(shí)間為90 s時(shí)，菌株致死率達(dá)到86.92%；當(dāng)誘變時(shí)間為150 s時(shí)，菌株致死率達(dá)到90.65%；當(dāng)誘變時(shí)間為180 s時(shí)，菌株致死率達(dá)到98.13%；當(dāng)誘變時(shí)間為240 s時(shí)，菌株致死率達(dá)到100%。因此選擇致死率在98%以上的180 s為最佳誘變時(shí)間。

圖1 大腸桿菌ARTP誘變致死率曲線Fig. 1 Lethality curve of Escherichia coli ARTP mutagenesis

2.2 α-AB最高使用濃度的確定

適應(yīng)結(jié)構(gòu)類似物濃度的確定可以初步判斷該菌株解除反饋抑制的能力。本實(shí)驗(yàn)利用MMC對(duì)α-AB的使用濃度進(jìn)行單因素多水平實(shí)驗(yàn)，從圖2中可以看出，當(dāng)α-AB的使用濃度在前兩個(gè)濃度時(shí)，所有液滴OD值在0.87左右，說(shuō)明該濃度下菌體均能正常生長(zhǎng)，隨著α-AB的使用濃度增大，第3個(gè)濃度的大部分OD值在0.46左右，極少數(shù)液滴OD值接近0.50，其余液滴OD值在0.40左右；當(dāng)α-AB的使用濃度在第4個(gè)濃度時(shí)，只有極個(gè)別液滴的OD值達(dá)到0.50左右，其余液滴的OD值均為負(fù)值，這表明該濃度已經(jīng)對(duì)菌株產(chǎn)生了毒害作用；第5個(gè)到第8個(gè)濃度，所有液滴的OD值均為負(fù)值，這說(shuō)明該4個(gè)濃度條件下，菌株不能生長(zhǎng)。因此，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，α-AB的最高使用濃度為第4個(gè)濃度29.6875%。

圖2 大腸桿菌NXU12單因素多水平曲線Fig. 2 Single-factor multi-level curve of E. coli NXU12

2.3 突變菌株適應(yīng)性進(jìn)化結(jié)果

研究表明，在菌株可以正常生長(zhǎng)的范圍內(nèi)，α-AB使用濃度越高，L-異亮氨酸積累的量就越多，L-異亮氨酸解除自身濃度反饋效果越明顯，因此L-異亮氨酸產(chǎn)量會(huì)更高。本實(shí)驗(yàn)利用誘變后的菌株，在確定其可適應(yīng)的α-AB最高使用濃度基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在α-AB的使用濃度低于第5個(gè)濃度時(shí)，所有液滴OD值均在0.67左右，長(zhǎng)勢(shì)基本一致，只有2號(hào)液滴OD值明顯增大接近于0.8；在α-AB的使用濃度接近第6個(gè)濃度時(shí)，大部分液滴OD值明顯減小均在0.12左右，只有2、3號(hào)液滴OD值明顯增大達(dá)到1.35、1.78，這說(shuō)明2、3號(hào)液滴已經(jīng)適應(yīng)當(dāng)前濃度并且長(zhǎng)勢(shì)明顯變好；當(dāng)α-AB的使用濃度大于第6個(gè)濃度時(shí)，所有液滴的OD值均無(wú)變化，說(shuō)明此濃度對(duì)菌體本身產(chǎn)生毒害作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該突變菌株經(jīng)適應(yīng)性進(jìn)化后，α-AB的使用濃度為第6個(gè)濃度48.002%。

圖3 大腸桿菌NXU12適應(yīng)性進(jìn)化曲線Fig. 3 Adaptive evolution curve of E. coli NXU12

2.4 菌株測(cè)序結(jié)果

為驗(yàn)證適應(yīng)性進(jìn)化所得到的菌株是否為突變株，將該菌株制成菌懸液送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序基因?yàn)?ilvA，測(cè)序結(jié)果利用軟件分析后如圖4所示。圖 4 中紅色箭頭為大腸桿菌 K12，綠色箭頭為大腸桿菌 NXU12，測(cè)序結(jié)果相同性為81.15%，從圖中可以看出，大腸桿菌 NXU12 發(fā)生了大量基因的突變，這可能是導(dǎo)致該菌株可以適應(yīng)高濃度α-AB的原因。

圖4 大腸桿菌K12、NXU12測(cè)序結(jié)果Fig. 4 Sequencing results of E. coli K12 and NXU12

2.5 高產(chǎn)L-異亮氨酸菌株NXU12發(fā)酵結(jié)果

將原始菌株K12、誘變菌株NXU12進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，采用分批補(bǔ)料的發(fā)酵方法，發(fā)酵期間保持pH在7.0-7.2之間、期間補(bǔ)充60%的葡萄糖溶液以保證菌體能夠正常生長(zhǎng)、補(bǔ)充尿素保證碳源充足。連續(xù)發(fā)酵40 h后，耗糖曲線如圖5所示，采用2，4 -二硝基氟苯法進(jìn)行柱前衍生化處理，利用高效液相色譜儀（HPLC）檢測(cè)發(fā)酵液中L-異亮氨酸的濃度，結(jié)果如圖6所示。

圖5 大腸桿菌K12、NXU12耗糖量曲線Fig. 5 Sugar consumption curve of E. coli K12 and NXU12

從圖5可以看出，從發(fā)酵開(kāi)始大腸桿菌NXU12的耗糖量略高于K12；在發(fā)酵中期兩株菌的耗糖量趨勢(shì)基本一致，這可能是NXU12發(fā)生突變后并沒(méi)有影響其自身生長(zhǎng)；發(fā)酵后期K12的耗糖量基本穩(wěn)定，而NXU12的耗糖量呈微量上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镹XU12突變，在發(fā)酵后期菌體仍然可以正常生長(zhǎng)，正常消耗糖。

從圖6可以看出，NXU12發(fā)酵40 h后，L-異亮氨酸的濃度為17.468 2 g/L，比原始菌株提高了61.23%。NXU12在發(fā)酵中后期L-異亮氨酸積累量較高，這可能是因?yàn)镹XU12可以適應(yīng)高濃度的α-AB，在發(fā)酵過(guò)程中解除了L-異亮氨酸對(duì)蘇氨酸脫氫酶的反饋抑制，從而使L-異亮氨酸不斷積累濃度提高。

圖6 大腸桿菌K12、NXU12 L-異亮氨酸濃度Fig. 6 E. coli K12 and NXU12 L-isoleucine concentration

2.6 大腸桿菌遺傳穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

將突變菌株大腸桿菌NXU12連續(xù)傳10代后，收集長(zhǎng)勢(shì)比較好的液滴進(jìn)行生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵液中L-異亮氨酸濃度測(cè)定。從圖7可以看出，傳10代后的大腸桿菌NXU12仍能正常生長(zhǎng)，從圖8可以看出該突變菌株發(fā)酵液中L-異亮氨酸濃度穩(wěn)定，這說(shuō)明誘變菌株遺傳穩(wěn)定性良好。

圖7 大腸桿菌NXU12傳10代后生長(zhǎng)曲線Fig. 7 Growth curve of E. coli NXU12 after 10 generations

圖8 大腸桿菌NXU12傳10代L-異亮氨酸濃度Fig. 8 L-isoleucine concentration of E. coli NXU12 for 10 generations

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)ARTP結(jié)合MMC生物誘變及高通量篩選體系，以α-AB為抗性標(biāo)記定向選育L-異亮氨酸高產(chǎn)大腸桿菌，最終成功選育出一株可在α-AB濃度為 48.002% 即 49.44 g/L條件下正常生長(zhǎng)的突變菌株大腸桿菌NXU12。該菌株搖瓶發(fā)酵 40 h后，L-異亮氨酸濃度為17.462 8 g/L，較原始菌株提高了60.23%，此外通過(guò)測(cè)定了發(fā)酵液中L-蘇氨酸的濃度發(fā)現(xiàn)，L-蘇氨酸的濃度明顯比原始菌株提高，這說(shuō)明高濃度的α-AB可激活天冬氨激酶從而解除蘇氨酸脫氫酶的反饋抑制增加L-異亮氨酸前體物質(zhì)蘇氨酸的積累量?？讕浀龋?0］利用ARTP 成功選育高產(chǎn)L-異亮氨酸谷氨酸棒桿菌B1，該菌株搖瓶發(fā)酵L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)18.5g/L，比原始菌株提高62.03%；Sun等［21］突變了異亮氨酸-tRNA合成酶并構(gòu)建了基于氨?；鵷RNA合成酶全細(xì)胞傳感器，該傳感器可特異性識(shí)別產(chǎn)高濃度L-異亮氨酸的細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)高通量篩選。L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株的選育需要從更精準(zhǔn)的方向深入研究，精準(zhǔn)高效的高通量篩選方式也是選育高產(chǎn)菌株的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

通過(guò)ARTP結(jié)合MMC篩選出一株可適應(yīng)高濃度α-AB的抗性突變菌株NXU12，經(jīng)發(fā)酵測(cè)得該菌株產(chǎn)L-異亮氨酸濃度提高了1.61倍，經(jīng)基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)ilvA部分堿基發(fā)生突變，但遺傳穩(wěn)定性良好，可作為L(zhǎng)-異亮氨酸生產(chǎn)備用菌株或構(gòu)建L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株的底盤菌株。等離子誘變結(jié)合高通量篩選不僅提高了篩選高產(chǎn)菌株的效率，而且為篩選其他抗性菌株、高產(chǎn)氨基酸菌株提供重要參考。