康子清 張銀龍，2 吳永波，2 謝冬 薛建輝 華建峰

（1. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué)江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 2100037；3. 中國(guó)科學(xué)院江蘇省植物研究所（南京中山植物園），南京 210014）

生物多樣性是地球上的生物與其生存環(huán)境形成的生態(tài)復(fù)合體以及與此相關(guān)的各種生態(tài)過(guò)程的總和，維持著全人類(lèi)所依賴(lài)的所有尺度上的生態(tài)系統(tǒng)，其變化會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響，并通過(guò)生態(tài)服務(wù)系統(tǒng)進(jìn)而影響人類(lèi)獲取福利的大?。?］。由于人類(lèi)活動(dòng)加劇，對(duì)自然環(huán)境干擾加強(qiáng)，全球生物多樣性持續(xù)下降成為了21世紀(jì)人類(lèi)面臨的挑戰(zhàn)之一［2］。保護(hù)生物多樣性，做到防患于未然的第一步就是要做好生物多樣性監(jiān)測(cè)。目前幾乎所有防止外來(lái)物種入侵、保護(hù)生物多樣性的措施都依賴(lài)于物種監(jiān)測(cè)，物種監(jiān)測(cè)是監(jiān)測(cè)生物多樣性與生態(tài)環(huán)境變化中應(yīng)用最為廣泛的方法［3-4］。然而物種監(jiān)測(cè)傳統(tǒng)上依賴(lài)于物理識(shí)別，即通過(guò)物種其獨(dú)特的形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行目視調(diào)查計(jì)數(shù)。這種傳統(tǒng)的物理識(shí)別有兩個(gè)弊端，其一是需要非常專(zhuān)業(yè)的分類(lèi)學(xué)知識(shí)［5］；其二是部分傳統(tǒng)的調(diào)查方法會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境有所破壞，尤其是海洋調(diào)查［5-6］。可見(jiàn)傳統(tǒng)的物種監(jiān)測(cè)方法已然限制了全球生物多樣性的研究與環(huán)境保護(hù)工作，因此急需新技術(shù)來(lái)進(jìn)行大規(guī)模的生物多樣性監(jiān)測(cè)與研究。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)不斷的發(fā)展，誕生了可以快速進(jìn)行生物多樣性監(jiān)測(cè)的環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)，對(duì)傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)技術(shù)過(guò)程中存在的難題提供了一種方便快捷的解決方法，在大規(guī)模的生物多樣性監(jiān)測(cè)與研究中展現(xiàn)出了很好的應(yīng)用前景。本文概述了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)操作流程，并從水環(huán)境、土壤環(huán)境與空氣環(huán)境的角度對(duì)國(guó)內(nèi)外環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)研究進(jìn)行了總結(jié)，以期能為后續(xù)生物多樣性研究與監(jiān)測(cè)研究提供新的思路和啟發(fā)。

1 環(huán)境DNA與環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)

環(huán)境DNA是指生物體內(nèi)活細(xì)胞和胞外DNA衰落死亡或細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，最終排放到環(huán)境中且不對(duì)任何目標(biāo)生物進(jìn)行分離的DNA［7-8］。最早于19世紀(jì)80年代由美國(guó)科學(xué)家Ogram等［9］提出，他在沉積物實(shí)驗(yàn)中首次提取出微生物DNA，但直到20世紀(jì)后環(huán)境DNA的概念才得到學(xué)者的廣泛認(rèn)可。

基于DNA的物種鑒定方法的出現(xiàn)也為后續(xù)環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的發(fā)明與發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。Hebert等［10］于2003年首次提出了DNA條形碼技術(shù)，認(rèn)為可以通過(guò)一種基因序列來(lái)鑒別不同物種，他利用動(dòng)物線粒體中的細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基（COI）基因?qū)?3 320個(gè)動(dòng)物物種進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)其基因序列可以區(qū)分所研究物種。隨后DNA條形碼的概念被引入植物學(xué)、微生物學(xué)中。DNA條形碼技術(shù)是利用不同物種在特定基因上存在的差別來(lái)進(jìn)行物種鑒別的技術(shù)［10-11］。區(qū)別于傳統(tǒng)的物種監(jiān)測(cè)技術(shù)，DNA條形碼技術(shù)更加快捷、準(zhǔn)確以及對(duì)操作者要求更低，因此該技術(shù)在物種鑒別方面得到了廣泛的應(yīng)用。

雖然DNA條形碼技術(shù)提供了一種新的物種鑒定技術(shù)手段，但也存在著比較大的局限性：首先DNA條形碼技術(shù)是利用完整的DNA來(lái)進(jìn)行單個(gè)物種鑒定，這是耗時(shí)且在某些情況下困難的；其次DNA條形碼在操作過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)DNA降解等問(wèn)題，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確度降低［12-13］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，誕生出了可以快速進(jìn)行生物多樣性監(jiān)測(cè)的環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)，在降低監(jiān)測(cè)工作量的基礎(chǔ)上，提升了監(jiān)測(cè)效率。例如，在湖泊中要檢測(cè)到相同數(shù)量的魚(yú)類(lèi)，使用88個(gè)刺網(wǎng)需要3 d，而使用環(huán)境DNA宏條形碼只需要4 h；對(duì)于地中海池塘中兩棲動(dòng)物的檢測(cè)，為獲得與單一環(huán)境DNA宏條形碼相似的檢測(cè)結(jié)果需要進(jìn)行4次檢測(cè)［14］。環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)通過(guò)提取水體、土壤、空氣中的環(huán)境DNA，使用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并高通量測(cè)序得到上千至上百萬(wàn)的讀數(shù)數(shù)據(jù)，并利用這些數(shù)據(jù)確定物種存在，進(jìn)行生物多樣性評(píng)估［15］。

2 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的研究方法

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)操作主要包括：樣品采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序、序列對(duì)比與物種注釋等環(huán)節(jié)。

2.1 樣品采集

環(huán)境DNA樣本主要來(lái)源于水體、土壤以及空氣等。樣品采集的核心問(wèn)題是要盡可能的獲取并保存目標(biāo)物的環(huán)境DNA。但由于環(huán)境DNA的分布會(huì)受季節(jié)［16］、周?chē)匀画h(huán)境［17］壓力等因素的影響，不同的采樣方案與采樣方式對(duì)不同來(lái)源的環(huán)境DNA有著不同的收集能力［18］。因此不同特征的環(huán)境類(lèi)型需要設(shè)計(jì)針對(duì)性的采樣方案。對(duì)于流動(dòng)水體，例如溪流，由于其具有混合良好的湍流，因此表層水即可用于環(huán)境DNA檢測(cè)［19］；對(duì)于類(lèi)似湖泊這樣的靜止系統(tǒng)，沿河岸線進(jìn)行采樣可以捕獲大多數(shù)的環(huán)境DNA［18］。目前各環(huán)境中樣品采集還沒(méi)有統(tǒng)一采樣標(biāo)準(zhǔn)，例如空氣環(huán)境微生物采集可以采取慣性撞擊類(lèi)、過(guò)濾阻留類(lèi)、靜電沉著類(lèi)和溫差迫降類(lèi)等多種方法［20］。這些方法各有利弊，需根據(jù)研究目的選擇合適的采樣方法。

采樣之后要對(duì)環(huán)境DNA進(jìn)行保存，有研究證明環(huán)境DNA降解速度很快，一般在48 h內(nèi)超出檢測(cè)范圍，同時(shí)在野外條件下環(huán)境DNA的降解速度將更快［21］。但在低溫［22］、低 UV-B［23］、堿性［24］條件下環(huán)境DNA分解速度較慢。因此在采樣結(jié)束后通常加入乙醇或Longmire緩沖液，前者通過(guò)使細(xì)菌細(xì)胞脫水和蛋白質(zhì)變性來(lái)保存環(huán)境DNA；后者利用EDTA與SDS抑制酶活性、疊氮化鈉抑制細(xì)菌生長(zhǎng)［25］。近年也有學(xué)者提出用丙二醇防凍劑代替乙醇，可以繞過(guò)漫長(zhǎng)的蒸發(fā)步驟，離心后的樣品可以直接、迅速地提取出DNA樣品，以避免在處理樣本過(guò)程中抑制DNA提取或PCR擴(kuò)增［26］。最后將樣品保存于-20℃的冰箱待測(cè)。

2.2 DNA提取

有研究對(duì)水樣中環(huán)境DNA的提取進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，除少部分實(shí)驗(yàn)使用溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、酚-氯仿-異戊醇（PCI）或高鹽法提取環(huán)境DNA，大多數(shù)研究采用DNA提取試劑盒進(jìn)行環(huán)境DNA提?。?7］。DNA提取試劑盒是依照氯化芐法所構(gòu)造的，讓核酸溶于特定溶液中，使其在固相介質(zhì)內(nèi)部相互吸附并洗滌去除雜質(zhì)，通過(guò)變更溶液環(huán)境使DNA能夠在TE緩沖液或純水中溶解［28］。

土壤DNA提取的主要方法有SDS高鹽提取法、裂解酶法、TENS法與試劑盒法等。但與其他環(huán)境中的DNA提取不同，土壤中含有大量的腐殖酸類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)在提取過(guò)程中無(wú)法被去除，基因組中殘留的腐殖酸類(lèi)物質(zhì)會(huì)抑制Tap聚合酶活性，進(jìn)而降低PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，需要進(jìn)行DNA純化［29］。由于試劑盒法兼顧DNA的提取與純化，因此在土壤環(huán)境DNA宏條形碼中使用最為廣泛。

空氣環(huán)境DNA提取同水體、土壤類(lèi)似，主要使用DNA提取盒。研究證明不同的試劑盒會(huì)影響細(xì)菌［30］、花粉［31］模擬群落的組成和數(shù)量，而對(duì)真菌［32］沒(méi)有影響。溶解細(xì)胞提取DNA時(shí)，由于花粉外壁層具有高度結(jié)構(gòu)完整性，而真菌對(duì)細(xì)胞壁有抗性，無(wú)效的細(xì)胞破壞只能增加脆弱單核細(xì)胞的DNA提取量，而不是增加抗性細(xì)胞的DNA提取量，所以需根據(jù)實(shí)際設(shè)計(jì)一種有效方法最大限度的提高DNA產(chǎn)量［33］。

2.3 PCR擴(kuò)增

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，用于放大與擴(kuò)增特定的DNA片段，因此PCR擴(kuò)增的第一步就是確定要擴(kuò)增的DNA片段。在理想情況下，DNA片段應(yīng)該滿(mǎn)足如下的標(biāo)準(zhǔn)：（1）特異性：同一物種中DNA片段需幾乎相同，不同物種之間不同；（2）一致性：該DNA片段需標(biāo)準(zhǔn)化，同一片段可以應(yīng)用于不同的分類(lèi)群中；（3）穩(wěn)定性：標(biāo)記需具有穩(wěn)定的引物結(jié)合位點(diǎn)，允許其在大量的群體中進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序［34］。盡管科學(xué)家多年來(lái)一直在各分類(lèi)單元中尋找共同的DNA條形碼，但為所有物種找到共同的條形碼是不可能的，動(dòng)物、植物、微生物在PCR擴(kuò)增過(guò)程中有著相應(yīng)的DNA條形碼。

Hebert等［10］于2003年首先將線粒體基因細(xì)胞色素C氧化酶第一亞基（COI）基因片段用作動(dòng)物的DNA條形碼擴(kuò)增區(qū)域。從此擴(kuò)增線粒體COI基因作為研究動(dòng)物的DNA條形碼得到了廣泛的應(yīng)用。但隨著研究的深入，單一基因序列導(dǎo)致物種分辨率不足的問(wèn)題逐漸引起了人們的重視，COI基因在兩棲爬行類(lèi)種內(nèi)歧化程度高，PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)使種間與種內(nèi)遺傳距離發(fā)生重疊現(xiàn)象［35］。且相比于單個(gè)DNA條形碼，多種DNA條形碼聯(lián)用可以提高物種檢出率［36］。目前動(dòng)物DNA條形碼的研究多采用COI基因，Cyt b 基因，18S rDNA 和 12S rRNA 等［37-39］。

由于植物的線粒體基因遺傳變異較慢、遺傳分化較小，導(dǎo)致COI種間差異較小，不適用于植物的DNA條形碼擴(kuò)增，而4個(gè)編碼基因區(qū)（matK、rbcL、rpoB和rpoC1）與3個(gè)非編碼間隔基因（atpF-atpH、trnH-psbA和psbK-psbI）都是可以用于植物DNA條形碼擴(kuò)增的區(qū)域［40］。2009年國(guó)際生命條形碼植物工作組從普遍性、序列質(zhì)量和物種鑒別水平評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上將植物葉綠體中的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基（rubisco large subunit，rbcL）和trnK基因中的成熟酶編碼（maturase K，matK）作為植物的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼片段［40］。此外，在實(shí)際運(yùn)用中核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）也得到了廣泛的使用［41］。

微生物DNA條形碼研究主要集中于真菌，經(jīng)過(guò)各國(guó)真菌學(xué)家對(duì)不同真菌類(lèi)群的不同基因序列研究篩選過(guò)后，于第四屆國(guó)際生命條形碼大會(huì)確定了ITS作為真菌的首選DNA條形碼，這是由于其是當(dāng)前真菌物種鑒別能力最高的單一DNA片段，分辨率可達(dá)72%，并且大小合適，擴(kuò)增成功率高［42］。

2.4 高通量測(cè)序

傳統(tǒng)的測(cè)序方法是由Sanger等于1977年發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法，但其只能對(duì)樣本進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序，不宜處理復(fù)雜的環(huán)境樣本［43］。直到2005年，出現(xiàn)了可以在大量環(huán)境樣本中恢復(fù)DNA序列，同時(shí)從多個(gè)模板讀取DNA的第二代高通量測(cè)序技術(shù)，相比于第一代測(cè)序技術(shù)速度更快，成本更低［44］。

2.5 序列對(duì)比與物種注釋

DNA宏條形碼技術(shù)的生物信息學(xué)分析包含5個(gè)核心步驟，即樣品分解、合并雙端測(cè)序讀數(shù)、質(zhì)量過(guò)濾、OTU管理和分配物種注釋。宏條形碼技術(shù)為了最有效的利用測(cè)序平臺(tái)的高容量流通池，通常將許多樣品復(fù)用合并到單個(gè)測(cè)序文庫(kù)中，首先使用測(cè)序適配器中的獨(dú)特寡核苷酸索引將序列分配回原始樣本［45］。之后需要將測(cè)序適配器與PCR引物等非生物信息移除，串聯(lián)重復(fù)序列，但在數(shù)十億堿基的情況下難免會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤［46］。質(zhì)量過(guò)濾就是降低噪音，即去除低質(zhì)量、嵌合體以及短于150 bp等的噪音序列。質(zhì)量過(guò)濾時(shí)的參數(shù)非常重要，序列質(zhì)量過(guò)濾嚴(yán)格可消除錯(cuò)誤讀數(shù)，維持正確的生物多樣性與物種豐度估計(jì)，但過(guò)于嚴(yán)格的參數(shù)會(huì)刪除過(guò)多的讀數(shù)，導(dǎo)致低豐度的物種難以監(jiān)測(cè)，不利于入侵物種的早期檢測(cè)，產(chǎn)生假陰性的錯(cuò)誤，通常最佳參數(shù)一般取決于研究目標(biāo)［47］。之后這些序列將會(huì)集中于一個(gè)指定的相似性閾值范圍內(nèi)（通常為97%），形成一個(gè)操作分類(lèi)單元（OTU），利用BLAST等工具查詢(xún)序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性最高的序列分類(lèi)進(jìn)行對(duì)比分析，分配物種注釋。

3 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用

環(huán)境DNA宏條形碼其快捷、準(zhǔn)確以及對(duì)自然環(huán)境破壞小的特點(diǎn)，擴(kuò)大了生物多樣性的研究范圍，讓更多的科研人員進(jìn)行生物多樣性研究與監(jiān)測(cè)，在水體［38，48-50］、陸地［51-53］、空氣［54-56］環(huán)境中得到了廣泛的應(yīng)用（圖1）。目前該技術(shù)已用于新西蘭生物安全和農(nóng)業(yè)的政府監(jiān)測(cè)項(xiàng)目［6］，歐洲標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)也將DNAqua-Net作為其一個(gè)常設(shè)工作組［57］。

圖1 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在水體、土壤、空氣中的應(yīng)用流程Fig.1 Application process of environmental DNA macrobarcoding technology in water，soil and air

3.1 水環(huán)境

水環(huán)境是環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)運(yùn)用最廣泛、最成熟的領(lǐng)域。早期研究集中于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)調(diào)查方法的比較，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是淡水環(huán)境還是海洋，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，操作相對(duì)便捷，對(duì)物種與棲息地的干擾也更小［37，39，58-59］。Ortega 等［60］在研究大型水生植物對(duì)海岸沉積物碳匯的貢獻(xiàn)率時(shí)，對(duì)比了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)的穩(wěn)定同位素方法，調(diào)查表明環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與穩(wěn)定同位素在大型植物碳匯貢獻(xiàn)方面結(jié)果相似，但在區(qū)分海洋大型植物類(lèi)群方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。Rivera等［61］使用海龜殼上的附生硅藻生物膜來(lái)推斷海龜?shù)男袨椋l(fā)現(xiàn)相對(duì)于傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)不僅可以應(yīng)用于生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，也可應(yīng)用于監(jiān)測(cè)大型脊椎動(dòng)物的活動(dòng)行為。

水環(huán)境中的環(huán)境DNA宏條形碼研究主要是通過(guò)水樣、生物樣本、沉積物這3種方式。水樣采集是水環(huán)境中環(huán)境DNA宏條形碼測(cè)試最常見(jiàn)的方法。正是水體中環(huán)境DNA的快速降解的特性，使其在瀕危物種保護(hù)與監(jiān)測(cè)入侵物種方面非常有用，因?yàn)殛?yáng)性檢測(cè)與當(dāng)前存在的物種與種群有關(guān)，而過(guò)去存在物種的環(huán)境DNA將不會(huì)被發(fā)現(xiàn)。目前被用于監(jiān)測(cè)瀕危的巴西青蛙（Hylodes）［62］、鰻鱺［63］，與入侵物種亞洲鯉魚(yú)［64］、克氏原螯蝦［65］等。利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)，部分地區(qū)建立了快速有效和環(huán)境友好的監(jiān)測(cè)方案，為生態(tài)保護(hù)政策的制定提供了科學(xué)依據(jù)。

除了采集水樣，還可通過(guò)直接采集生物樣本與生物膜，并將其分類(lèi)混合，從混合物中提取環(huán)境DNA進(jìn)行研究。Chain等［49］用大量浮游動(dòng)物樣本鑒定了加拿大海岸線和五大湖沿岸的海洋和淡水港口約400個(gè)后生動(dòng)物科的生物，其中30種之前從未被報(bào)道過(guò)。Sohlberg等［50］對(duì)地下296 m-798 m的地下水中的真菌群落進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)所有深度下均有真菌存在，且多樣性高于預(yù)期。環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)提高了分類(lèi)學(xué)分辨率，產(chǎn)生了更多對(duì)已鑒定物種的檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)通過(guò)生物樣本可以表征任何規(guī)模生物體的復(fù)雜群落，并且可使用多個(gè)引物實(shí)現(xiàn)最佳監(jiān)測(cè)覆蓋范圍。

相較水樣和生物樣本而言，沉積物多被作為古代DNA的主要來(lái)源，研究過(guò)去的生態(tài)環(huán)境與生物多樣性［66-67］，且可追溯至 12.6 萬(wàn)年以前［68］。相比于通過(guò)花粉與化石研究古代生態(tài)系統(tǒng)的傳統(tǒng)方法更加省時(shí)省力、準(zhǔn)確。這些對(duì)過(guò)去生態(tài)系統(tǒng)的研究在制定未來(lái)保護(hù)規(guī)劃、建立氣候變化模型，以及評(píng)估生物多樣性的人為影響等方面具有重要作用［15］。同時(shí)環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的運(yùn)用，使得之前傳統(tǒng)方法調(diào)查非常困難的海洋沉積物變得簡(jiǎn)單了起來(lái)［69］，且在生物多樣性評(píng)價(jià)中有著巨大的潛力［70-71］。

如今該技術(shù)被用來(lái)研究環(huán)境中的物種和群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而評(píng)價(jià)環(huán)境質(zhì)量與健康狀況。例如通過(guò)研究真核生物和細(xì)菌指示類(lèi)群的變化研究河口與沿海環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)負(fù)荷［72］；通過(guò)分析細(xì)菌、原生生物和后生動(dòng)物的群落演替，研究河北石油公司溢油事故對(duì)沿海生態(tài)系統(tǒng)造成的長(zhǎng)期的生態(tài)影響［73］；通過(guò)監(jiān)測(cè)浮游植物的生物多樣性與完整性指數(shù)，綜合評(píng)價(jià)太湖水生生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境質(zhì)量與健康［74］等。這些研究工作提供了一個(gè)全面的、標(biāo)準(zhǔn)化的方法，能夠以更快的時(shí)間和更低的成本進(jìn)行生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)估。

3.2 土壤環(huán)境

土壤環(huán)境DNA宏條形碼起始于2009年，Buée等［75］利用土壤樣本評(píng)估了6種不同森林土壤中真菌的豐度與多樣性，結(jié)果均高于預(yù)設(shè)，展現(xiàn)出了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在土壤環(huán)境中良好的研究前景。

陸地的環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)研究可以通過(guò)土壤、根系、生物樣本等方式，但主要都集中在生物頻繁接觸的土壤樣本上［15］。Bienert等［51］通過(guò)環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)設(shè)計(jì)2個(gè)特異性引物（約30 bp和70 bp），對(duì)法國(guó)阿爾卑斯山發(fā)現(xiàn)的14種蚯蚓建立了線粒體DNA（mtDNA）16S基因的參考數(shù)據(jù)庫(kù)，可以更容易地從土壤樣本中識(shí)別出蚯蚓的種類(lèi)。Andersen等［76］利用丹麥野生動(dòng)物園、動(dòng)物園和農(nóng)場(chǎng)的全pH范圍［（6.2-8.3）±0.2］的土壤樣本監(jiān)測(cè)脊椎動(dòng)物生物多樣性，為傳統(tǒng)的生物多樣性調(diào)查提供了一種快速的替代方法。

植物根系研究中最困難的環(huán)節(jié)是對(duì)不同植物根系的精準(zhǔn)識(shí)別［77］。隨著高通量技術(shù)發(fā)展，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)被用于植物根系研究。Lamb等［78］對(duì)trnL引物進(jìn)行了修改，成功對(duì)溫帶草原與北極苔原生態(tài)的根系樣本進(jìn)行了識(shí)別。根系也在構(gòu)建微生物群落中起著重要作用，Khaliq等［79］分別通過(guò)傳統(tǒng)方法與環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測(cè)疫霉菌，結(jié)果在檢測(cè)到的30個(gè)疫霉菌系統(tǒng)類(lèi)型中只有7個(gè)是通過(guò)傳統(tǒng)方法檢測(cè)到的，研究表明根系是檢測(cè)疫霉菌群落的最佳樣本。這些研究均體現(xiàn)了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)巨大的應(yīng)用潛力，不僅為土壤根系研究提供了新方法，也為進(jìn)一步研究植物根系的生態(tài)功能開(kāi)啟了新視角。

土壤環(huán)境中，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)也可利用生物樣本進(jìn)行研究。Horton等［52］結(jié)合COI基因與核糖體18S rRNA基因設(shè)計(jì)引物分析無(wú)脊椎動(dòng)物樣本，成功鑒定了馬尼斯蒂?lài)?guó)家森林無(wú)脊椎動(dòng)物的生物多樣性。Singer等［80］利用18S rRNA的V9區(qū)域，通過(guò)凋落物或苔蘚樣本調(diào)查高山環(huán)境中頂復(fù)動(dòng)物亞門(mén)的生物多樣性，進(jìn)而推導(dǎo)生態(tài)系統(tǒng)中后生動(dòng)物尤其是無(wú)脊椎動(dòng)物的生物多樣性。該研究也表明基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)推斷寄主-寄生物關(guān)系，是一種探索未知類(lèi)群多樣性、推斷潛在寄主-寄生物或其他生物相互作用的有效方法。推導(dǎo)寄主-寄生物和群落的評(píng)估，正是一個(gè)對(duì)生物多樣性監(jiān)測(cè)至關(guān)重要，且很難用傳統(tǒng)方法辨別的研究領(lǐng)域［15］。

在土壤環(huán)境的生態(tài)監(jiān)測(cè)中特別值得關(guān)注的是環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的一種獨(dú)特的監(jiān)測(cè)方法，利用該方法可以通過(guò)監(jiān)測(cè)某種生物間接對(duì)其他生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可監(jiān)測(cè)一些隱蔽與稀有的物種，結(jié)果可靠的同時(shí)成本也十分低廉。例如Schnell等［81］通過(guò)水蛭所吸食的血液在越南熱帶雨林環(huán)境中探索了哺乳動(dòng)物的生物多樣性，并發(fā)現(xiàn)了5種新的哺乳動(dòng)物。Calvignac等［53］將腐肉蠅的源DNA作為一種工具，對(duì)哺乳動(dòng)物生物多樣性進(jìn)行全面、經(jīng)濟(jì)且有效的評(píng)估。Thomsen等［82］通過(guò)對(duì)野生花卉進(jìn)行監(jiān)測(cè)來(lái)調(diào)查陸生節(jié)肢動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)這些節(jié)肢動(dòng)物來(lái)自67個(gè)科和14個(gè)目。如果沒(méi)有環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)，這樣的監(jiān)測(cè)是不可實(shí)現(xiàn)的。

土壤環(huán)境中環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)也可通過(guò)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的物種與群落結(jié)構(gòu)，綜合評(píng)價(jià)環(huán)境質(zhì)量與健康狀況。Yan等［83］利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)土壤里的真菌進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)分析，研究真菌對(duì)生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的反應(yīng)，監(jiān)測(cè)土壤恢復(fù)效果，強(qiáng)調(diào)環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)是一種非常有用的恢復(fù)監(jiān)測(cè)工具。Wangensteen等［84］利用多基因（18S和COI）分析3種入侵海藻增殖對(duì)西班牙國(guó)家公園沿海巖石群落的影響，并制定保護(hù)區(qū)的管理計(jì)劃用來(lái)防止或抵消它們的影響。眾多研究表明，相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在污染反應(yīng)研究中顯得更加敏感［85-87］。

3.3 空氣環(huán)境

傳統(tǒng)空氣生物學(xué)主要依靠培養(yǎng)基和顯微鏡評(píng)估生物多樣性與物種豐度。而環(huán)境DNA宏條形碼是一種無(wú)需培養(yǎng)的方法，可以檢測(cè)出不能在體外培養(yǎng)以及死亡或休眠的微生物［88］。因此提供了對(duì)空氣中微生物進(jìn)一步監(jiān)測(cè)、評(píng)估、比較和分類(lèi)的可能性。

空氣中環(huán)境DNA宏條形碼主要研究通過(guò)空氣傳播導(dǎo)致人與動(dòng)物過(guò)敏甚至感染的物質(zhì)，例如花粉和病原體等，近年多用于監(jiān)測(cè)城市屋頂和田間中捕獲的孢子樣本的組成［54-55，89-90］。Yamamoto 等［54］以植物病原微生物為研究對(duì)象，在美國(guó)康涅狄格州紐黑文一座5層建筑的屋頂上進(jìn)行了4個(gè)不同季節(jié)的空氣采樣，首次對(duì)空氣中真菌的組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)大氣中真菌多樣性比以往報(bào)道的要高，可與土壤環(huán)境的真菌多樣性相媲美，同時(shí)證明了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在大氣真菌生態(tài)學(xué)中的巨大潛力。Kraaijeveld等［56］研究了空氣中花粉粒的種類(lèi)組成，他們?cè)诤商m萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心主樓屋頂通過(guò)Burkard空氣顆粒采樣器收集空氣中的花粉，分別使用顯微鏡與環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)花粉進(jìn)行鑒定與定量分析，結(jié)果表明環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)比顯微鏡更易識(shí)別出致人過(guò)敏的植物花粉的來(lái)源，并且隨著該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，會(huì)允許更長(zhǎng)的trnL片段被測(cè)序，將進(jìn)一步提高分辨率與降低成本。

雖然大部分空氣環(huán)境的環(huán)境DNA宏條形碼研究發(fā)生在自然環(huán)境中，但該方法也可以用于室內(nèi)環(huán)境，特別是類(lèi)似于垃圾處理廠［91］、農(nóng)舍［92-93］這些工人每天接觸生物氣溶膠的場(chǎng)所，以及醫(yī)院［94］這種人口密集、空氣中存在大量致病微生物的地方。Tong等［94］就利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基法和環(huán)境DNA宏條形碼方法對(duì)醫(yī)院空氣中的微生物多樣性進(jìn)行了研究，測(cè)定了真菌、古菌、細(xì)菌和病毒的相對(duì)豐度，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)培養(yǎng)基法一次只能鑒定少量病原體不同，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)可以提供醫(yī)院環(huán)境中空氣傳播的微生物的完整分布情況。公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)也常通過(guò)空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)室內(nèi)的空氣質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)和管理，尤其是大學(xué)教學(xué)樓與兒童福利機(jī)構(gòu)［33］。Korpelainen等［95］對(duì)室內(nèi)導(dǎo)致人與動(dòng)物過(guò)敏的花粉多樣性與季節(jié)關(guān)系進(jìn)行了研究，在冬季與夏季都發(fā)現(xiàn)了其具有較高的多樣性。Coombs等［96］檢測(cè)了美國(guó)綠色環(huán)保房屋與非綠色環(huán)保房屋中空氣真菌的多樣性，結(jié)果顯示綠色環(huán)保并不改變室內(nèi)真菌群落。相信隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與其他互補(bǔ)方法的整合，必將提高空氣生物學(xué)研究的質(zhì)量和水平。

4 問(wèn)題與展望

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)作為一種快捷、準(zhǔn)確且對(duì)環(huán)境干擾小的物種監(jiān)測(cè)方法已經(jīng)受到了生態(tài)學(xué)家的廣泛應(yīng)用，雖然仍然存在著一些技術(shù)與應(yīng)用上的挑戰(zhàn)，但隨著環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，該技術(shù)有望成為一種標(biāo)準(zhǔn)的工具［97］。

4.1 采樣方案

樣品采集是進(jìn)行環(huán)境DNA宏條形碼研究的第一步，也是最易受影響的一步。環(huán)境DNA的有效性會(huì)隨季節(jié)變化［16］，分布會(huì)受到周?chē)匀画h(huán)境的限制［17］。不同的采樣方案也對(duì)不同來(lái)源的eDNA有著不同的收集能力，空間采樣設(shè)計(jì)深刻影響eDNA檢測(cè)，無(wú)論是定性還是定量［18］。因此我們要在采用中加入試點(diǎn)研究和適應(yīng)性抽樣，進(jìn)一步探究環(huán)境條件如何影響環(huán)境DNA對(duì)物種的檢測(cè)，并根據(jù)當(dāng)?shù)丨h(huán)境因地制宜的設(shè)計(jì)采樣方案。

4.2 偏向性

在進(jìn)行PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生偏向性［98］，出現(xiàn)未能監(jiān)測(cè)到當(dāng)前存在的生物類(lèi)群（假陰性），以及對(duì)缺失生物類(lèi)群的錯(cuò)誤觀察（假陽(yáng)性）等問(wèn)題［99］，使物種檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度降低，對(duì)生物多樣性與物種豐富度產(chǎn)生錯(cuò)誤的評(píng)估。建議對(duì)eDNA樣本進(jìn)行優(yōu)化分析，以嚴(yán)格監(jiān)測(cè)污染，提高檢測(cè)概率；增加PCR復(fù)制次數(shù)并將其合并，降低出現(xiàn)假陰性的風(fēng)險(xiǎn)［63］。使用過(guò)濾筒和注射器的現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾方法也可減少產(chǎn)生假陰性錯(cuò)誤，因?yàn)檫@種方法將獲得更完整的eDNA［100］。此外，牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies）于2014年推出的納米孔測(cè)序，被廣泛認(rèn)為是“真正的”第三代測(cè)序技術(shù)（thirdgeneration sequencing，TGS）［101］。相比于第二代測(cè)序技術(shù)，第三代測(cè)序技術(shù)無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可解決PCR擴(kuò)增偏向性等問(wèn)題。所以今后要大力發(fā)展第三代測(cè)序技術(shù)，并將環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與之結(jié)合。

4.3 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)

在目標(biāo)序列對(duì)比分析時(shí)，環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)需要一個(gè)高質(zhì)量、高準(zhǔn)確度的參考數(shù)據(jù)庫(kù)。許多研究證明數(shù)據(jù)庫(kù)的錯(cuò)誤或缺失，都會(huì)導(dǎo)致調(diào)查結(jié)果準(zhǔn)確度的下降［102-105］。而構(gòu)建這樣一個(gè)高質(zhì)量、高準(zhǔn)確度的數(shù)據(jù)庫(kù)是一項(xiàng)非常艱難的任務(wù)。此外，在全球范圍內(nèi)對(duì)一個(gè)大規(guī)模的參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析可能需要很長(zhǎng)的時(shí)間［106］。因此今后要不斷的去豐富并完善DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，提高其準(zhǔn)確度與可信度。

4.4 從定性到定量

對(duì)于目標(biāo)生物定量研究一直是環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)所面臨的主要挑戰(zhàn)［5］，自然環(huán)境中的生物與非生物因素都會(huì)影響環(huán)境DNA的來(lái)源與降解。盡管有研究在小規(guī)模上對(duì)目標(biāo)生物進(jìn)行了定量與半定量研究［107-109］，在大尺度上仍不適用［110］。但這些半定量研究也為我們提供了一種思路，若生物周?chē)h(huán)境DNA的分布規(guī)模隨降解力的變化而變化，那么參數(shù)化影響過(guò)程將是環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)定量研究的關(guān)鍵［111］。也有研究建議使用存在-缺失作為物種相對(duì)豐度的度量標(biāo)準(zhǔn)［112］。目前利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行定量研究仍有著巨大的挑戰(zhàn)性。

4.5 從研究到應(yīng)用

要將環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)長(zhǎng)期用于生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)，其成本是一個(gè)重要的考慮因素。盡管某些情況下多物種環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)可以通過(guò)評(píng)估目標(biāo)物種數(shù)量來(lái)彌補(bǔ)高成本這一缺點(diǎn)，但對(duì)于單個(gè)樣本的測(cè)序研究，其成本將大大高于傳統(tǒng)的定量PCR方法（qPCR、ddPCR）［113］。此外，若讓公眾參與到環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的調(diào)查中，需要更多“用戶(hù)友好”型的樣本收集與數(shù)據(jù)探索方法［97］。隨著大數(shù)據(jù)、云計(jì)算和人工智能等領(lǐng)域的快速發(fā)展，可將環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與機(jī)器學(xué)習(xí)、衛(wèi)星遙感等跨學(xué)科相結(jié)合，形成智能化的生態(tài)監(jiān)測(cè)與全球化的監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)［114］，使環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)向下兼容，得到更為廣泛的應(yīng)用。