張雪 譚玉萌 蔣海霞 楊廣宇

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

巖藻糖基修飾的糖復(fù)合物廣泛參與細(xì)胞粘附，炎癥反應(yīng)，免疫應(yīng)答和受精等多種生理活動(dòng)［1］。多種巖藻糖基化寡糖參與癌癥中的信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過(guò)程［2-3］，具有開發(fā)成為癌癥治療性疫苗的潛力，如Globo H-KLH疫苗已應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的二期臨床［4-5］，Lewis Y抗原的結(jié)合疫苗已被證明對(duì)癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)［6］。2′-巖藻糖基乳糖是母乳中的一類特殊益生元，占人乳寡糖成分的30%左右［7］，具有促進(jìn)嬰兒的大腦發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、炎癥抑制及抗病原微生物感染等作用［8-12］。2′-巖藻糖基乳糖已被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)為安全通用食品（GRAS），并被歐洲食品安全局（EFSA）批準(zhǔn)為新型食品（NF）［13］，可以作為嬰兒配方奶粉中添加的食品成分、膳食補(bǔ)充劑和醫(yī)藥成分。2016年開始，雅培和雀巢分別將含有2′-巖藻糖基乳糖成分的人乳寡糖成分引入銷售的嬰兒配方奶粉中。

α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是催化合成2′-巖藻糖基乳糖的關(guān)鍵生物催化劑［14］。2006 年，Drouillard等［15］首次在大腸桿菌中表達(dá)了來(lái)源于幽門螺桿菌Helicobacter pylori NCTC11639 的 α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FutC；2015年Chin等［16］利用FutC在大腸桿菌中對(duì)2′-巖藻糖基乳糖進(jìn)行了從頭合成；2017年南開大學(xué)的 Huang 等［17］對(duì) 11 種不同來(lái)源的 α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了比較，結(jié)果表明FutC對(duì)2′-巖藻糖基乳糖的合成產(chǎn)量是最高的。然而，野生型的FutC的催化活力仍較低，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

定向進(jìn)化是一項(xiàng)蛋白質(zhì)工程技術(shù)，通過(guò)突變及高通量篩選的循環(huán)，能夠有效提升酶的功能［18-19］。然而，由于糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖苷鍵形成并不直接產(chǎn)生熒光或吸光度的明顯變化，難以進(jìn)行高通量篩選，因此對(duì)于此類酶的進(jìn)化是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題。2006年Aharoni 等［20］提出一種針對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的FACS胞內(nèi)熒光捕獲策略，通過(guò)位于細(xì)胞膜上的乳糖透過(guò)酶（lactose permease，LacY）對(duì)酶催化熒光底物和產(chǎn)物之間的細(xì)胞膜通透性差異，實(shí)現(xiàn)了糖基轉(zhuǎn)移酶的高效篩選（圖1為應(yīng)用于FutC的FACS胞內(nèi)熒光捕獲策略）。本實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上引入了雙熒光底物系統(tǒng)，有效避免了由于篩選底物導(dǎo)致的假陽(yáng)性突變［21］。我們?cè)谇捌诠ぷ髦欣眠@一方法，獲得了催化活性顯著提升的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體［21-22］。在本研究中，拓展了上述篩選方法在α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用，利用能與α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FutC反應(yīng)的熒光受體底物，建立了針對(duì)FutC的FACS超高通量篩選方法，并利用定向進(jìn)化成功得到了活性提高的突變體。

圖1 熒光底物結(jié)構(gòu)和FACS篩選策略示意圖Fig. 1 Fluorescent substrate structure and the schematic diagram of FACS screening strategy

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 E. coli JM107 Nan-LacZ-用于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的超高通量篩選，該菌株敲除了nanA和lacZ兩個(gè)基因；E. coli 10G用于突變文庫(kù)的構(gòu)建，由本實(shí)驗(yàn)室保存。E. coli BL21（DE3）用于蛋白的表達(dá)純化，購(gòu)于北京全式金生物有限公司。質(zhì)粒pUC18和pUCKC18-FKP由本實(shí)驗(yàn)室保存，pUC18-FutC由韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)ByungGee Kim課題組贈(zèng)送，質(zhì)粒pET24a購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 PrimeSTAR Max Premix DNA聚合酶購(gòu)于日本TaKaRa公司；DreamTaq DNA聚合酶，堿性磷酸酶及限制性內(nèi)切酶購(gòu)于賽默飛公司；T4 DNA連接酶購(gòu)于NEB公司；Phanta Max Mix DNA 聚合酶購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。乳糖及巖藻糖購(gòu)于Sigma公司；GDP-巖藻糖及熒光乳糖由本實(shí)驗(yàn)室保存；1×PBS粉末購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈等液相用品購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

LB培養(yǎng)基：10 g/L NaCl，10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉。M9培養(yǎng)基：1×M9鹽溶液，2 mmol/L MgSO4，4 mmol/L葡萄糖，0.1 mmol/L CaCl2。SOC培養(yǎng)基：0.5 g/L NaCl，20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，20 mmol/L 葡萄糖。2YT培養(yǎng)基：4 g/L NaCl，16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母浸粉。

1.2 方法

1.2.1 FACS篩選方法的建立 構(gòu)建篩選專用的大腸桿菌菌株，將重組質(zhì)粒pUCKC18-FKP電擊轉(zhuǎn)化E.coli JM107 Nan-LacZ-感受態(tài)細(xì)胞，涂布氯霉素抗性LB平板。次日從平板上挑取單克隆送測(cè)序，測(cè)序正確的菌株為JM107 Nan-LacZ--pUCKC18-FKP。將JM107 Nan-LacZ--pUCKC18-FKP制備為電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，分別將質(zhì)粒pUC18和pUC18-FutC電轉(zhuǎn)化至JM107 Nan-LacZ--pUCKC18-FKP中，為篩選的陰性對(duì)照菌株和陽(yáng)性菌株。

為了測(cè)試FutC對(duì)于兩種熒光底物是否有催化活性，將FutC純酶加入如下反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μL，其中含有終濃度為5 mmol/L的GDP-巖 藻 糖，0.5 mmol/L的lactose-bodipy/lactosecoumarin，25 mmol/L（pH 5.6）的 HEPES，100 μg/mL的FutC純酶。37℃反應(yīng)3 h后，按照乙酸乙酯∶甲醇∶水=7∶2∶1的比例配制展層劑，TLC檢測(cè)熒光產(chǎn)物的生成。

將陰性對(duì)照菌株與陽(yáng)性菌株在氨芐青霉素/氯霉素雙抗性平板上劃線活化，挑取單克隆于含有100 μg/mL氨芐青霉素和25 μg/mL氯霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃ 220 r/min生長(zhǎng)過(guò)夜，次日按照4%的比例轉(zhuǎn)接至5 mL的M9液體培養(yǎng)基試管中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)至OD600（UV2 550測(cè)定）為0.8-1.0，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，20℃220 r/min誘導(dǎo)18 h，取2.4 mL菌液，4 000 r/min離心3 min，棄上清，將菌體加入如下反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為50 μL，其中含有終濃度為5 mmol/L的巖藻糖，0.5 mmol/L的lactose-bodipy/lactose-coumarin，25 mmol/L的5×M9緩沖液。37℃ 220 r/min反應(yīng)1 h，將未反應(yīng)的熒光底物清洗至胞外。清洗流程如下：將反應(yīng)體系4 000 r/min離心3 min，棄上清，加入1 mL LB培養(yǎng)基輕輕重懸EP管底部的菌體，4 000 r/min離心3 min，重復(fù)上步操作，將LB培養(yǎng)基重懸的細(xì)菌置于37℃ 220 r/min搖床清洗10 min，4 000 r/min離心3 min，棄上清，用1 mL預(yù)冷的PBS重懸菌體，重復(fù)該操作一次，最后將收集的菌體重懸于50 μL預(yù)冷的PBS溶液中，放置于冰上保存。全程操作在無(wú)菌超凈臺(tái)中進(jìn)行。在紫外燈下和流式細(xì)胞儀上分別對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞進(jìn)行分析。

FutC的模式分選：將1×PBS粉末溶解于1 L超純水中，用0.22 μm濾膜進(jìn)行抽濾，121℃高壓滅菌20 min，制備為分選用鞘液。根據(jù)流式細(xì)胞儀分析陰性和陽(yáng)性的散點(diǎn)圖確定雙陽(yáng)性最強(qiáng)、且不落入陰性細(xì)菌的P2門，將陽(yáng)性細(xì)菌和陰性細(xì)菌分別按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000的數(shù)目比例混合，各自分選5 000個(gè)細(xì)菌，將其收集于400 μL 37℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基中，于37℃ 220 r/min搖床復(fù)蘇2.5 h，涂布于抗性平板，次日從分選平板上隨機(jī)挑取30個(gè)細(xì)菌進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證并測(cè)序。

1.2.2 FutC隨機(jī)突變庫(kù)的構(gòu)建 以帶有野生型futC基因的pUC18-FutC質(zhì)粒作為模板，通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建FutC隨機(jī)突變庫(kù)。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 隨機(jī)突變庫(kù)構(gòu)建引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers for random mutation library construction

PCR 體系如下：20 ng的 pUC18-FutC，0、0.4、0.6、1 μL MnCl2（10 mmol/L），2 μL Primers（20 μmol/L），10 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μL dCTP（10 mmol/L），2 μL dTTP（10 mmol/L），1 μL DreamTaq DNA polymerase，10 μL 10×DreamTaq buffer，用 ddH2O 補(bǔ)足至100 μL。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性 95℃ 3 min；變性 95℃ 30 s；退火58℃ 30 s；延伸 72℃ 90 s；30個(gè)循環(huán)，之后延伸72℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。將PCR產(chǎn)物和載體pUC18分別用Sac I和Hind III在37℃雙酶切2 h。其中載體雙酶切后用FastAP在37℃去磷酸化2 h。將PCR產(chǎn)物和載體pUC18分別純化后按照如下體系16℃連接過(guò)夜：200 ng pUC18線性載體，1 200 ng插入片段FutC，2 μL 10 ×T4 DNA ligase buffer，1 μL T4 DNA ligase，ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。

將連接產(chǎn)物進(jìn)行純化，取1 μL連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化E.coli 10G感受態(tài)細(xì)胞，37℃ 220 r/min復(fù)蘇45 min后，用LB培養(yǎng)基將10 μL復(fù)蘇菌液稀釋1 000倍，取200 μL涂布LB抗性平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。剩余復(fù)蘇菌液接于5 mL 含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min生長(zhǎng)12 h，提取質(zhì)粒為突變文庫(kù)并保存。第2天通過(guò)平板計(jì)數(shù)計(jì)算庫(kù)容量。隨機(jī)從平板上挑取20個(gè)轉(zhuǎn)化子，送測(cè)序，計(jì)算突變率。將最終獲得的4個(gè)不同突變率的突變庫(kù)按照1∶1∶1∶1的摩爾比混合，計(jì)算得到最終庫(kù)容量和突變率。

1.2.3 突變文庫(kù)的FACS篩選 取1 μL構(gòu)建的隨機(jī)突變文庫(kù)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化JM107-pUCKC18-FKP感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇菌液接于5 mL 含有100 μg/mL氨芐青霉素和25 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min生長(zhǎng)12 h，按照4%的比例轉(zhuǎn)接至5 mL M9液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入終濃度為0.8 mmol/L 的IPTG，20℃220 r/min誘導(dǎo)18 h。取2.4 mL菌體與熒光底物反應(yīng)，反應(yīng)體系及清洗流程同1.2.1。FACS篩選條件如下：1×PBS作為鞘液，使用85 μm的噴嘴，分選速度為4 000-5 000 evt/s；第一輪和第二輪分選突變體收集于400 μL SOC培養(yǎng)基，復(fù)蘇2.5 h后于4 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化進(jìn)入下一輪分選；第三輪分選得到的5 000個(gè)細(xì)菌復(fù)蘇后涂布抗性平板，隨機(jī)挑取平板上100個(gè)突變體進(jìn)入復(fù)篩。將突變體在4 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，用200 μL 25 mmol/L（pH 5.6）的HEPES重懸，通過(guò)反復(fù)凍融后離心取上清為粗酶液，粗酶液與5 mmol/L GDP-巖藻糖和0.5 mmol/L lactose-bodipy反應(yīng)20 min后，用TLC初步鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。對(duì)粗酶活力提高的突變體進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 FutC野生型和突變體的表達(dá)純化及活力測(cè)定 以pET24a-FutC作為模板，用全質(zhì)粒PCR構(gòu)建獲得的突變體，PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3），挑取測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子接入5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)12 h，以1%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接到100 μg/mL卡那霉素的250 mL 2YT培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃ 220 r/min 培養(yǎng)至 OD600為0.8時(shí)，加入終濃度為 0.8 mmol/L的IPTG，20℃誘導(dǎo)22 h，5 000 r/min收集菌體，使用高壓均質(zhì)儀破碎后，進(jìn)行蛋白純化，流程如下：

將破碎后的菌體4℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清4℃ 12 000 r/min離心40 min，取上清為粗酶液。取出50 mL鎳柱，將柱子中的硫酸鎳溶液流干，用20 mL蒸餾水清洗2遍，20 mL Binding Buffer清洗兩遍；將粗酶液過(guò)柱2遍；10 mL Binding Buffer清洗雜蛋白；10 mL Wash Buffer清洗雜蛋白；5 mL Elution Buffer（含80 mmol/L咪唑）過(guò)柱子1遍；5 mL Elution Buffer（含250 mmol/L咪唑）過(guò)柱子1遍，收集流出液即為純化的蛋白。利用SDS-PAGE檢驗(yàn)蛋白純度。

活性測(cè)定：將純化獲得的野生型及突變體FutC純酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，其中含有終濃度為5 mmol/L的GDP-巖藻糖，0.5 mmol/L的lactosebodipy，25 mmol/L（pH 5.6）的 HEPES，0.04 mg/mL的FutC純酶。37℃ 反應(yīng)20 min，煮沸6 min終止反應(yīng)，在反應(yīng)體系中加入100 μL超純水，12 000 r/min高速離心40 min，取80 μL上清進(jìn)行HPLC分析。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為TSK-gel Amide-80（4.6 mm×250 mm，5 μm）型正相親水色譜柱；熒光檢測(cè)器（FLD）：Ex= 488 nm，Em= 525 nm；流動(dòng)相A：超純水，流動(dòng)相C：純乙腈；等度洗脫條件：0-15 min 80%C；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。比活力公式：R=（A+15.84）/5 665.12。R：比活力 U/mg；A：產(chǎn)物HPLC峰面積。

2 結(jié)果

2.1 FutC的胞內(nèi)熒光富集

通過(guò)在乳糖分子上偶聯(lián)兩個(gè)結(jié)構(gòu)和熒光顏色不同的熒光基團(tuán)，針對(duì)FutC設(shè)計(jì)了lactose-bodipy和lactose-coumarin兩種熒光底物（圖1-A）。為了驗(yàn)證FutC確實(shí)可以催化這兩種熒光底物的轉(zhuǎn)化，將其分別與FutC純酶反應(yīng)，TLC結(jié)果如圖2-A所示，F(xiàn)utC可以催化這兩種熒光底物，生成帶有熒光基團(tuán)的巖藻糖基化乳糖。

E.coli JM107 Nan-LacZ-被用于作為篩選的宿主菌株（圖1-B），該菌株的細(xì)胞膜上帶有乳糖透過(guò)酶LacY，可以催化熒光乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，此外該菌株還敲除了β半乳糖苷酶基因LacZ，避免了乳糖在胞內(nèi)的降解。另外引入了表達(dá)GDP巖藻糖合酶的質(zhì)粒pUCKC18-FKP，為FutC提供糖核苷酸供體底物。使用了N端融合了3個(gè)天冬氨酸標(biāo)簽（D3）的futC基因，以增加FutC蛋白的可溶性表達(dá)。

對(duì)于表達(dá)了FutC和不表達(dá)FutC（pUC18空載體對(duì)照）的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)熒光捕獲實(shí)驗(yàn)，在紫外燈上進(jìn)行分析的結(jié)果（圖2-B）和流式細(xì)胞儀上對(duì)兩種細(xì)胞的分析結(jié)果顯示（圖3），表達(dá)FutC的細(xì)胞相比于沒(méi)有表達(dá)FutC的細(xì)胞具有明顯增強(qiáng)的熒光信號(hào)，說(shuō)明我們成功實(shí)現(xiàn)了兩種熒光產(chǎn)物在胞內(nèi)的熒光富集。

圖2 TLC分析FutC的熒光產(chǎn)物和紫外燈照射分析陰性菌株和陽(yáng)性菌株的胞內(nèi)熒光富集反應(yīng)Fig. 2 TLC analysis of fluorescent products and intracellular fluorescence enrichment reaction analysis of negative and positive strains under UV light irradiation

圖3 陰性菌株和陽(yáng)性菌株的FACS分析Fig. 3 FACS analysis of negative and positive strains

2.2 FutC的單細(xì)胞超高通量篩選方法

FutC胞內(nèi)熒光富集的現(xiàn)象說(shuō)明大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)累積熒光產(chǎn)物的量與其表達(dá)α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活力形成偶聯(lián)，因此可以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)高低，從而區(qū)分具有不同催化活力的酶，這是進(jìn)行FACS篩選的基礎(chǔ)。在定向進(jìn)化的過(guò)程中，具體的篩選流程可以分為5個(gè)步驟：步驟1，利用易錯(cuò)PCR等方法建立FutC的突變庫(kù)；步驟2，將突變庫(kù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入含有GDP-fucose合成酶（FKP）的E.coli細(xì)胞，培養(yǎng)并誘導(dǎo)FutC蛋白表達(dá)；步驟3，收集培養(yǎng)的細(xì)菌和熒光底物反應(yīng)液進(jìn)行孵育反應(yīng)；步驟4，將未反應(yīng)的熒光底物從胞內(nèi)清洗出來(lái)，只保留巖藻糖基化熒光產(chǎn)物在胞內(nèi)；步驟5，上機(jī)進(jìn)行FACS分選。

對(duì)單細(xì)胞超高通量篩選方法的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。在分選收集培養(yǎng)基和復(fù)蘇時(shí)間方面，營(yíng)養(yǎng)成分豐富的SOC培養(yǎng)基的復(fù)蘇效果好于LB培養(yǎng)基（圖4-A），2.5 h為最佳復(fù)蘇時(shí)間（圖4-B），這樣的優(yōu)化使分選后細(xì)菌的復(fù)蘇率從10%提高至30%以上。此外，還發(fā)現(xiàn)對(duì)于PBS分選鞘液進(jìn)行0.22 μm濾膜過(guò)濾可以顯著提升分選準(zhǔn)確率，而且以商業(yè)化CST雙色小球作為分選質(zhì)量的質(zhì)控對(duì)于提升分選準(zhǔn)確率非常重要，當(dāng)CST小球的分選準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上時(shí)，分選效果最佳。經(jīng)過(guò)這樣的優(yōu)化，細(xì)菌在雙陽(yáng)性目標(biāo)門P2內(nèi)對(duì)于陽(yáng)性細(xì)菌的分選準(zhǔn)確率可以從45.3%提升至73.4%，代表假陽(yáng)性的Q3區(qū)域從占28.9%降低至7.8%（圖4-C，D）。

圖4 細(xì)菌復(fù)蘇率和分選準(zhǔn)確率的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of bacterial recovery rate and sorting accuracy

模式分選是驗(yàn)證FACS是否能有效地將具有FutC活性的細(xì)胞從無(wú)活性的細(xì)胞中分選出來(lái)的直接方法。通過(guò)對(duì)比分選前后帶有FutC細(xì)胞的比例變化，來(lái)評(píng)估篩選體系對(duì)陽(yáng)性群體的富集效率，可以有效的驗(yàn)證篩選方法的有效性。首先對(duì)無(wú)活力的陰性細(xì)菌樣品和具有FutC催化活力的陽(yáng)性細(xì)菌樣品進(jìn)行反應(yīng)、沖洗與重懸。之后將陽(yáng)性與陰性樣品分別按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000的比例混合，作為進(jìn)行模式分選的樣品。通過(guò)FACS記錄的散點(diǎn)圖，在雙熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的1%的細(xì)胞群體中分選出5 000個(gè)細(xì)菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)并鑒定futC基因是否存在。結(jié)果表明，我們建立的篩選方法僅通過(guò)一輪篩選即可以將陽(yáng)性細(xì)菌從大量陰性細(xì)菌中富集出來(lái)。在分選前陽(yáng)性細(xì)胞的比例為50%，10%，1%和0.1%時(shí)，富集倍數(shù)分別為2、10、90及733倍，有力的證明了此篩選方法的有效性（表2）。

表2 FutC的模式分選Table 2 Model screening of FutC

2.3 FutC的定向進(jìn)化

在初步建立并優(yōu)化了FutC超高通量篩選方法之后，我們對(duì)FutC進(jìn)行了定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)。首先，我們通過(guò)易錯(cuò)PCR建立了FutC的隨機(jī)突變庫(kù)（圖5），平均突變?yōu)?.5個(gè)突變/基因，庫(kù)容量為5.4×105。對(duì)突變庫(kù)進(jìn)行了3輪FACS篩選，均篩選雙陽(yáng)性最強(qiáng)的1%-1.5%的群體，隨后在篩選得到的富集文庫(kù)中隨機(jī)挑取100個(gè)突變體進(jìn)行復(fù)篩。

圖5 FutC隨機(jī)突變文庫(kù)構(gòu)建Fig. 5 Construction of the FutC random mutation library

篩選前后的突變庫(kù)的FACS分析結(jié)果如圖6，篩選前文庫(kù)絕大部分為聚集在Q4區(qū)域的失活或低活力突變體，在經(jīng)過(guò)兩輪篩選之后，經(jīng)過(guò)富集的文庫(kù)在雙陽(yáng)性區(qū)域Q2增加了6.5倍，說(shuō)明篩選后的菌體對(duì)兩種熒光底物的活力均明顯提高。文庫(kù)篩選結(jié)果證明FutC的超高通量篩選方法可以從絕大部分為失活突變體的文庫(kù)中富集出具有較高催化活力的突變?nèi)后w。富集后文庫(kù)的復(fù)篩最終得到了粗酶液相比于野生型活力有一定提升的3個(gè)突變體（圖7），測(cè)序得到對(duì)應(yīng)突變分別為K282E、K102E、R105C。

圖6 流式細(xì)胞儀分析分選前的隨機(jī)突變文庫(kù)和分選2輪后的隨機(jī)突變文庫(kù)Fig. 6 FACS analysis of the FutC random mutation libraries before screening and after two rounds of screening

圖7 TLC分析復(fù)篩得到的單克隆的粗酶液活力Fig. 7 TLC analysis of monoclonal crude enzyme activity after re-screening

2.4 FutC突變體的表達(dá)純化與活力測(cè)定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變體的酶活，我們對(duì)野生型和篩選得到的突變體進(jìn)行了蛋白表達(dá)純化和酶活測(cè)定。首先利用高效液相色譜建立了FutC的酶活測(cè)定方法。結(jié)果如圖8-A，B所示，熒光底物lactosebodipy和熒光產(chǎn)物2′-fucosyllactose-bodipy的保留時(shí)間分別為6.71 min和10.25 min。在0.025-0.2 mmol/L檢測(cè)范圍內(nèi)，2′-fucosyllactose-bodipy的質(zhì)量濃度和色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，說(shuō)明HPLC測(cè)活方法極為精確。隨后對(duì)野生型和篩選獲得的3個(gè)突變體進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，SDS-PAGE如圖8-C，蛋白純度在95%以上。比活力測(cè)定結(jié)果如表3，F(xiàn)utC（K102E）、FutC（R105C）、FutC（K282E） 對(duì) 于 熒光底物lactose-bodipy的比活力相比野生型分別提高了2.7倍，3倍和2.6倍。酶活測(cè)定結(jié)果表明我們通過(guò)超高通量篩選方法成功地從大容量的隨機(jī)突變庫(kù)中篩選獲得活力提高的FutC突變體，證明了該方法的有效性。

表3 FutC野生型和突變體對(duì)熒光乳糖lactose-bodipy的比活力Table 3 Specific activities of WT FutC and selected mutants using lactose-bodipy as acceptor

圖8 HPLC酶活測(cè)定方法的建立及FutC野生型和突變體的蛋白純化Fig. 8 Establishment of HPLC enzyme activity determination method and protein purification of FutC WT and mutant

3 討論

定向進(jìn)化將隨機(jī)突變和高通量篩選技術(shù)結(jié)合，以此獲得具有理想特性的酶。超高通量篩選方法可以覆蓋隨機(jī)突變或組合飽和突變文庫(kù)，具備良好的檢測(cè)靈敏度和應(yīng)用靈活性，為定向進(jìn)化提供了高效的篩選工具。其中熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)通過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)將熒光信號(hào)與酶的催化反應(yīng)相偶聯(lián)，已發(fā)展成為糖基轉(zhuǎn)移酶定向進(jìn)化的有效手段。

作為巖藻糖基寡糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶被廣泛應(yīng)用于2′-巖藻糖基乳糖的生物合成。近年來(lái)，對(duì)于α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)方向。2008年Stein等［23］對(duì)幽門螺桿菌來(lái)源的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FutC進(jìn)行了詳細(xì)的酶學(xué)性質(zhì)表征，鑒定了FutC的最適pH，溫度及底物譜。2014年Engels等［24］鑒定了一種來(lái)源于E.coli O126的新型α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶WbgL。2020年Li等［25］通過(guò)改變反應(yīng)系統(tǒng)中的不同酶量確定了α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是2′-巖藻糖基乳糖合成途徑中的限速酶，并對(duì)不同來(lái)源的α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活力及熱穩(wěn)定性進(jìn)行了比較分析，通過(guò)同源建模推測(cè)出高度保守的基序HxRRxD負(fù)責(zé)GDP-L-巖藻糖的結(jié)合。目前對(duì)于α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的大部分研究依然停留在酶學(xué)性質(zhì)的表征和結(jié)構(gòu)的模擬預(yù)測(cè)階段，同時(shí)由于缺乏有效的篩選手段，尚未有研究報(bào)道其定向進(jìn)化。

本研究針對(duì)α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶定向進(jìn)化過(guò)程中缺少高通量篩選方法的問(wèn)題，建立并優(yōu)化了基于α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FutC的超高通量篩選方法并證明了其應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)定向進(jìn)化提供了有利工具。FACS的胞內(nèi)熒光捕獲策略利用了乳糖透過(guò)酶LacY的精確底物特異性，它可以識(shí)別底物但無(wú)法催化某類糖基化產(chǎn)物。在過(guò)去的研究中，導(dǎo)致LacY底物特異性差異修飾的關(guān)鍵糖基化位點(diǎn)已經(jīng)在乳糖的半乳糖基的C-3羥基（β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶）以及乳糖的葡萄糖基的C-3羥基（α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶）上得到了驗(yàn)證。本研究將該策略應(yīng)用于α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶用以建立其超高通量篩選方法，其糖基化修飾位點(diǎn)為乳糖的半乳糖基的C-2羥基，該策略的成功實(shí)施進(jìn)一步拓展了FACS篩選方法在糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用范圍。其次對(duì)該方法的優(yōu)化解決了之前普遍存在細(xì)菌復(fù)蘇率和準(zhǔn)確率過(guò)低的問(wèn)題，極大提高了FACS篩選系統(tǒng)的效率。隨后定向進(jìn)化成功獲得陽(yáng)性突變體直接證明了該方法的有效性。但在篩選中，由于我們構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)的DNA聚合酶存在堿基偏好性等問(wèn)題，文庫(kù)質(zhì)量相對(duì)較低。構(gòu)建小而精的高質(zhì)量突變文庫(kù)結(jié)合超高通量篩選方法，有望篩選獲得催化活力更高的突變體，為生物合成提供優(yōu)質(zhì)的酶源。此外，對(duì)于α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶及其底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析極具研究?jī)r(jià)值，通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)的解析，我們將得到更多與酶催化機(jī)制有關(guān)的信息，確切的結(jié)構(gòu)信息將為分子改造提供更進(jìn)一步的支持。

4 結(jié)論

本研究建立了針對(duì)α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FutC的超高通量篩選方法，并成功篩選出催化活性提高的FutC突變體。該方法的建立為α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的定向進(jìn)化提供了強(qiáng)大的進(jìn)化工具，為后續(xù)篩選獲得更高活力的突變體打下了良好基礎(chǔ)。