高啟禹 徐光翠 崔彩霞 張文博

（1. 河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南省遺傳性疾病與分子靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新鄉(xiāng) 453003；2. 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730000；3. 河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

重金屬離子（如鐵、鈷、鎳、鋅、銅、鉬和鎢）作為金屬酶的組成部分在酶的功能體現(xiàn)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。除了這些金屬酶，一些細(xì)菌還可以合成金屬結(jié)合蛋白，其中鐵結(jié)合蛋白，即鐵蛋白（ferritin）在鐵的貯藏中意義重大，是一切生物體內(nèi)最主要的鐵儲(chǔ)存蛋白，控制著游離鐵在細(xì)胞中的儲(chǔ)存［1-2］。

鐵蛋白作為一個(gè)古老而龐大的蛋白家族，普遍存在于植物、動(dòng)物及微生物體內(nèi)，具有鐵離子代謝、抗氧化脅迫及消除其他過量金屬離子毒害作用的功能。1937年，最早由Laufberge［3］從馬的脾臟中純化分離獲得，研究證實(shí)其具有耐酸堿（pH 2.0-12.0）和耐高溫（70-75℃）的特性［4］。典型的微生物鐵蛋白分子（FTN）是由24個(gè)亞基組成，外徑約為12 nm，高度對(duì)稱且中空（8 nm）的球形結(jié)構(gòu)，基于四氧化三鐵的鐵核位于亞基衣殼中心，由數(shù)千個(gè)氫氧化鐵分子和數(shù)百個(gè)磷酸鹽分子以非均勻的結(jié)構(gòu)形式組成，分子質(zhì)量為450 kD。此外，還發(fā)現(xiàn)了包含細(xì)菌鐵蛋白（bacterioferritin，BFR）、鐵蛋白Encapsulins及DNA結(jié)合鐵蛋白（DNA protection during starvation，Dps）等3種不同類型的鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)，而且各種鐵蛋白之間存在著大小差異［5］。比較動(dòng)植物及微生物鐵蛋白的亞基的組成發(fā)現(xiàn)，微生物鐵蛋白和植物鐵蛋白具有相同的亞基結(jié)構(gòu)，但哺乳動(dòng)物的鐵蛋白有所不同，其結(jié)構(gòu)中存在有重鏈H-型亞基和輕鏈L-型亞基，兩者在不同的組織器官中以不同的比例組裝成完整的鐵蛋白。

鐵蛋白Dps是在古生菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一類最小的DNA結(jié)合鐵蛋白，具有正常氧化及存儲(chǔ)鐵離子的功能，還能夠非特異性與DNA結(jié)合。通過將鐵螯合在其核心的形式，為DNA提供物理保護(hù)和免受自由基介導(dǎo)的損害［6-7］。Encapsulins是迄今為止在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的最大的一種鐵蛋白，Encapsulins的亞基不含鐵氧化酶中心，它能借助裝載鐵蛋白對(duì)鐵離子進(jìn)行氧化及存儲(chǔ)，同時(shí)其內(nèi)部往往還含有額外的鐵蛋白樣蛋白［8-9］。從原子水平上Encapsulins被細(xì)分為黏球菌鐵蛋白、熱袍菌納米鐵蛋白及類病毒嗜熱火球菌鐵蛋白。

這些鐵蛋白要形成氧化鐵顆粒需要一系列步驟，通常包括鐵的補(bǔ)充、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化、成核和儲(chǔ)存，并由氧化鐵酶中心介導(dǎo)［10］。同時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)，鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等通過協(xié)同作用，維持著機(jī)體細(xì)胞的鐵離子平衡［11］。

1 細(xì)菌鐵蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

由于在菌體內(nèi)存在著Fenton反應(yīng)所需要的Fe2+、過氧化氫及各種有機(jī)物，在不加約束的情況下，F(xiàn)enton反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的羥基自由基，而游離的自由基能夠降解細(xì)胞內(nèi)的脂、核酸和其他生物大分子，對(duì)細(xì)胞具有極強(qiáng)的氧化損傷作用［12］。因此，細(xì)胞為了保護(hù)自身免受Fenton反應(yīng)的負(fù)作用影響，在涉及鐵的氧化和礦化的反應(yīng)過程中，將Fenton反應(yīng)從細(xì)胞溶膠中分離并固定在蛋白質(zhì)籠內(nèi)發(fā)生。因此，所有鐵蛋白的結(jié)構(gòu)都具有相似性，這種籠狀結(jié)構(gòu)限定了發(fā)生這類化學(xué)反應(yīng)的空間構(gòu)造。

其次，形成致密的礦物鐵心的能力是所有鐵蛋白的典型特征，鐵核中的鐵應(yīng)受到保護(hù)，在溶液中保持并具有生物可利用性，這種結(jié)構(gòu)也決定了鐵蛋白的主要功能。其中鐵蛋白的亞鐵氧化中心可以將Fe2+氧化為Fe3+，這種三價(jià)鐵核被儲(chǔ)藏在鐵蛋白衣殼內(nèi)，1分子的鐵蛋白最多可儲(chǔ)存4 500個(gè)Fe3+，而由12個(gè)亞基組成的Dps能在腔中容納500個(gè)Fe3+［13］。當(dāng)胞體內(nèi)Fe2+的濃度不能滿足正常需求時(shí)，F(xiàn)e3+被還原劑還原為Fe2+并釋放，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝，因此鐵蛋白不僅具有消除因Fe2+產(chǎn)生的自由基的氧化損傷，而且調(diào)控著胞體內(nèi)鐵代謝的平衡。同時(shí)，研究證實(shí)細(xì)菌鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和序列存在著高度保守的特性［14］。

典型的細(xì)菌鐵蛋白FTN型與人類FTH結(jié)構(gòu)類似，鐵的催化氧化中心位于鐵蛋白的4-螺旋束內(nèi)，形成的空腔結(jié)構(gòu)保證了鐵原子的進(jìn)入［15］。在24個(gè)亞單位組成的殼結(jié)構(gòu)上，沿著三重對(duì)稱軸有8個(gè)親水孔，沿著四重對(duì)稱軸上有6個(gè)疏水和不滲透孔。這些通道負(fù)責(zé)鐵蛋白與外部環(huán)境中物質(zhì)的交換，是各種離子和分子進(jìn)出鐵蛋白的必經(jīng)通道。其中沿著三重對(duì)稱軸形成的8個(gè)親水孔是鐵進(jìn)入的主要通道，也控制著各種還原劑和螯合劑的進(jìn)入［16］。鐵蛋白亞基從N端起有A、B、C和D四個(gè)α-螺旋，在C端末端有一個(gè)E螺旋與螺旋束呈60度夾角構(gòu)成鐵蛋白亞基，AB、DE和BC鏈接處均有非螺旋區(qū)域（圖 1）［17］。

圖1 鐵蛋白及鐵儲(chǔ)存的立體結(jié)構(gòu)Fig.1 Ferritin and iron storage cellular compartments［17］

同時(shí)，Stillman等［18］研究發(fā)現(xiàn)，原核生物鐵蛋白的亞鐵氧化中心有A、B和C三個(gè)鐵離子位點(diǎn)。GIu17、GIu50和His53構(gòu)成了保守位點(diǎn)A，GIu94、GIu130形成B位點(diǎn)，其中A、B兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具有高度保守性。C位點(diǎn)由GIu49、GIu126、GIu129和GIu130四個(gè)殘基組成，位于鐵蛋白衣殼的內(nèi)壁上，可通過殘基GIu130的羧酸酯鍵與B連接（圖2）。

圖2 細(xì)菌鐵蛋白的Fe2+氧化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structural diagram of Fe2+ oxidation site of bacterial ferritin［18］

BFR的鐵氧化物中心結(jié)構(gòu)不同于FTN的鐵氧化物中心結(jié)構(gòu)，它更為對(duì)稱和穩(wěn)定，通過氧化Fe2+并將生成的Fe3+轉(zhuǎn)移到中心空腔，近似于門栓的作用。此外，它在亞單位二聚體和鄰近亞單位的界面上還有一個(gè)額外的孔，叫做B通道，鐵可以借助B通道進(jìn)入。

Dps的結(jié)構(gòu)中保守功能是氧化酶和結(jié)合鐵，由12個(gè)具有相同鐵蛋白折疊的亞單位組成，外徑約為9 nm，鐵氧化物酶中心位于兩個(gè)鐵位點(diǎn)上的配體與兩個(gè)二聚體之間的界面處，這與在FTN中觀察到的情況相似［13］。

2 鐵氧化酶中心的作用機(jī)制

鐵在細(xì)胞內(nèi)氮的固定、電子和氧的運(yùn)輸及脫氧核糖核苷酸的合成等生物化學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能。因此鐵氧化酶活性中心的作用主要是快速吸收、氧化及存儲(chǔ)游離的鐵離子，維持鐵在胞體內(nèi)的平衡，同時(shí)鐵氧粒子的形成使細(xì)胞能夠精確控制鐵離子的儲(chǔ)存和動(dòng)員［19］。其次在細(xì)胞內(nèi)的鐵在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上調(diào)節(jié)鐵蛋白的合成。

鐵氧化酶活性中心的作用機(jī)制起始于1943年Granick等［20］對(duì)哺乳動(dòng)物鐵蛋白的研究。目前對(duì)于其工作機(jī)制的研究主要有兩種模式，模式一中鐵氧化酶中心作為反應(yīng)基質(zhì)，兩個(gè)Fe2+結(jié)合到鐵氧化酶中心作用位點(diǎn)，當(dāng)它們被氧分子氧化后，F(xiàn)e（Ⅲ）-O（H）- Fe（Ⅲ）作為整體同時(shí)離開中心位點(diǎn)，并為其余游離 Fe2+的氧化做準(zhǔn)備。模式二中，當(dāng)兩個(gè)Fe2+被氧分子氧化后，F(xiàn)e（Ⅲ）-O（H）- Fe（Ⅲ）依舊停留在鐵氧化酶中心的反應(yīng)位點(diǎn)，作為一個(gè)修復(fù)組分催化下一個(gè)反應(yīng)的發(fā)生［5］，如圖3所示。

圖3 鐵氧化酶活性中心的作用機(jī)制Fig.3 Mechanism of ferroxidase center［5］

但Honarmand等［21］在嗜熱火球菌中發(fā)現(xiàn)了另一種有別于以上兩種工作機(jī)制的新模式，即當(dāng)兩個(gè)Fe2+在鐵氧化酶中心被氧化后，F(xiàn)e（Ⅲ）-O（H）-Fe（Ⅲ）會(huì)一直穩(wěn)定地存在于鐵氧化酶中心，在氧分子的參與下，新的Fe2+與Fe3+之間形成 Fe（Ⅲ）-O（H）-Fe（Ⅱ），F(xiàn)e（Ⅲ）-O（H）-Fe（Ⅱ）能夠驅(qū)動(dòng)Fe3+的移位，使Fe3+被連續(xù)轉(zhuǎn)入到鐵蛋白核心，并且這種模式下的鐵蛋白還具有氧化其他金屬離子的能力。本課題組對(duì)分離于酸性礦山廢水中的一株嗜酸嗜鐵氧化亞鐵硫桿菌BY3的抗砷特性分析中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+被氧化為Fe3+的過程中，能夠?qū)s3+氧化為As5+，而且其氧化能力與Fe2+的濃度呈正相關(guān)［22］。同時(shí)課題組圍繞Fe2+的代謝途徑，借助UniProt 對(duì)蛋白質(zhì)序列分析及注釋的全面性，以u(píng)niprot-taxonomy 920.fasta為背景庫(kù)，對(duì)ferritin、iron oxidase、ferredoxinlike protein、ferredoxin、ferrochelatase、iron-sulfur cluster carrier protein、iron ABC transporter permease等目標(biāo)蛋白導(dǎo)入Skyline后經(jīng)理論酶切并優(yōu)化酶切條件，篩選出特異肽段并進(jìn)行了質(zhì)譜DDA及PRM分析，從而為進(jìn)一步揭示Fe2+的氧化過程在嗜酸嗜鐵菌的生長(zhǎng)生存中的作用提供了重要的理論參考。

同時(shí)，借助定點(diǎn)突變技術(shù)詳細(xì)研究了鐵氧化酶活性中心中A、B、C在細(xì)菌鐵蛋白中的作用［23］。研究證實(shí)A、B和C位點(diǎn)的氨基酸替換會(huì)導(dǎo)致嗜熱火球菌鐵蛋白（PfFtn）和大腸桿菌鐵蛋白（EcFtnA）的Fe2+氧化速率降低，同時(shí)在細(xì)菌鐵蛋白的晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，A、B位點(diǎn)始終被金屬離子完全占據(jù)，而C位點(diǎn)在不同細(xì)菌中具有不同的空間構(gòu)象。在已經(jīng)獲得的脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）、大腸桿菌（Escherichia coli）、棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的晶體結(jié)構(gòu)中，對(duì)其鐵氧化酶中心進(jìn)行分析結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，C位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)Fe2+占據(jù)或空位現(xiàn)象，表明C位點(diǎn)可能作為一個(gè)短暫的鐵結(jié)合位點(diǎn)存在。因此在鐵氧化酶活性中心中，A、B位點(diǎn)是Fe2+快速氧化的必要因素，而C位點(diǎn)并非Fe2+快速氧化的必要條件，一定程度上調(diào)控著Fe2+/ Fe3+被轉(zhuǎn)移到鐵蛋白內(nèi)或從鐵蛋白中移出［24］。

3 鐵的調(diào)控與釋放機(jī)制

雖然人們對(duì)傳統(tǒng)鐵蛋白中的鐵吸收和氧化有比較清楚的了解，但對(duì)鐵調(diào)控機(jī)制的研究仍存在爭(zhēng)議，F(xiàn)e3+如何從鐵氧化酶中被移除還尚不清楚。有研究認(rèn)為鐵蛋白調(diào)控鐵的主要途徑與蛋白質(zhì)的水解降解有關(guān)，包括鐵蛋白分子進(jìn)入溶酶體，然后在水解酶的作用下氫氧化鐵核心暴露并溶解［25-26］。La 等［27］借助鐵蛋白的放射性鐵標(biāo)記及誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白中鐵的調(diào)控不是通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)還原劑或螯合劑的細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，而是依靠鐵蛋白和二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（divalent metal transporter 1，DMT1）協(xié)同運(yùn)動(dòng)到溶酶體。在溶酶體中，鐵蛋白自身降解及暴露鐵氫化物晶體并在溶酶體中溶解，還原的鐵被運(yùn)輸回胞漿后通過細(xì)胞中的DMT1釋放或再次儲(chǔ)存在鐵蛋白中。

在缺鐵的條件下，鐵蛋白在真核細(xì)胞中循環(huán)的半衰期約為19-24 h，但在富含鐵的環(huán)境中循環(huán)的半衰期要長(zhǎng)得多，這表明細(xì)胞中鐵的調(diào)控極其嚴(yán)格，但仍然不清楚鐵蛋白的蛋白水解是否是鐵從蛋白中釋放的唯一機(jī)制，以及是否存在其他輔助的鐵調(diào)控機(jī)制，使細(xì)胞能夠及時(shí)獲得鐵。但目前公認(rèn)的鐵蛋白中鐵釋放通道位于鐵蛋白三重軸通道的C-D螺旋鉸鏈區(qū)，而該區(qū)域又是鐵的入口（圖4）。雖然三重軸通道的孔徑大約只有4?，但在結(jié)構(gòu)上具有一定的空間柔性，這種柔性特點(diǎn)能夠使一些稍大于孔徑的物質(zhì)進(jìn)入鐵蛋白腔內(nèi)［28-29］。

圖4 鐵蛋白中鐵的氧化還原機(jī)制Fig.4 Redox mechanism of iron in ferritin［28］

研究表明，細(xì)菌也可以通過鐵輸出系統(tǒng)來控制細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)。Sankari等［30］發(fā)現(xiàn)在根瘤菌（Bardyrhizobium japonicum）中有一種膜蛋白MbfA，在高鐵條件下被表達(dá)，發(fā)揮著將金屬?gòu)募?xì)胞質(zhì)中導(dǎo)出的功能。MbfA含有一個(gè)N端鐵蛋白樣結(jié)構(gòu)域，能夠參與鐵的結(jié)合和輸出。同時(shí)在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中發(fā)現(xiàn)了一種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PfeT，它的失活抑制了菌體在高鐵環(huán)境下的生長(zhǎng)。在鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）中也有鐵輸出蛋白的報(bào)道，稱為檸檬酸亞鐵外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MdtD），在大腸桿菌（E. coli）中胎球蛋白A（FetA）和胎球蛋白B（FetB）的過度表達(dá)降低了細(xì)胞內(nèi)鐵的水平，增強(qiáng)了對(duì)氧化損傷的抵抗力［31］。

4 鐵的儲(chǔ)存

鐵蛋白將大量的Fe2+氧化并儲(chǔ)存在其內(nèi)部的現(xiàn)象被稱為鐵的生物礦化（mineralization），這種生物礦化機(jī)理導(dǎo)致了Fe2+在鐵蛋白中的氧化沉淀，但鐵的氧化沉淀在細(xì)胞內(nèi)的具體反應(yīng)途徑尚不清楚，主要包括生物礦化途徑（公式1、2）和去毒反應(yīng)途徑（公式3），各反應(yīng)途徑的選擇主要與細(xì)胞內(nèi)Fe2+的濃度有關(guān)，在Fe2+高濃度的條件下，鐵的氧化沉淀可能主要以生物礦化途徑為主，但去毒反應(yīng)途徑也同時(shí)存在［32-34］。

在細(xì)菌鐵蛋白的研究中證實(shí)細(xì)菌至少可以表達(dá)3種鐵蛋白。其中Dps更依賴于以H2O2作為氧化劑。但FTN和BFR在不同生物體內(nèi)的作用似乎不同，如研究證實(shí)FTN是大腸桿菌最主要的鐵儲(chǔ)存鐵蛋白，而在沙門氏菌中最主要的鐵儲(chǔ)存鐵蛋白為BFR［35］。其次銅綠假單胞菌的BFR需要與鄰近基因Bfd編碼的鐵氧還蛋白的共同作用才能完成鐵在體外的快速還原與釋放［36］。

Andrews認(rèn)為［37］，當(dāng)鐵進(jìn)入細(xì)胞后，不會(huì)被細(xì)胞全部快速利用，部分鐵被儲(chǔ)存在鐵蛋白和鐵樣蛋白中。這部分鐵不參與正常的細(xì)胞代謝進(jìn)程，以一種備用鐵庫(kù)的形式存在，當(dāng)細(xì)胞可利用的外源鐵不足時(shí)進(jìn)行鐵的補(bǔ)充，同時(shí)備用鐵庫(kù)儲(chǔ)存鐵的模式也對(duì)細(xì)胞具有重要的保護(hù)，降低了細(xì)胞由于鐵過量引起的氧化損傷。譚瀟等［38］利用基因工程技術(shù)克隆了鮑曼不動(dòng)桿菌鐵蛋白（abferritin）基因，證實(shí)基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠增強(qiáng)大腸桿菌抵抗氧化應(yīng)激的能力。

但對(duì)于鐵在胞體內(nèi)的存儲(chǔ)研究中，McHugh等［39］認(rèn)為包被蛋白可能是原核生物中最大的鐵儲(chǔ)存細(xì)胞器，其直徑為24-32 nm，能夠積累多達(dá)30 000個(gè)鐵原子。這種包被蛋白已從嗜熱火球菌（Pyrococcus furiosus）和黃色黏液球菌（Myxococcus xanthus）中分離和結(jié)晶。這類蛋白結(jié)構(gòu)與病毒形狀類似，包被物本身沒有鐵氧化酶活性，但可以由包被在空腔中的特殊運(yùn)送蛋白EncFTN提供。EncFTN中有一個(gè)由4螺旋束組成的鐵蛋白樣折疊，各亞基組裝成一個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中包含有5個(gè)鐵氧化酶活性位點(diǎn)，各位點(diǎn)與衣殼結(jié)構(gòu)上的鐵蛋白孔并列，以產(chǎn)生一種能夠在空腔內(nèi)吸引、氧化和礦化鐵的復(fù)合物。目前已在包被蛋白中觀察到多達(dá)14個(gè)鐵核，它們一起積累的鐵是典型鐵蛋白分子的10倍。同時(shí)包被蛋白還攜帶有其他與鐵無關(guān)的反應(yīng)酶［40］。通過對(duì)包被蛋白的基因組分析發(fā)現(xiàn)，其基因組包含有FTN樣和Dps樣基因，但在包囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)含有可見的鐵沉淀物，因此包被蛋白與EncFTN在鐵穩(wěn)態(tài)下的作用機(jī)理仍待進(jìn)一步研究。

5 鐵蛋白的分子改造

鐵蛋白獨(dú)特的八面體空間結(jié)構(gòu)已成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及自組裝的重要模型，可以通過對(duì)鐵蛋白的各種氨基酸突變和改造來分析亞基各個(gè)區(qū)域或不同氨基酸殘基對(duì)鐵蛋白功能及自組裝的影響［41-43］。張瑜等［44］在大腸桿菌鐵蛋白亞基的N端增加了6個(gè)組氨酸殘基后，突變蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯改變，但在結(jié)構(gòu)上卻不能形成24聚體的殼狀結(jié)構(gòu)，在溶液中也只能以二聚體的形式存在，其熱力學(xué)穩(wěn)定性有一定的下降。因此他們認(rèn)為，N端的延長(zhǎng)可能導(dǎo)致鐵蛋白單體構(gòu)型發(fā)生了改變，使殼狀結(jié)構(gòu)的組裝無法正常進(jìn)行。

其次鐵蛋白的外表面可用于連接具有特殊功能的配體，內(nèi)表面可作為納米反應(yīng)器用于納米復(fù)合材料的合成，亞基之間的接觸面則可用于指導(dǎo)鐵蛋白的解聚與重組、合成不同亞基比例的鐵蛋白及打破鐵蛋白的對(duì)稱性結(jié)構(gòu)［45］。

同時(shí)，當(dāng)鐵蛋白中各位點(diǎn)或位點(diǎn)鄰近氨基酸發(fā)生突變時(shí)，都會(huì)對(duì)蛋白原來的作用屬性產(chǎn)生很大影響。Liu等［46］采用易錯(cuò)PCR的方法構(gòu)建了大腸桿菌的FTN突變體庫(kù)，并將其導(dǎo)入已敲除鐵蛋白的野生菌株中發(fā)現(xiàn)，野生型細(xì)胞對(duì)外加磁場(chǎng)吸附活性有了明顯提高，而突變位點(diǎn)位于蛋白亞基的B-型通道內(nèi)。進(jìn)一步研究表明在B位點(diǎn)附近發(fā)生的突變使通道入口的極性氨基酸數(shù)量減少，提高了鐵離子的進(jìn)入能力。

6 鐵蛋白的應(yīng)用

6.1 籠狀結(jié)構(gòu)是重要的納米材料載體

各種功能單元的微型化及其在納米技術(shù)中的應(yīng)用是一個(gè)重要且被日益關(guān)注的研究領(lǐng)域，它結(jié)合了物理、化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多種學(xué)科。實(shí)現(xiàn)這一應(yīng)用目標(biāo)的一種策略是使用籠狀結(jié)構(gòu)（cage structure protein，CSP）配合物生產(chǎn)單分散納米顆粒（nanoparticles，NPs），其大小約為5-100 nm，通常形成一種類似于含鐵硫簇的鐵硫樣蛋白［47］。目前其應(yīng)用主要涉及臨床微量血清鐵蛋白檢查、生物體的鐵營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充及生物納米材料研發(fā)等方面［48］。

CSP制備鐵硫樣蛋白主要有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一方面CSP生成的NPs的大小和形狀是明確的，具有窄的尺寸分布；另一方面CSP的外表面可以使用配體（如蛋白質(zhì)、肽和藥物分子），增強(qiáng)了它們?cè)谏锛{米技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛力，能夠靶向載藥于腫瘤處進(jìn)行成像和治療。其次在電子設(shè)備應(yīng)用中，Dps因其固有的潛力而易于在表面組裝成2D晶體［49-50］。

6.2 復(fù)合體組裝的優(yōu)良工具

FTN具有依賴于溶液酸堿度及鹽濃度的自組裝特性。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)FTN處于pH＜2或溶液NaCl濃度大于100 mmol/L的環(huán)境條件下時(shí)，鐵蛋白的籠狀結(jié)構(gòu)被解離成單體，但在調(diào)節(jié)pH＞7或?qū)aCl濃度降低后，解離的單體又自組裝形成球狀結(jié)構(gòu)，可以在蛋白籠內(nèi)產(chǎn)生不同大小的納米顆粒（圖5）。因此借助鐵蛋白的自組裝特性，可進(jìn)行藥物或其他物質(zhì)的目的性裝載，具有重要的應(yīng)用價(jià)值［51］。Mazzucchelli等［52］利用鐵蛋白在低pH值下分解和在高pH值重新組裝的特性，成功制備了奧拉帕尼納米顆粒，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，奧拉帕尼納米藥物對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制效果，能使癌細(xì)胞存活率下降至60%。但研究也發(fā)現(xiàn)鐵蛋白在80℃、6 mol/L尿素或鹽酸胍或1%（W/V）十二烷基硫酸鈉下穩(wěn)定［53］。

圖5 鐵蛋白內(nèi)腔中納米粒子的合成Fig.5 Synthesis of nanoparticles inside the ferritin inner cavity［51］

同時(shí)根據(jù)鐵蛋白的自組裝特點(diǎn)，結(jié)合基因工程技術(shù)，已構(gòu)建了具有不同功能的雜合鐵蛋白以及不同鐵蛋白間的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。Williams 等［54］發(fā)現(xiàn)鐵蛋白氨基酸序列中的細(xì)微取代會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化，當(dāng)12亞基的Dps的第47位苯丙氨酸突變?yōu)楣劝彼岷螅?2亞基蛋白變?yōu)殍F蛋白樣24亞基聚合體。結(jié)果證明了相關(guān)蛋白亞家族之間會(huì)發(fā)生突變切換的新假說。

7 總結(jié)與展望

鐵蛋白作為生物體重要的鐵儲(chǔ)存與調(diào)控蛋白，在維持細(xì)胞鐵代謝平衡及保護(hù)細(xì)胞正常生理功能的體現(xiàn)中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)FTN作為細(xì)胞天然形成的磁性納米顆粒，將在核磁成像及鐵蛋白分子改造中發(fā)揮其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［55］，因此了解鐵蛋白中鐵的調(diào)控與釋放、鐵的儲(chǔ)存機(jī)制，將進(jìn)一步揭示鐵元素在生物體中的生理及生化功能。而圍繞鐵蛋白的籠狀結(jié)構(gòu)構(gòu)建納米載體，是未來納米藥物材料的研究方向之一，其獨(dú)特的籠狀結(jié)構(gòu)是未來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及自組裝的重要工具。同時(shí)借助鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)，采用生物修飾和化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行多種分子骨架的設(shè)計(jì)，能夠?qū)崿F(xiàn)高精度的靶向操作和多功能化的開發(fā)與應(yīng)用。

迄今為止，科學(xué)家獲得的微生物鐵蛋白晶體極其有限，圍繞蛋白晶體的制備與結(jié)構(gòu)的分析，將有助于進(jìn)一步探索結(jié)構(gòu)與性質(zhì)之間的關(guān)系，也為微生物鐵蛋白功能的挖掘創(chuàng)造條件。與此同時(shí)，融合現(xiàn)代分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)，采用多數(shù)據(jù)源分析微生物鐵蛋白與其他蛋白之間的相互作用，能夠更加深入地揭示在多途徑的代謝過程中鐵蛋白的代謝機(jī)制，從而為相關(guān)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。