蘇 晴 楊書平 李明欣 劉 莉 柴玉榮

（鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，鄭州 450001）

胸腺是T淋巴細胞發(fā)育和產(chǎn)生免疫耐受的主要淋巴器官[1]。胸腺衰老與免疫衰老密切相關(guān)，與伴隨的許多慢性疾病的發(fā)展有關(guān)，例如動脈粥樣硬化、高血壓和2型糖尿病等[2]。研究表明，胸腺衰老和功能失調(diào)可能是嚴(yán)重的COVID-19疾病的一個誘發(fā)因素[3]。線粒體是高度動態(tài)的細胞器，可根據(jù)細胞代謝需求維持融合和分裂的平衡，即“線粒體動力學(xué)”，從而維持其正常的形態(tài)、分布和功能。線粒體的形態(tài)適應(yīng)對衰老、細胞周期、凋亡等至關(guān)重要[4-6]。在衰老和與年齡相關(guān)的疾病中可見異常的線粒體結(jié)構(gòu)，表明線粒體動力學(xué)隨著細胞的衰老而受到損害[7]。五倍子酸 （3，4，5-三羥基苯甲酸，gallic acid， GA） 也稱為沒食子酸，是一種天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤等多種作用，對D-半乳糖誘導(dǎo)胸腺加速衰老具有一定的保護作用[8]。五倍子酸是否通過影響線粒體功能，改善衰老胸腺的組織結(jié)構(gòu)，尚未清楚。本研究旨在從線粒體膜電位和線粒體動力學(xué)角度探索五倍子酸對胸腺線粒體功能的影響及機制。

1 材料和方法

1.1 動物分組和主要試劑

30只2月齡昆明小鼠購自鄭州大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量為29～37 g，清潔級環(huán)境飼養(yǎng)。動物實驗通過鄭州大學(xué)動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)。

30只昆明小鼠隨機分為對照組、D-半乳糖致衰老模型組（D-半乳糖組）、五倍子酸治療組（五倍子酸組），每組5只，雌雄各半。對照組腹腔注射0.9%生理鹽水，第3～8周同時灌胃給予五倍子酸的溶劑羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）；D-半乳糖組腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖[9]， 3～8周同時灌胃給予CMC-Na；五倍子酸組腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖， 3～8周同時灌胃給予250 mg/kg 五倍子酸[8]。每天定時給藥，8周后處死動物，取材備用。

主要試劑如下：Mfn1和Mfn2抗體（上海艾博抗有限公司）；動力相關(guān)蛋白1（Drp1）抗體（武漢三鷹）；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑（上海碧云天）；凝膠試劑盒（北京鼎國）；五倍子酸、線粒體膜電位檢測試劑盒（北京索萊寶）；免疫組織化學(xué)二抗顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 H-E染色和免疫組織化學(xué)顯色

胸腺組織一葉，4%多聚甲醛固定24 h，流水沖洗，石蠟包埋，制作石蠟切片，片厚5 μm。采用H-E染色，中性樹膠封片后，光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

胸腺組織切片經(jīng)過梯度乙醇脫蠟復(fù)水后，微波修復(fù)法進行抗原修復(fù)，PBS沖洗，滴加相應(yīng)血清封閉，加一抗：兔抗Mfn2多克隆抗體（1∶50），置4℃孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG于37℃恒溫箱中孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，沖洗返藍，鹽酸乙醇分色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光學(xué)顯微鏡拍照、觀察陽性細胞的定位和表達。

1.3 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidas，SA-β-Gal）檢測

一葉胸腺組織，固定后，冰凍切片， 厚度7 μm。顯色液：1 mg/mL的X-Gal，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｄ敢海?0 mmol/L的檸檬酸/磷酸鈉鹽緩沖液（pH6.0），5 mmol/L亞鐵氰化鉀沖液，5 mmol/L鐵氰化鉀沖液，150 mmol/L氯化鈉，2 mmol/L氯化鎂，4℃避光保存。組織切片冷丙酮固定20 min，PBS沖洗，避光滴加顯色液，陰性對照組滴加不含x-gal的母液，37℃孵育3～5 h，PBS 沖洗，中性紅復(fù)染細胞核，封片，顯微鏡觀察、拍照。

1.4 線粒體膜電位檢測

胸腺組織研磨，400目網(wǎng)篩分離胸腺細胞。線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）按照說明書步驟進行，配置JC-1染色工作液，設(shè)置陽性對照，胸腺細胞重懸于細胞培養(yǎng)液，加入0.5 mL JC-1染色工作液，37℃孵育20 min，4℃離心5 min，棄上清，JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，熒光酶標(biāo)儀檢測。JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。紅綠熒光的相對比例可以衡量線粒體去極化狀態(tài)，JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，用于檢測細胞膜電位的變化。

1.5 免疫印跡檢測

胸腺組織中加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑后進行研磨提取蛋白質(zhì)，4℃離心，取上清液，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，上樣緩沖液，100℃水浴鍋加熱5 min使蛋白質(zhì)變性。SDSPAGE蛋白電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，分別孵育一抗Mfn1（1∶1 000）、Mfn2（1∶5 000）、Drp1（1∶3 000）、β-actin（1∶2 000），4℃過夜，TBST洗膜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，加ECL顯色劑曝光成像。

1.6 圖像分析和統(tǒng)計學(xué)處理

在高倍顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)和SA-β-Gal染色的切片，每張切片隨機選取5個不同視野采集圖像，觀察陽性顆粒在細胞中的分布，統(tǒng)計抗體陽性的細胞面積和SA-β-Gal染色的陽性區(qū)域。圖像分析使用Image J軟件，并用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖。計量資料以±s表示，組間比較使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)分析

H-E染色結(jié)果顯示，D-半乳糖處理8周后，胸腺組織的皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)較紊亂，皮質(zhì)區(qū)變薄，皮、髓質(zhì)比降低；而對照組和五倍子酸添加6周后的胸腺組織皮、髓質(zhì)交界較為明顯，且周圍皮質(zhì)較厚。說明五倍子酸能明顯改善D-半乳糖誘導(dǎo)的急性衰老引起的胸腺組織結(jié)構(gòu)紊亂（圖1，見封二）。

圖1 各組胸腺組織H-E染色，標(biāo)尺=200 μm 。A：對照組； B：D-半乳糖組； C：五倍子酸組.

2.2 五倍子酸減少了胸腺組織中的衰老細胞

衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶能標(biāo)記組織中的衰老細胞，SA-β-Gal陽性信號為分布在細胞胞質(zhì)內(nèi)的藍色顆粒，陽性細胞是衰老細胞。通過SA-β-Gal染色實驗（圖2，見封二），結(jié)果顯示，與對照組（0.561 2）的正常小鼠比較，D-半乳糖組（1.372 5）胸腺組織中衰老細胞數(shù)量明顯增多（P＜0.05）；補充五倍子酸（0.479 5）后，胸腺組織中SA-β-Gal陽性的衰老細胞顯著減少（P＜0.01）。本研究結(jié)果證實，D-半乳糖能有效誘導(dǎo)胸腺組織的細胞衰老，而五倍子酸能明顯減緩胸腺組織的細胞衰老。

圖2 各組胸腺組織中的衰老細胞檢測 A～C：標(biāo)尺=50 μm；D～F：標(biāo)尺=20 μm。 A、D：對照組； B、E：D-半乳糖組； C、F：五倍子酸組.

2.3 五倍子酸增加胸腺細胞線粒體膜電位

胸腺細胞的線粒體膜電位檢測結(jié)果顯示，與對照組比較（紅/綠=5.3），D-半乳糖組線粒體膜電位下降（紅/綠=3.2）；與D-半乳糖組比較，五倍子酸組線粒體膜電位上升（紅/綠=5.6），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。結(jié)果提示，五倍子酸可緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的線粒體膜去極化程度，對線粒體具有保護作用。

圖3 各組胸腺細胞中線粒體膜電位的變化

2.4 五倍子酸促進胸腺組織的Drp1表達

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，D-半乳糖組小鼠的胸腺組織中線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2表達水平無明顯變化，Drp1表達水平降低；補充五倍子酸后， Drp1表達水平顯著升高（P＜0.05），而Mfn1和Mfn2表達水平無明顯變化（圖4）。結(jié)果提示，D-半乳糖誘導(dǎo)的急性衰老打破了胸腺組織中線粒體融合和分裂的平衡，導(dǎo)致線粒體功能障礙，而五倍子酸恢復(fù)了胸腺組織中線粒體融合和分裂的平衡。

圖4 各組胸腺組織中Drp1、Mfn1、Mfn2蛋白的表達

2.5 胸腺組織Mfn2的原位表達

進一步通過免疫組織化學(xué)顯色驗證Mfn2在組織中的原位表達，結(jié)果顯示，Mfn2陽性細胞主要表達在胸腺的髓質(zhì)區(qū)域。對照組（3.528 3）、D-半乳糖組（3.862 0）和五倍子酸（3.778 3）組間Mfn2的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5，見封二）。

圖5 各組胸腺組織中Mfn2的表達。A～C：標(biāo)尺=50 μm；D～F：標(biāo)尺=20 μm。A、D：對照組； B、E：D-半乳糖組； C、F：五倍子酸組.

3 討論

胸腺是重要的中樞免疫器官。隨著年齡增長，胸腺結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生衰退，表現(xiàn)在胸腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，T淋巴細胞輸出減少，導(dǎo)致機體免疫能力下降以及感染增加等慢性疾病的發(fā)生[10-11]。五倍子酸是一種多酚天然產(chǎn)物，廣泛分布于水果、蔬菜、香料和茶等不同種類的植物中，具有抗氧化、抗炎等多種性能[12-13]。筆者課題組前期工作表明，五倍子酸可以延緩與年齡相關(guān)的小鼠胸腺退化[8]，但其機制需要進一步闡明。本研究建立了D-半乳糖急性致衰老的動物模型，組織學(xué)分析表明，模型組小鼠胸腺的正常組織結(jié)構(gòu)被破壞，衰老細胞增多，具有胸腺退化表型；并從線粒體膜電位和線粒體動力學(xué)角度探索五倍子酸對胸腺結(jié)構(gòu)和功能的保護作用及潛在機制。

線粒體在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，組織中線粒體功能的下降被認(rèn)為是衰老的主要標(biāo)志[14-15]。線粒體膜電位是衡量線粒體功能的重要指標(biāo)，膜電位降低可誘導(dǎo)線粒體凋亡[16]。研究表明，五倍子酸對線粒體功能具有保護作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示，五倍子酸補充后，胸腺細胞的線粒體膜電位上升，提示五倍子酸也能改善胸腺組織中的線粒體功能。

為適應(yīng)細胞內(nèi)外環(huán)境的變化，線粒體不斷進行分裂和融合。調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)的核心機制組成部分是動力蛋白家族，這些GTP酶決定了這些動態(tài)轉(zhuǎn)變[19]。Mfn1、 Mfn2介導(dǎo)外膜融合，參與線粒體融合，線粒體融合不僅利于物質(zhì)交換，并可能彌補其功能缺陷[20]。Drp1參與線粒體分裂，在細胞分裂期間，產(chǎn)生新的線粒體、受損線粒體的分離、線粒體的運輸都需要線粒體分裂[21]。在生理條件下，線粒體融合和分裂以不斷平衡的方式發(fā)生，形成一個動態(tài)的互連網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果顯示，D-半乳糖組Mfn1和 Mfn2表達水平無明顯變化，但Drp1表達水平明顯降低，線粒體融合和分裂的平衡被打破，線粒體的形態(tài)受到影響，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙；與D-半乳糖組比較，五倍子酸組的Drp1表達水平上升，提示五倍子酸使線粒體融合和分裂的平衡一定程度上得以恢復(fù)。通過免疫組織化學(xué)顯色也驗證了Mfn2在各組之間表達相對一致，與免疫印跡結(jié)果相互佐證。

綜上所述，D-半乳糖急性致衰老導(dǎo)致胸腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)紊亂，衰老細胞增多，線粒體膜電位下降，并且線粒體融合和分裂的平衡被打破，而五倍子酸的干預(yù)可以減少胸腺中的衰老細胞數(shù)目，一定程度上恢復(fù)胸腺的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。其機制可能與增加胸腺細胞的線粒體膜電位，增加組織細胞中線粒體分裂，維持線粒體融合和分裂的平衡有關(guān)，從而維持線粒體正常功能，對胸腺組織的衰退起到了保護作用。