李文杰 張 方 李秋鳳 程運杰 屈肖杰

（焦作市第二人民醫(yī)院，1 心內(nèi)三區(qū)，2 神經(jīng)內(nèi)科，4 呼吸與重癥醫(yī)學科，焦作 454001；3 河南省中醫(yī)藥研究院心內(nèi)科，鄭州 450000）

心血管疾病是目前威脅人類健康的主要疾病之一，尤其是急性心肌梗死是導致心血管疾病患者發(fā)病率增加的重要因素[1]。吸煙、代謝綜合征和高血壓等是影響心肌梗死患者高發(fā)病率和高死亡率的主要危險因素[2]。目前的治療方法包括外科手術(shù)和溶栓治療容易誘發(fā)額外再灌注損傷，因此必須開發(fā)有效的替代方法來治療心肌梗死。一些miRNA在心肌細胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，調(diào)控miRNA的表達可以影響心肌細胞凋亡進程，這為人類和動物心血管疾病的預測、診斷與治療提供了新的思路[3]。研究表明，miR-320b表達在心肌梗死患者中明顯降低[4]，但miR-320b對心肌梗死的具體作用機制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建心肌梗死大鼠模型，探討miR-320b過表達對心肌梗死大鼠心室重塑過程的影響，為臨床治療心肌梗死提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

48只雄性SD大鼠購自河南省實驗動物中心，6周齡，體質(zhì)量（190±10）g，許可證號：SCXK（豫）2017—0001。飼養(yǎng)于SPF級屏障實驗室。

1.2 實驗試劑

Agomir-NC、miR-320b agomir購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司； 2，3，5－三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液（D025-1-3）、原位末端標記（Terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡原位檢測試劑盒（G002-2-2）購自南京建成生物工程研究所；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（ZN2272-PIU）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（ARB13318）和白細胞介素-1β（interleukin-6，IL-1β）（ARB10508）購自北京百奧萊博科技有限公司；一抗Bax（ab104156）、Bcl-2（ab194583）、caspase-3（ab13847）、cleaved caspase-3（ab2302）、cleaved caspase-9（ab2324）、caspase-9（ab52298）、GAPDH（ab9485）購自英國Abcam公司。

1.3 動物模型建立與分組

參照黎鎮(zhèn)賜等[5]方法制作心肌梗死大鼠模型，將大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組、模型組、陰性對照組（對照組）、miR-320b過表達組。除假手術(shù)組外，其余各組采用結(jié)扎心左冠狀動脈前降支（心左冠狀動脈起始部位下2～5 mm處）的方法建立心肌梗死大鼠模型，術(shù)后24 h，對照組、miR-320b過表達組經(jīng)尾靜脈注射agomir-NC或miR-320b agomir，每日1次，連續(xù)注射3 d。

1.4 超聲心動圖

最后一次注射24 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，左側(cè)臥位，采用彩色多普勒超聲儀檢測各組大鼠左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末期壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 RT-PCR檢測miR-320b、MHC-αmRNA和MHC-β mRNA表達

超聲心動圖檢測結(jié)束后，處死所有大鼠，開胸取出心并分成若干部分， 4%多聚甲醛溶液固定，或儲存在液氮中。取部分保存在液氮中的各組大鼠心肌組織，用TRIzol法提取總RNA，使用FastKing RT試劑盒通過標準反應進行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，使用Fast qPCR Mix進行實時PCR，反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃15 s，35個循環(huán)。miR-320b相對表達水平以U6為內(nèi)參，基因相對表達水平以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下：miR-320b，正向引物：5'-GCAAAAG CTGGGTTGAGA-3'，反向引物：5'-CAGTGCGTGT CGTGGA-3'；U6，正向引物：5'-CTCGCTTCGGCA GCACA-3'，反向引物：5'-TCATCCAAATACTCC ACACGC-3'；MHC-α，正向引物：5'-AAGTCCTCCC TCAAGCTCATGGC-3'，反向引物：5'-ATTTTCCCG GTGGAGAGC-3'；MHC-β，正向引物：5'-GCTGT TATTGCAGCCATTG-3'，反向引物：5'-TTCCTGT TGCCCCAAAATG-3'；GAPDH正向引物：5'-ACAG CCTCAAGATCATCAGC-3'，反向引物：5'-GGTCA TGAGTCCTTCCACGAT-3'。以PCR儀自帶軟件獲取Ct值，通過公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。

1.6 TTC染色檢測心肌梗死面積

按照TTC染液說明書，將新鮮心肌組織切片置于裝有TTC染液的培養(yǎng)皿中，37℃避光孵育30 min，用組織沖洗液將組織表面多余染色液沖洗掉，拍照并觀察樣本顏色變化，切片非梗死區(qū)呈玫瑰紅色，梗死區(qū)組織發(fā)白，紅色區(qū)與灰色區(qū)之間為未缺血區(qū)。計算梗死面積比例。

1.7 H-E染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu)

將各組大鼠心肌組織置于4%多聚甲醛中固定72 h，隨后將已固定的心肌組織置于20%乙二胺四乙酸中進行脫鈣處理，將樣品在梯度濃度的乙醇中脫水，并石蠟包埋、切片，片厚5 μm，蘇木精染色10 min，伊紅染色2 min，中性樹膠封片。使用光學顯微鏡觀察心肌組織病理學變化。

1.8 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡

將大鼠心肌組織切片用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70 %）各浸洗1次，每次3 min。參照TUNEL凋亡試劑盒說明書，用蛋白酶K工作液在37 ℃下封閉20 min，PBS清洗2次。在每個切片樣本上加入TUNEL反應液50 μL，37 ℃閉光反應60 min。用DAPI復染10 min后熒光顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況。

1.9 免疫印跡檢測心肌組織凋亡蛋白水平

取部分保存在液氮中的各組大鼠心肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。4 ℃下加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9一抗（1∶1 000）孵育過夜，TBST清洗后加入HRP-IgG（1∶10 000），加入電化學發(fā)光顯色液顯色。以GAPDH為內(nèi)參，Image J V1.8.0.112軟件分析各組細胞目的蛋白與GAPDH比值。

1.10 ELISA檢測心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平

將各組大鼠心肌組織置于含蛋白酶抑制劑的裂解液的玻璃勻漿器中勻漿，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.11 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用獨立的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-320b過表達上調(diào)心肌梗死大鼠miR-320b、MHC-αmRNA水平，降低MHC-β mRNA水平和心肌梗死面積

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠miR-320b、MHC-α mRNA水平降低，MHC-β mRNA水平升高，心肌梗死面積增加（P＜0.05）；與模型組比較，miR-320b過表達組大鼠miR-320b、MHC-α mRNA水平升高，MHC-β mRNA水平降低，心肌梗死面積減?。≒＜0.05）（圖1）。

圖1 miR-320b過表達對心肌梗死大鼠miR-320b、MHC-α、MHC-β mRNA水平和心肌梗死面積的影響

2.2 miR-320b過表達升高心肌梗死大鼠LVEF、LVFS、LVSP，降低LVEDP

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS、LVSP降低，LVEDP升高（P＜0.05）；與模型組比較，miR-320b過表達組大鼠LVEF、LVFS、LVSP升高，LVEDP降低（P＜0.05）（圖2）。提示miR-320b過表達可明顯改善心肌梗死大鼠的心功能障礙。

圖2 miR-320b過表達對心肌梗死大鼠LVEF、LVFS、LVSP、LVEDP的影響

2.3 miR-320b過表達改善心肌梗死大鼠心肌組織病理損傷

假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列規(guī)整，未見變性及炎癥細胞浸潤。模型組心肌纖維排列紊亂、間隙變寬，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂。miR-320b過表達組大鼠心肌組織病理損傷程度明顯改善，心肌纖維排列較規(guī)整，心肌纖維偶有斷裂（圖3）。提示miR-320b過表達可有效減輕心肌梗死大鼠的心肌損傷。

圖3 miR-320b過表達對心肌梗死大鼠心肌組織病理損傷的影響。A： 假手術(shù)組；B：模型組；C：對照組；D：miR-320b過表達組.

2.4 miR-320b過表達降低心肌梗死大鼠心肌組織細胞凋亡

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，miR-320b 過表達組大鼠心肌組織細胞凋亡率降低（P＜0.05）（圖4）。提示miR-320b過表達明顯抑制心肌梗死大鼠心肌細胞的凋亡。

圖4 miR-320b過表達對心肌梗死大鼠心肌組織細胞凋亡率的影響。A：假手術(shù)組；B：模型組；C：對照組；D：miR-320b過表達組；E：各組細胞凋亡率比較，*P＜0.05 vs 假手術(shù)組，#P＜0.05 vs 模型組.

2.5 miR-320b過表達降低心肌梗死大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值升高（P＜0.05）；與模型組比較，miR-320b過表達組大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值降低（P＜0.05）（圖5）。提示miR-320b過表達可有效抑制心肌梗死大鼠心肌組織中促凋亡蛋白的表達。

圖5 miR-320b過表達對心肌梗死大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值的影響

2.6 miR-320b過表達降低心肌梗死大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，miR-320b過表達組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）（圖6）。提示miR-320b過表達可顯著抑制心肌梗死大鼠的炎癥因子水平。

圖6 miR-320b過表達對心肌梗死大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

3 討論

心肌梗死后心室重塑與基因表達的異常改變密切相關(guān)，相關(guān)研究表明miRNA可影響心肌梗死后左心室重塑的進程，在心肌梗死和梗死后心室重塑的過程中起關(guān)鍵作用[6]。本研究通過RT-PCR和TTC染色實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-320b過表達可升高miR-320b、MHC-α mRNA水平，降低MHC-β mRNA水平和心肌梗死面積。肌球蛋白重鏈是構(gòu)成肌纖維的重要成分，可分為MHC-α和MHC-β，心肌梗死后心室重塑過程中心肌細胞內(nèi)肌球蛋白重鏈表型發(fā)生變化，由MHC-α向MHC-β轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為心肌細胞內(nèi)MHC-α表達降低，MHC-β表達升高，心肌細胞肥大[7]。限制心肌梗死大鼠的梗死面積具有抗心肌梗死的作用[8]。Zhang等[9]研究表明miRNA-203的表達增加可改善心臟功能，減少梗死面積。任愷等[10]研究顯示miR-21升高MHC-α RNA表達量，降低MHC-β RNA表達量保護心臟結(jié)構(gòu)的完整性，加速心室重塑的進展。提示miR-320b過表達與心肌梗死后心室重塑有關(guān)。

本研究通過超聲心動圖和H-E染色顯示，miR-320b過表達可升高心肌梗死大鼠LVEF、LVFS、LVSP，降低LVEDP，改善心肌組織病理損傷。LVEF、LVFS、LVSP、LVEDP是評價心功能的常用指標。心室重塑是心肌梗死的發(fā)病機制之一，而心室重塑與心肌梗死患者的病情進展及不良預后存在相關(guān)性[11]。提示miR-320b過表達可改善心肌梗死大鼠模型心功能。

本研究通過TUNEL染色和免疫印跡檢測結(jié)果顯示，miR-320b過表達可降低心肌梗死大鼠心肌組織細胞凋亡率和Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值。減少心肌組織凋亡已經(jīng)成為心肌梗死后預防心室重構(gòu)、調(diào)節(jié)心功能紊亂的重要方式[12]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2可相互作用，其形成的復合物比值的高低可判定細胞凋亡狀態(tài)[13]。caspase家族處于細胞凋亡過程中的核心地位，可通過與多種蛋白因子相互作用調(diào)節(jié)細胞凋亡，其中caspase-3在凋亡級聯(lián)中過度活化能夠促進細胞凋亡[14]。caspase-9接收信號開始作用時能夠引發(fā)凋亡，會激發(fā)caspase-3共同作用促進細胞凋亡[15]。提示miR-320b過表達可抑制心肌組織凋亡。

本研究ELISA檢測結(jié)果顯示，miR-320b過表達可降低心肌梗死大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平。心肌梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展通常伴有心肌組織炎癥，心肌損傷的嚴重程度與心肌組織炎癥密切相關(guān)，表現(xiàn)為血清中炎癥因子及趨化因子水平升高引起強烈的炎癥反應，加重心肌缺血性損傷。調(diào)節(jié)心肌梗死后的炎性應答反應可以改善心肌梗死后心臟重塑，對心肌梗死患者心肌纖維化和心功能改善具有重要意義。彭暉[16]等研究表明IL-6、TNF-α、IL-1β等炎癥因子在急性心肌梗死后心肌纖維化過程中有重要作用，上調(diào)其水平將促進膠原沉積和心肌纖維化，最終導致心室重構(gòu)[17]，表明miR-320b過表達可通過抑制炎癥因子的釋放對心肌梗死大鼠心肌組織起保護作用。