趙思宇 邵 珣

（舟山市岱山縣中醫(yī)院藥劑科，舟山 316200）

缺血性心臟病早期及時(shí)再灌注是改善患者臨床結(jié)局的有效方法[1]。心肌再灌注通過(guò)血管成形術(shù)或溶栓治療迅速恢復(fù)血液供應(yīng)，但會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性級(jí)聯(lián)損傷，即缺血再灌注 （ischemia-reperfusion， IR）損傷，從而加劇缺血性損傷，并進(jìn)一步擴(kuò)大梗死面積[2]。心肌IR損傷的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)分子過(guò)程，例如活性氧 （reactive oxygen species， ROS） 積累和炎癥細(xì)胞因子流入等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于IR的干預(yù)方法包括缺血后適應(yīng)和藥物治療，雖然對(duì)IR有不同程度的保護(hù)作用，但效果并不理想[3]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在IR領(lǐng)域取得了一定的成果[4-5]，成為了中西醫(yī)結(jié)合研究的切入點(diǎn)之一。木犀草素（Luteolin，Lut）是從多種天然藥材和果蔬中分離得到的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等多種藥理活性。研究表明，木犀草素能降低冠心病患者的死亡率，抑制糖尿病心肌病的心肌損害，并對(duì)心血管有保護(hù)作用[6]。然而，木犀草素在心肌IR中的保護(hù)作用機(jī)制尚未完全闡明，故本研究觀察木犀草素對(duì)大鼠心肌IR損傷的作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與試劑

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，約12周齡，450～500 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SYXK（浙）2018-0017）提供。所有動(dòng)物被飼養(yǎng)在恒溫（22℃±2℃）、濕度（45%±5%）、晝夜周期為12 h的籠子里，并隨機(jī)給予標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物食物和水。木犀草素（純度＞98%）、戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma-Aldrich，木犀草素溶解在二甲亞砜（DMSO）中后，用PBS稀釋。所有生化指標(biāo)試劑盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。血漿白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）β和心肌肌鈣蛋白T（cTnT）大鼠特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。LC3、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3、Bax抗體購(gòu)自Cell Signal Technology，p62、Bcl-2和caspase-9抗體購(gòu)自Abcam，TUNEL試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

將18只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型組（IR組）和木犀草素組（Lut組），每組6只。Lut組大鼠在IR前每天經(jīng)胃灌服木犀草素溶液20 mg/kg，連續(xù)7 d，Sham組和IR組大鼠在IR前每天經(jīng)胃灌服等量溶劑7 d。第8天，大鼠術(shù)前禁食12 h，腹膜注射3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，連接四肢皮下心電圖，監(jiān)測(cè)動(dòng)物心電圖，剪斷頸部毛皮，暴露氣管，插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)（呼吸頻率45～60次/分）。在胸骨左側(cè)2～3 cm處切開皮膚，肌肉分別鈍性分離，左側(cè)切斷第3～5根肋骨，暴露心。左冠狀動(dòng)脈前降支位于左心耳，在前降支下方約1～2 mm處插針，拔出第3～0根縫線，Sham組只穿線不結(jié)扎150 min。IR組同Sham組，用3～0絲線穿入冠狀動(dòng)脈左前降支，在左冠狀動(dòng)脈前降支上放置一根長(zhǎng)約1.0 cm的聚乙烯塑料細(xì)管結(jié)扎。心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高，動(dòng)脈閉塞下心肌呈紫色。30 min后切斷縫線，開放血管，恢復(fù)供血（再灌注）120 min。造模過(guò)程中，結(jié)扎30 min，Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高，再灌注120 min心電圖顯示II導(dǎo)聯(lián)部分壓低，部分心肌由紫色變?yōu)榘导t色，造模成功。Lut組手術(shù)方式與模型組相同。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)量左心室相關(guān)指標(biāo)：左室收縮末期壓（LVSP）、左室舒張末期壓（LVEDP）、+dp/dt max、-dp/dt max。

1.3 血漿促炎細(xì)胞因子及心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)

血漿IL-6、IL-1β和cTnT的水平按市售大鼠特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行分析。血漿肌酸激酶同工酶（CK-MB）采用全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。血漿超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）按南京建成生物工程研究所比色試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書測(cè)定。

1.4 心肌組織活性氧（ROS）檢測(cè)

二氫乙錠（dihydroethidium， DHE）用于測(cè)定ROS的產(chǎn)生。將不同組未固定組織的玻片與DHE（10 μmol/L）在磷酸鹽緩沖液（PBS）中室溫孵育30 min。然后，對(duì)載玻片進(jìn)行清洗、固定、安裝，并進(jìn)行熒光顯微鏡分析。

1.5 心肌組織凋亡檢測(cè)及透射電子顯微鏡分析

心組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，5 μm厚切片，根據(jù)試劑盒說(shuō)明采用TUNEL法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡。 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核百分比=TUNEL陽(yáng)性核數(shù)/總核數(shù)×100。心組織樣本固定，梯度乙醇脫水，1 μm切片，檸檬酸鉛和乙酸鈾染色后，用日立透射電子顯微鏡（HT7700）觀察切片。

1.6 免疫印跡檢測(cè)

用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液從心肌組織中分離蛋白質(zhì)，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用一抗LC3、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3、Bax、p62、Bcl-2和caspase-9孵育過(guò)夜。隨后，將膜與HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件量化各條帶，目的條帶與內(nèi)參條帶比值為各蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey’s檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)和心肌損傷的影響

所有大鼠均在手術(shù)過(guò)程中存活。實(shí)驗(yàn)大鼠的炎癥反應(yīng)和心肌損傷指標(biāo)如表1所示。與Sham組比較，IR組血漿IL-6、IL-1β、CK-MB和cTnT水平均顯著升高（P＜0.05）。與IR組比較，Lut組預(yù)處理顯著降低了IL-6、IL-1β、CK-MB和cTnT水平（P＜0.05）

表1 各組大鼠血漿促炎細(xì)胞因子和心肌損傷標(biāo)志物水平比較（±s）

表1 各組大鼠血漿促炎細(xì)胞因子和心肌損傷標(biāo)志物水平比較（±s）

#P＜0.05， ###P＜0.001 vs Sham組； *P＜0.05， ***P＜0.001 vs IR組

組別IL-6（pg/m L）IL-1β（pg/m L）CK-MB（U/L）cTnT（pg/mL）Sham組1.13±0.545.16±3.5816.87±3.6621.09±4.68 IR組158.23±58.09###43.41±38.31#845.91±194.34###539.65±118.20###Lut組83.74±47.26*3.49±3.48*57.98±30.68***284.23±265.96*

2.2 木犀草素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠ROS的影響

與Sham組比較，IR組血漿MDA水平顯著上升，而SOD水平則顯著降低（P＜0.05，表2）。與IR組比較，Lut組預(yù)處理顯著降低MDA，提高了SOD、GSH-Px水平。此外， Sham組檢測(cè)到較弱的熒光（19.22%），IR組的熒光強(qiáng)度（38.71%）顯著增強(qiáng)，而Lut組的熒光強(qiáng)度（24.15%）較IR組顯著降低（圖1，P＜0.05）。

圖1 木犀草素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠ROS的影響，標(biāo)尺=20 μm。A：Sham 組； B：IR 組；C：Lut組；D：半定量分析。###P＜0.001 vs Sham 組； ***P＜0.001 vs IR 組.

表2 各組大鼠血漿氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平比較（±s）

表2 各組大鼠血漿氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平比較（±s）

##P＜0.01， ###P＜0.001 vs Sham 組； *P＜0.05， **P＜0.01 vs IR 組

組別SOD（U/m L）GSH-Px（U/L）MDA（nmol/m L）Sham組29.68±8.43771.79±154.554.38±0.74 IR組14.47±1.62##803.08±137.3413.00±3.62###Lut組25.87±9.75*1135.9±105.23**8.90±2.84*

2.3 木犀草素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果（圖2A）顯示，在 Sham組的心肌組織中檢測(cè)到很少的凋亡心肌細(xì)胞（1.13%），但在 IR組中觀察到大量 TUNEL 陽(yáng)性心肌細(xì)胞（6.82%），2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），Lut組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（1.64%）較IR組顯著減少（P＜0.01）。此外，免疫印跡檢測(cè)凋亡標(biāo)志物結(jié)果顯示，Lut組顯著降低IR誘導(dǎo)的促凋亡蛋白Bax，裂解caspase-9的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值（P＜0.05，圖2B）。

圖2 木犀草素預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。A：TUNEL評(píng)估心室組織中的心肌細(xì)胞凋亡，標(biāo)尺=20 μm；B：免疫印跡評(píng)估 Bax、Bcl-2 和裂解 caspase-9 的蛋白水平。#P＜0.05， ###P＜0.001 vs Sham 組； *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001 vs IR 組.

2.4 木犀草素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞自噬的影響

電鏡分析結(jié)果顯示（圖3），與Sham組比較，IR組心肌細(xì)胞自噬體數(shù)量增加，Lut組自噬體數(shù)量明顯減少。此外，免疫印跡結(jié)果顯示Lut組可以顯著降低自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的水平，同時(shí)增加p62的水平（P＜0.05，圖3B）。

圖3 木犀草素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞自噬的影響

2.5 木犀草素對(duì)缺血再灌注大鼠AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路的影響

與Sham組比較，IR組顯著降低了AKT和mTOR的磷酸化（P＜0.05），而STAT3的磷酸化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，與IR組比較，Lut組顯著增加AKT、mTOR和STAT3的磷酸化水平（均P＜0.05，圖4）。

圖4 木犀草素對(duì)缺血再灌注大鼠AKT（A）、mTOR（B）、STAT3（C）信號(hào)通路的影響

3 討論

木犀草素可能對(duì)心血管疾病有保護(hù)作用，包括動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、高血壓、心肌肥厚和心力衰竭等[6]。研究表明，IR 損傷會(huì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)自由基形成和炎癥，導(dǎo)致氧化劑和炎癥介質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生[7]。氧化應(yīng)激和炎癥是心肌 IR損傷發(fā)病機(jī)制中的重要過(guò)程[8]。此外，心肌 IR 會(huì)引起炎癥細(xì)胞因子（如IL-6 和 IL-1β）過(guò)量產(chǎn)生，IL-6 和 IL-1β 是主要來(lái)自冠狀血管內(nèi)皮的促炎因子，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞粘附而加重心肌損傷[9]。據(jù)報(bào)道，木犀草素通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激在心血管疾病中起到保護(hù)作用[6]。劉方圓等[10]的研究結(jié)果也提示，木犀草素降低心肌梗死小鼠中的炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β。此外，體外實(shí)驗(yàn)證明，木犀草素降低由缺氧-復(fù)氧培養(yǎng)所引起的H9c2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧-復(fù)氧損傷[11]。本研究結(jié)果表明，木犀草素預(yù)處理可顯著降低IR所致心肌損傷的CKMB、cTnT、MDA、IL-1β和IL-6水平，同時(shí)增加SOD和GSH-Px水平，提示木犀草素預(yù)處理可能是預(yù)防IR心肌損傷的有效治療方法。

缺血引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，然后通過(guò)再灌注擴(kuò)大并部分導(dǎo)致心臟死亡[12]。據(jù)報(bào)道，IR 損傷顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，增加Bax和降低Bcl-2蛋白表達(dá)[10]。而Lut可通過(guò)上調(diào)Bcl-2/Bax來(lái)減少心肌細(xì)胞凋亡[10]。本研究中，TUNEL染色和凋亡標(biāo)志物的檢測(cè)表明，Lut處理后凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，裂解caspase-9表達(dá)下調(diào)，Bcl-2 的表達(dá)降低和Bax 表達(dá)增加。此外，自噬是一種重要的降解過(guò)程，參與依賴溶酶體的受損細(xì)胞內(nèi)胞漿蛋白和細(xì)胞器的周轉(zhuǎn)，對(duì)于維持正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要[13]。IR可通過(guò)改變心肌自噬而導(dǎo)致心肌損傷。本研究觀察到IR顯著增加了自噬小體的積累，提高了LC3水平，同時(shí)降低了p62水平。研究還表明，木犀草素可以顯著降低自噬小體的數(shù)量和LC3水平，提高p62水平。這與之前的研究結(jié)果一致，木犀草素可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌自噬體的形成，并下調(diào)LC3Ⅱ蛋白表達(dá)[13]。

木犀草素可通過(guò)激活重要的信號(hào)通路減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，從而對(duì)IR損傷具有保護(hù)作用。木犀草素預(yù)處理通過(guò)清除細(xì)胞外ROS 和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來(lái)減輕皮膚 IR 損傷，其機(jī)制部分是通過(guò)激活 PI3K/AKT 通路[14]。此外，木犀草素可通過(guò)激活 Akt來(lái)減少氧化應(yīng)激并減輕心IR 損傷[15]。AKT激活可以降低促凋亡蛋白Bax的水平，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的產(chǎn)生，可抑制 IR 損傷中的細(xì)胞凋亡[14，16]。本研究表明，木犀草素可以減少IR大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和抑制凋亡和自噬，這些變化可能受AKT和STAT3通路的調(diào)節(jié)。STAT3的激活可以導(dǎo)致STAT二聚體的形成，該二聚體移位到細(xì)胞核中，促進(jìn)抗氧化基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。另一方面，已證明 STAT3 在IR損傷、細(xì)胞凋亡、肥大、心力衰竭和產(chǎn)后心肌病中發(fā)揮作用，STAT3的激活減少IR損傷后心肌細(xì)胞凋亡[17]。以上結(jié)果表明木犀草素在大鼠心肌IR中可以作為一種抗凋亡藥物用于心臟保護(hù)。此外，木犀草素可以增加p-mTOR水平，并對(duì)腦缺血再灌注具有保護(hù)作用[18]。mTOR介導(dǎo)的自噬是缺血性心臟病發(fā)病過(guò)程中經(jīng)典的自噬激活途徑之一，與心肌細(xì)胞存活調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示p-mTOR在IR組下調(diào)，而在Lut組顯著上調(diào)，提示mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了木犀草素抵抗IR誘導(dǎo)的自噬。因此，木犀草素可以通過(guò)減輕IR中的自噬，從而減輕心肌損傷。

綜上所述，木犀草素可顯著降低心肌損傷標(biāo)志物（CK-MB和cTnT）、氧化應(yīng)激標(biāo)志物（MDA）和促炎細(xì)胞因子（IL-6和IL-1β）水平，增加了氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD和GSH-Px的水平，其機(jī)制可能是通過(guò)AKT和STAT3途徑抑制體外循環(huán)心肌細(xì)胞超氧化物生成和凋亡，以及通過(guò)mTOR途徑抑制IR大鼠心肌細(xì)胞自噬。木犀草素可能通過(guò)抑制氧化損傷、細(xì)胞凋亡和自噬而成為心肌IR大鼠中的保護(hù)因子。