鄧 聰，康嘉樂，林梅雙，林艷芬

尿路感染(urinary tract infections，UTI)是臨床上最常見的細(xì)菌感染之一[1]，其高居不下的復(fù)發(fā)率、再感染率以及日益增高的多重耐藥菌的檢出率，強(qiáng)調(diào)了發(fā)展UTI新的治療策略的必要性[2]。約75%～95%的UTI由尿路致病性大腸埃希菌(UropathogenicE.coli，UPEC)所致[3]。鐵攝取系統(tǒng)是UPEC目前已知的毒力因子之一[4-5]。

鐵是微生物生命活動的必要元素。病原菌通過分泌鐵載體與宿主體內(nèi)的鐵離子結(jié)合，形成復(fù)合物并通過外膜表面的相應(yīng)受體攝取。UPEC可以分泌多種鐵載體，包括耶爾森桿菌素、氣桿菌素、腸桿菌素和沙門菌素[6]。其中氣桿菌素已被證實(shí)通過促進(jìn)菌株生長、定植等，在肺炎克雷伯菌、禽致病性大腸埃希菌等的致病過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，但其與UPEC致病之間的關(guān)系至今仍不明確。該研究通過對氣桿菌素編碼基因iucA缺失株和回補(bǔ)株的構(gòu)建，分析iucA基因在UPEC致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 大腸埃希菌CFT073菌株(臨床UTI分離的大腸埃希菌，由美國南加州大學(xué)洛杉磯兒童醫(yī)院黃勝和教授惠贈)。pKD46質(zhì)粒、pKD3質(zhì)粒、pCP20質(zhì)粒、pRK415質(zhì)粒和人膀胱癌上皮細(xì)胞株5637由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物 24只C57BL/6雌性小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。等級：SPF級。體質(zhì)量：18～24 g。隨機(jī)分為3組(CFT073組、ΔiucA組、C-iucA組)，每組8只。

1.1.3試劑與儀器 TaqPlus DNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；L-阿拉伯糖、氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素和慶大霉素(美國Sigma公司)。 PCR擴(kuò)增儀、電擊儀(美國Bio-Rad公司)、分光光度計(jì)(美國Beckman公司)。測序由上海生工生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 本研究所用引物名稱、序列及用途見表1。引物合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。

表1 引物序列表

1.2.2CFT073iucA基因缺失株的構(gòu)建 外源性打靶片段的擴(kuò)增與純化：以pKD3質(zhì)粒為模板，iucA-F和iucA-R作為引物，擴(kuò)增含氯霉素的打靶基因。

Red重組系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)和外源線性打靶片段的電轉(zhuǎn)化：制備大腸埃希菌CFT073菌株的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將pKD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入CFT073細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素(100 μg/ml)平板，30℃培養(yǎng)過夜。挑選CFT073/pKD46單克隆，制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。iucA打靶片段轉(zhuǎn)化進(jìn)入CFT073/pKD46感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于氯霉素(chloramphenicol，Cm)平板(含34 μg/ml Cm)，37℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選22個(gè)克隆，接種LB液體培養(yǎng)基 (含34 μg/ml Cm)，37℃培養(yǎng)過夜。用基因組同源手臂外側(cè)的iucA-outF和iucA-outR引物進(jìn)行PCR檢測，當(dāng)iucA基因被Cm抗性基因替換后，引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長度由1 921 bp縮短為1 292 bp。選擇替換成功的陽性克隆，命名為CFT073/ΔiucA-Cm。

CFT073/ΔiucA-Cm克隆中Cm抗性基因的刪除：制備CFT073/ΔiucA-Cm的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入上述細(xì)胞。涂布于LB平板(含100 μg/ml氨芐青霉素)，30℃培養(yǎng)過夜。挑選單克隆劃線接種LB平板(無抗性)，42℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取7個(gè)克隆，分別接種LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。各取0.5 μl菌液用iucA-outF和iucA-outR引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，Cm抗性基因消除的克隆產(chǎn)物長度縮短為359 bp。選擇陽性克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，iucA被成功敲除，命名為ΔiucA。

1.2.3CFT073iucA基因回補(bǔ)株的構(gòu)建 采用攜帶四環(huán)素抗性基因的pRK415質(zhì)粒作為大腸埃希菌的回補(bǔ)質(zhì)粒。利用iucA-comF和iucA-comR引物從大腸埃希菌CFT073原始菌株中擴(kuò)增iucA基因，經(jīng)HindIII和EcoRI酶切后克隆入pRK415相應(yīng)位點(diǎn)，得到回補(bǔ)質(zhì)粒pRK415-iucA。制備ΔiucA電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。通過電轉(zhuǎn)化將pRK415-iucA回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入ΔiucA菌株，在四環(huán)素平板上篩選陽性克隆。經(jīng)PCR和測序驗(yàn)證，確定回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入目標(biāo)菌株，選定其中一個(gè)克隆為iucA基因回補(bǔ)菌株，命名為C-iucA。

1.2.4CFT073、ΔiucA、C-iucA增殖曲線的測定 CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株在LB培養(yǎng)液和無菌尿液中增殖曲線的測定方法見本課題組既往發(fā)表的研究[9]。

1.2.5體外黏附、侵襲實(shí)驗(yàn) 凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后至少傳代兩次，將5637細(xì)胞接種至24孔板，待長滿至細(xì)胞形成單層。按照細(xì)菌:細(xì)胞為100:1的比例將細(xì)菌接種到單層細(xì)胞。37 ℃，5% CO2孵育2 h。黏附實(shí)驗(yàn)中，孵育2 h后，用PBS清洗5遍，加入0.5%Triton X-100 裂解細(xì)胞，吸出每孔樣品梯度稀釋涂板計(jì)數(shù)，作為黏附到細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)中，每孔加入終濃度為200 mg/L的慶大霉素孵育殺死細(xì)胞外細(xì)菌，PBS清洗3遍，加入0.5%Triton X-100 裂解細(xì)胞，吸出每孔樣品梯度稀釋涂板計(jì)數(shù)，作為侵襲到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)。黏附率和侵襲率計(jì)算公式如下：

黏附率=黏附到細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)/接種總菌數(shù)×100%

侵襲率=侵襲到細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)/接種總菌數(shù)×100%

1.2.6體內(nèi)定植能力檢測 C57B/L6小鼠尿路感染模型的建立方法及CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株在膀胱定植能力檢測見本課題組既往發(fā)表的研究[10]。

2 結(jié)果

2.1 CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株增殖曲線測定將CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基和無菌尿液后，每隔2 h取樣測定A600，繪制增殖曲線顯示，在LB液體培養(yǎng)基中CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株具有相似的增殖速率(F=2.613,P=0.153)(圖1)。而在無菌尿液中，三者增殖速率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.927,P=0.003)，其中ΔiucA的增殖速率低于CFT073菌株(P=0.001)，C-iucA的增殖速率則高于ΔiucA(P=0.005)，C-iucA與CFT073菌株增殖速率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖1 CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株在LB液體培養(yǎng)基中的增殖曲線

2.2 體外黏附和侵襲能力比較比較CFT073、ΔiucA、C-iucA菌株對人膀胱癌上皮細(xì)胞株5637的黏附率和侵襲率顯示，ΔiucA組黏附率和侵襲率均低于CFT073組(P=0.007、 0.002)(圖3、4)。而C-iucA組黏附率和侵襲率與ΔiucA組相比均有所上升(P=0.046、 0.037)(圖3、4)。C-iucA組黏附率接近CFT073組，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.177)(圖3)，侵襲率則仍低于CFT073組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040)(圖4)。

圖2 CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株在無菌尿液中的增殖曲線與ΔiucA組比較：*P<0.05

圖3 CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株對人膀胱癌上皮細(xì)胞5637的黏附率與ΔiucA組比較：*P<0.05

圖4 CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株對人膀胱癌上皮細(xì)胞5637的侵襲率與ΔiucA組比較：*P<0.05；與CFT073組比較：#P<0.05

2.3 膀胱定植能力檢測成功構(gòu)建C57B/L6小鼠UTI模型后，CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株通過尿道灌注的方法感染小鼠，取膀胱組織勻漿涂平板培養(yǎng)計(jì)算定植細(xì)菌數(shù)。采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)分析顯示，CFT073組侵襲到膀胱定植的細(xì)菌數(shù)平均秩次為17.75，ΔiucA組為6.00，C-iucA組為13.75，各組之間定植細(xì)菌數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)卡方值為11.545，P=0.003)。各組之間兩兩比較顯示，ΔiucA組與CFT073組，ΔiucA組與C-iucA組之間膀胱定植細(xì)菌數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、0.017)， CFT073組與C-iucA組相比，定植細(xì)菌數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖5 CFT073、ΔiucA和C-iucA菌株在小鼠膀胱的定植細(xì)菌數(shù)與ΔiucA組比較：*P<0.05

3 討論

鐵載體作為致病過程中重要的毒力因子和可能的治療靶標(biāo)已經(jīng)在多種致病菌中被證實(shí)[11]。本課題組既往研究已經(jīng)證實(shí)鐵攝取相關(guān)基因fyuA在UPEC致病中的作用[9-10]。本研究繼續(xù)探究鐵載體氣桿菌素編碼基因iucA與UPEC致病之間的關(guān)系。

既往研究中，Rosso et al[12]通過分別構(gòu)建高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, hvKP)的氣桿菌素、沙門菌素、腸桿菌素和耶爾森桿菌素等鐵載體的合成缺失株，發(fā)現(xiàn)與野生株相比，hvKP1ΔiucA菌株(氣桿菌素合成缺失株)在腹水和血清中的存活受到影響，生長速率減低，并且在小鼠動物模型中hvKP1ΔiucA菌株表現(xiàn)為毒力減低。而沙門菌素、腸桿菌素和耶爾森桿菌素的單獨(dú)或聯(lián)合合成缺失株均不影響菌株在體外生長/存活以及在小鼠體內(nèi)毒力。提示iucA影響菌株生長繁殖，是hvKP的關(guān)鍵毒力因子。Khasheii et al[13]的研究也表明，與合成其他鐵載體的菌株相比，合成耶爾森桿菌素和氣桿菌素的UPEC表現(xiàn)出最高的生長速率。提示氣桿菌素可能有助于菌株的生長繁殖。本研究也顯示，盡管在LB液體培養(yǎng)基中野生株、缺失株和回補(bǔ)株表現(xiàn)為相似的增殖曲線，但是在無菌尿液中，iucA缺失株的生長速率低于野生株，而iucA基因的回補(bǔ)顯著回復(fù)菌株的生長繁殖能力，提示當(dāng)UPEC處于鐵含量較低的環(huán)境(無菌尿液)時(shí)，iucA基因?qū)Υ龠M(jìn)UPEC生長繁殖具有重要作用。推測iucA基因這種對菌株生長繁殖的促進(jìn)作用與其促進(jìn)鐵離子的攝取作用有關(guān)，當(dāng)處于營養(yǎng)豐富的環(huán)境(LB培養(yǎng)液)中時(shí)，盡管缺失了iucA基因，不能合成氣桿菌素，UPEC仍可以通過其它鐵載體介導(dǎo)鐵離子的攝取滿足菌株生長繁殖所需，而當(dāng)UPEC處于鐵含量較低的無菌尿液中時(shí)，iucA基因的缺失進(jìn)一步削弱了菌株對鐵離子的利用能力，導(dǎo)致生長繁殖受限。其具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

黏附和侵襲是病原菌致病的第一步，強(qiáng)大的黏附能力可以幫助尿路致病菌抵抗尿液的沖刷，黏附在上皮細(xì)胞后再侵襲進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮致病作用。在本研究中，通過野生株、缺失株和回補(bǔ)株分別與人膀胱癌上皮細(xì)胞株5637相互作用顯示，iucA缺失株的黏附率和侵襲率均低于野生株, 而在回補(bǔ)了iucA基因后，黏附率和侵襲率與缺失株相比均有所上升。提示iucA基因在促進(jìn)菌株黏附和侵襲方面同樣具有重要作用。為進(jìn)一步明確iucA基因這種介導(dǎo)菌株黏附和侵襲的作用是否有助于菌株在靶器官的定植，課題組建立了小鼠尿路感染的動物模型。3種菌株分別感染C57B/L6小鼠后，缺失株在小鼠膀胱的定植數(shù)目低于野生株，而回補(bǔ)株可以回復(fù)其在膀胱組織的定植能力，提示iucA基因有助于增強(qiáng)UPEC在靶器官的定植能力。這與Ling et al[8]發(fā)現(xiàn)缺失iucA基因的禽致病性大腸埃希菌在肝臟、腎臟、脾臟、心臟和肺臟等的定植能力大幅減低的研究結(jié)論相似。iucA基因增強(qiáng)UPEC在靶器官的定植能力的機(jī)制，可能部分與其促進(jìn)菌株的生長繁殖以及增加菌株的黏附和侵襲能力有關(guān)。

本研究通過iucA基因的缺失和回補(bǔ)，明確了鐵載體氣桿菌素在促進(jìn)UPEC生長繁殖、體外黏附和侵襲以及體內(nèi)靶器官定植中的作用。這有助于篩選與UPEC致病密切相關(guān)的鐵載體，可以為UTI抗菌藥物作用靶點(diǎn)、疫苗候選抗原選擇奠定基礎(chǔ)，并且對其他腸桿菌科細(xì)菌的致病機(jī)制研究具有借鑒意義。iucA基因介導(dǎo)UPEC生長、黏附和侵襲的具體作用機(jī)制未來還需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究明確。