孫曉梅，李名聰，2，李 濤，魏 翔，葛若木，張 軍，李昱昊，周 青，汪 淵，張勝權(quán)，張素梅

不育癥影響了全球8%～12%的夫妻，其中男性因素約占50%。男性不育與損害精子發(fā)生有關(guān)[1]。精子發(fā)生是一個(gè)高產(chǎn)且高度組織化的過(guò)程[2]，精子發(fā)生是從二倍體精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cell，SSC)提供單倍體精子的細(xì)胞分化過(guò)程。睪酮、促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)等激素的缺失會(huì)引起生殖細(xì)胞凋亡[3]。膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)和生存所必需的，并且是性激素合成的前體[4]。羊毛固醇合成酶(lansterol synthase，LSS)是膽固醇合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化(S)-2,3-環(huán)氧角鯊烯轉(zhuǎn)化成羊毛固醇。LSS雙等位基因突變的患者不僅會(huì)表現(xiàn)少毛癥、白內(nèi)障、脫發(fā)伴智力低下(alopecia with mental retardation，APMR)綜合征、隱形神經(jīng)外胚層綜合征等疾病，還會(huì)出現(xiàn)小陰莖的現(xiàn)象[5-7]。有研究[8]顯示，LSS抑制劑會(huì)降低前列腺癌細(xì)胞的活力，并在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該研究通過(guò)LSS敲除小鼠模型，探討LSS基因缺陷對(duì)雄性小鼠生殖功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物均為C57BL/6品系，LSS基因敲除的F1代小鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究所，于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)及配繁，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格保證在溫度為(20±2)℃， 相對(duì)濕度為40%～70%且明暗交替時(shí)間12/12 h的環(huán)境下，自由進(jìn)食水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作與飼養(yǎng)均符合國(guó)標(biāo)及安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理飼養(yǎng)條例。

1.1.2主要試劑 Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 Plus dye)和DL2000 bp DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；鼠尾基因型鑒定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司；LSS基因引物由南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究所設(shè)計(jì)，引物及瓊脂糖粉末購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，LSS引物序列為：Primer F：5′-ACCTCTGCGGAGTCTAAGGAAG-3′、Primer R：5′-AAGGCTCTTCACTGTTTCAGAGCT-3′；Tubulin購(gòu)自上海Abmart公司；LSS/Bax/Bcl-2購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司、GPX4購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；所有使用的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 DYY-6C電泳儀購(gòu)自于北京市六一儀器廠；普通PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；酶標(biāo)儀(1510)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；制冰機(jī)(SCOTSMAN)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠基因型鑒定 ① 鼠尾基因組DNA提?。簩NA Extraction Solution 和 Enzyme Mix 按照48 ∶2的比例充分混勻，配制成消化液。剪取0.2～1 cm的小鼠尾尖放置于250 μl的PCR管內(nèi)，向其中加入配置好的消化液50 μl。將樣品置于PCR儀中，55℃、15 min，95℃、5 min，結(jié)束后加入50 μl Stop Solution，在渦旋器上混勻，以提取小鼠基因組DNA。② PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μl)：12.5 μl Premix Taq 、1 μl F引物(10 μmol/L)、1 μl R引物(10 μmol/L)、1 μl DNA模板、加入滅菌ddH2O 9.5 μl。采用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃、3 min ，變性94 ℃、30 s，退火55℃、30 s，延伸72℃、40 s，循環(huán)35次，72℃、10 min終止反應(yīng)。③ 瓊脂糖凝膠電泳：取PCR產(chǎn)物5 μl，在1.6%瓊脂糖凝膠中及電壓90 V下，電泳90 min，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照分析。④ 基因型結(jié)果判定：根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度來(lái)進(jìn)行判斷，擴(kuò)增產(chǎn)物在328 bp左右的為野生型(WT),擴(kuò)增產(chǎn)物在328 bp和282 bp左右兩條帶均存在的為雜合子(LSS+/-)。

1.2.2生育力檢查 將8周齡的鼠按基因型和雌雄不同，分組配繁，第一批WT型和KO型雌雄各取2只，共8只鼠；第二批WT型雌雄各取5只，KO型鼠雌雄各取6只，共22只，兩批總計(jì)30只鼠，分別按♂WT×♀WT、♂WT×♀KO、♂KO×♀WT、♂KO×♀KO進(jìn)行1：1合籠，時(shí)長(zhǎng)4個(gè)月，統(tǒng)計(jì)每胎平均生仔個(gè)數(shù)、產(chǎn)仔周期。

1.2.3性激素檢測(cè) 取雄性WT型和KO型小鼠各10只，留取血清檢測(cè)性激素。

1.2.4TUNEL染色觀察睪丸中生殖細(xì)胞凋亡情況 常規(guī)制備石蠟切片，脫蠟、水合，加入細(xì)胞通透液8 min，PBS漂洗2次，滴加TUNEL反應(yīng)混合物，37℃孵育1 h,沖洗樣品，在熒光顯微鏡下觀察分析，滴加轉(zhuǎn)化劑-POD,37℃孵育30 min，洗樣品，滴加DAB底物溶液，室溫孵育10 min，光學(xué)顯微鏡鏡下觀察凋亡細(xì)胞并拍照。

1.2.5Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 根據(jù)小鼠睪丸組織的大小，加入適量的裂解液以提取總蛋白，在BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，采用SDS-PAGE凝膠電泳，配置相應(yīng)濃度的膠，分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜，加入對(duì)應(yīng)的由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，每步結(jié)束后，均要用TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯色，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果和LSS蛋白表達(dá)提取鼠尾DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后的結(jié)果如圖1所示：其中1、3、6、7、8號(hào)只出現(xiàn)一條328 bp左右的條帶，為野生型(WT)；2、4、5、9、10號(hào)出現(xiàn)328 bp和282 bp左右的兩條帶，為雜合子(LSS+/-)；與WT型相比，基因敲除小鼠的LSS蛋白表達(dá)量降低(t=18.00,P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠PCR基因型鑒定和Western blot 法檢測(cè)LSS蛋白在野生型和雜合子小鼠睪丸組織中表達(dá)水平的結(jié)果

2.2 LSS基因缺陷對(duì)雄性小鼠生育力可能有影響4組兩兩比較，平均產(chǎn)仔周期(F=1.837，P=0.155)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；每胎平均生仔個(gè)數(shù)(F=4.602，P=0.007)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)SNK-q檢驗(yàn)分析顯示♂WT×♀WT與♂KO×♀KO組比較有差異，其余組別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 LSS基因缺陷對(duì)雄性生育力無(wú)影響(n=30)

2.3 LSS基因缺陷對(duì)雄性小鼠性激素?zé)o影響采用獨(dú)立樣本Mann-Whitney U檢驗(yàn)對(duì)KO型與WT型小鼠兩組分析，性激素五項(xiàng)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明LSS基因敲除對(duì)C57小鼠性激素水平無(wú)影響(表2)。

2.4 TUNEL染色觀察睪丸中生殖細(xì)胞凋亡情況TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為紅色顆粒的細(xì)胞，TUNEL染色結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞多存在于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，凋亡細(xì)胞染色較深，可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、裂解等形態(tài)學(xué)改變。WT組的睪丸組織中很少見(jiàn)到凋亡細(xì)胞，KO 型小鼠睪丸組織凋亡細(xì)胞增多(圖2)。

圖2 6只野生型和雜合子小鼠睪丸TUNEL染色的結(jié)果WT:野生型小鼠對(duì)照組；KO:基因雜合敲除型小鼠

2.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)基因缺陷小鼠的睪丸組織中，凋亡相關(guān)蛋白Bax(t=0.340,P=0.751)、Bcl-2(t=0.962,P=0.390)、GPX4(t=0.641,P=0.557)與野生型小鼠相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

3 討論

LSS在膽固醇合成途徑的關(guān)鍵環(huán)化反應(yīng)中合成羊毛固醇。LSS在膽固醇合成過(guò)程中起決定性作用，它可能成為新型抗膽固醇藥的目標(biāo)，也可以確定為抗心絞痛藥物嗎多明的靶標(biāo)[9-11]。而LSS功能缺失對(duì)小鼠生殖功能的影響至今未有文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)LSS基因敲除后，與野生型小鼠相比，小鼠睪丸組織TUNEL染色結(jié)果顯示，KO型小鼠生精細(xì)胞凋亡水平高于WT型小鼠。兩組配繁結(jié)果顯示生仔周期無(wú)差異，每胎平均生仔個(gè)數(shù)當(dāng)雌雄均為L(zhǎng)SS型小鼠時(shí)有差異，性激素水平相比也無(wú)差異。用 Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白在野生型和雜合子小鼠睪丸組織中表達(dá)水平時(shí)，顯示促凋亡相關(guān)蛋白Bax和抗凋亡相關(guān)Bcl-2的蛋白表達(dá)無(wú)差異，表明睪丸組織生精細(xì)胞發(fā)生凋亡可能不是通過(guò)控制線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)凋亡刺激物。由于GPX4是一種可以修復(fù)脂質(zhì)過(guò)氧物，抑制其觸發(fā)由脂質(zhì)膜的氧化損傷驅(qū)動(dòng)的一種細(xì)胞死亡(鐵死亡)[12]，本研究結(jié)果顯示GPX4蛋白表達(dá)無(wú)差異，表明引起睪丸組織生精細(xì)胞發(fā)生凋亡的不是因?yàn)殍F死亡這條凋亡通路。參與細(xì)胞凋亡的途徑眾多，介導(dǎo)LSS敲除小鼠生精細(xì)胞凋亡的蛋白和分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。此外，研究[13]表明：他汀類藥物(羥甲基戊二酸單酰CoA抑制劑)可通過(guò)降低類固醇激素睪酮的生成和精子膜膽固醇的量來(lái)對(duì)男性生殖有負(fù)面影響。也有研究[14]發(fā)現(xiàn)對(duì)倉(cāng)鼠和狗中使用LSS抑制劑治療后，在身體多個(gè)部位觀察到組織病理學(xué)變化，而睪丸病變的特征是睪丸萎縮，生殖細(xì)胞耗竭和變性、生精小管塌陷及前列腺和精囊萎縮變小等。本研究在LSS基因雜合敲除小鼠中觀察到睪丸生精細(xì)胞凋亡水平高于WT型小鼠，提示、LSS基因敲除通過(guò)抑制睪丸生殖細(xì)胞生產(chǎn)而抑制小鼠生殖能力。

表2 LSS基因缺陷對(duì)雄鼠性激素水平無(wú)影響 (n=10)