張 磊，戴 朝，韓延峰，李 陽，胡玉奇，陳富雷，趙 冬

自噬關(guān)乎于人類健康并且涉及到多種疾病的多種層面[1-2]。它被認(rèn)為是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)性的溶酶體過程[3-4]，這些連續(xù)動態(tài)變化的過程被稱為自噬流[5]，其中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙，自噬將無法完成應(yīng)有的生物學(xué)功能進(jìn)而引發(fā)和罹患多種疾病。

目前自噬流研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)是從自噬角度去解釋和治療一些疾病[6]，為此建立高精細(xì)靈敏的檢測自噬流方法必不可少。最近有報道[3, 7]用LC3 ELISA定量自噬流和用電子透射顯微鏡(TEM)觀察線粒體自噬流，但它們只能測量自噬是否增加或減少而不能測量隨時間變化的動力學(xué)；且每種方法對自噬流的不同階段檢測均存有差異。該研究在原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪再復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation-reoxygenation, OGD/R)模型上，加或者不加BafA1干預(yù)后采用多種方法反復(fù)檢測自噬流變化，掌握各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)后能在自噬發(fā)生的不同時期選擇最合適的方法去研究自噬流。

1 材料與方法

1.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元來源于24 h內(nèi)出生的健康SD乳鼠，購自新疆動物中心。將分離好的皮質(zhì)神經(jīng)元接種在提前包被好的多聚賴氨酸(0.1 mg/ml)(上海生工生物工程有限公司)的六孔板中，細(xì)胞種植密度為2×106個/孔，用含有Neurobasal、2% B27、Glutamax、10% FBS(美國Gibco公司) 和青鏈霉素(美國Hyclone公司)的完全培養(yǎng)基, 置于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第7天選用皮質(zhì)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)(美國Abcam公司 )結(jié)合免疫熒光法檢測皮質(zhì)神經(jīng)元純度，定量陽性細(xì)胞比例證實(shí)純度>90%可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 免疫熒光將培養(yǎng)至第7天成熟的生長狀態(tài)良好的皮質(zhì)神經(jīng)元，用4%多聚甲醛固定30 min，后用0.1% Triton-x100透化皮質(zhì)神經(jīng)元20 min，用PBS清洗，5%脫脂牛奶封閉緩沖液30 min后棄去封閉液, 神經(jīng)元鑒定實(shí)驗(yàn)中加入一抗NSE(1 ∶100)，p62免疫染色實(shí)驗(yàn)中加入一抗p62(美國Abcam公司)(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜，第2天用PBS清洗，后與FITC偶聯(lián)的二抗(北京中杉金橋有限公司)孵育2 h，細(xì)胞核用PI(美國Sigma公司)染色，再用熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)進(jìn)行觀察。

1.3 OGD/R與藥物治療皮質(zhì)神經(jīng)元共同剝奪O2和葡萄糖1 h，模擬在體外的損傷模型[8]，去除原來的培養(yǎng)基后在六孔板內(nèi)加入無糖培養(yǎng)基DMEM(武漢普諾賽生命科技有限公司)，將盛有細(xì)胞的六孔板置于缺氧小室(美國比盧普斯羅森堡公司)中，在95% N2和5% CO2的飽和氣體中，氧濃度維持在1%以內(nèi)，溫度控制在37 ℃，OGD損傷后，更換為最初的完全培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。其中OGD/R組不做處理；BafA1組在OGD/R組的基礎(chǔ)上將BafA1(100 nmol/L)(美國Selleck公司)注入六孔板內(nèi)處理細(xì)胞4 h，所有分組在相同條件下共同再灌注24 h。

1.4 RFP-GFP串聯(lián)熒光標(biāo)記LC3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)用LC3雙熒光腺病毒轉(zhuǎn)染原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞 (上海吉凱公司)，細(xì)胞在24孔板內(nèi)以2.5×105個/孔的密度培養(yǎng)7 d，將此類腺病毒按照課題組計算好的標(biāo)準(zhǔn)加入各分組試驗(yàn)感染細(xì)胞后處理，感染皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞24 h后用熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)觀察，人工計數(shù)黃色和紅色LC3點(diǎn)，每組隨機(jī)抽取至少有50個細(xì)胞進(jìn)行定量。

1.5 TEM觀察自噬超微結(jié)構(gòu)變化培養(yǎng)7 d生長狀態(tài)良好的成熟皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行OGD/R實(shí)驗(yàn)處理24 h后，加入0.25%的胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化4℃離心機(jī)1 000 r/min離心5 min，棄去上清液后加入500 μl 2.5%戊二醛固定液4℃固定后采用JEM 1200EX(日本JEOL公司)電子顯微鏡觀察自噬體、溶酶體、自噬溶酶體的超微結(jié)構(gòu)。

1.6 Western blot將OGD/R組的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，細(xì)胞裂解產(chǎn)物用含有蛋白酶抑制劑的RIPA在冰上裂解細(xì)胞30 min，收集標(biāo)本，在4℃以下12 000 r/min離心15 min，5%脫脂牛奶在室溫下進(jìn)行封閉1h，用8%～10%的SDS-PAGE實(shí)施分離蛋白，隨即轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，之后與抗LC3(美國Abcam公司) (1 ∶1 000)，抗p62(美國Abcam公司)(1 ∶1 000)的抗體，4℃孵育過夜，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(electrochemiluminescence，ECL)觀察免疫印跡，對蛋白條帶進(jìn)行密度分析。在SQSTM1/p62結(jié)合LC3蛋白翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中，用兩組間可溶性p62的比值，不可溶性p62的比值(常規(guī)細(xì)胞經(jīng)裂解離心后在離心沉淀中加入高濃度的尿素，從而獲得了不可溶性p62)同時結(jié)合LC3Ⅱ/Ⅰ的比值評價自噬流，并將其歸一化為β-actin。 Western blot結(jié)果用ImageJ軟件進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)神經(jīng)元的鑒定成功培養(yǎng)7 d后的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，神經(jīng)元的軸突和胞質(zhì)經(jīng)NSE染色后發(fā)綠色熒光，細(xì)胞核經(jīng)PI染色后發(fā)紅色熒光，兩種免疫熒光的共存表明皮質(zhì)神經(jīng)元占所培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的95%以上(圖1)。

2.2 皮質(zhì)神經(jīng)元在OGD/R模型成功建立后自噬流的活化RFP-GFP-LC3B串聯(lián)熒光標(biāo)記LC3基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察紅色/綠色共定位的點(diǎn)狀聚集，當(dāng)RFP和GFP圖像疊加時，熒光下黃點(diǎn)(RFP和GFP共存)代表自噬小體，紅色熒光點(diǎn)表示自噬溶酶體，紅色和黃色的比值用來測量自噬流。在OGD/R組中紅點(diǎn)的總體數(shù)量明顯多于黃點(diǎn)的總體數(shù)量且紅點(diǎn)和黃點(diǎn)的比值明顯偏高，而在BafA1組顯示無論紅點(diǎn)還是黃點(diǎn)的總數(shù)量均出現(xiàn)明顯減少且紅點(diǎn)幾乎難以被檢測到(圖2A)，綜上所述，在熒光顯微鏡下觀察到的紅色/綠色共定位點(diǎn)狀聚集時OGD/R組紅點(diǎn)和黃點(diǎn)的比值明顯高于BafA1組(t=20.37，P<0.001)(圖2B)。

2.3 TEM觀測神經(jīng)元OGD/R后自噬超微結(jié)構(gòu)變化在TEM下觀察到OGD/R組與BafA1組自噬小體和溶酶體的超微結(jié)構(gòu)狀態(tài)。OGD/R組自噬小體(雙層膜結(jié)構(gòu)清晰)、溶酶體(染色質(zhì)深較聚集)、自噬溶酶體增多(圖3A、B)。在BafA1組中觀察到很少的自噬小體(膜已破壞結(jié)構(gòu)不清)和降解的溶酶體，幾乎未見到自噬溶酶體(圖3C、D)。TEM下觀察OGD/R組時自噬超微結(jié)構(gòu)清晰典型，而在BafA1處理組中觀察到的結(jié)構(gòu)模糊缺乏典型特征。

2.4 SQSTM1/p62結(jié)合LC3B蛋白翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)共同評定自噬流變化課題組同時觀察了可溶性p62蛋白、不可溶性p62蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ的轉(zhuǎn)化綜合判斷自噬流的變化(圖4)。在OGD/R組與BafA1組的實(shí)驗(yàn)中，OGD/R組的可溶性p62明顯低于BafA1組(0.58±0.02)(t=24.66，P<0.05)，而不可溶性p62蛋白兩組之間比較幾乎無明顯變化；其次，清晰地觀察到OGD/R組的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化明顯增加(0.87±0.02)(t=9.055，P<0.05)(圖4C、D),最終結(jié)果顯示OGD/R組細(xì)胞內(nèi)的自噬流明顯活躍于BafA1處理組。

圖1 NSE和PI雙重免疫熒光染色的代表性顯微圖片 400

圖2 RFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光檢測自噬流(×200)A：轉(zhuǎn)染皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞后的活細(xì)胞圖像；B：不同組的LC3的數(shù)量；與OGD/R組比較：***P<0.001

圖3 TEM下觀察自噬超微結(jié)構(gòu)的變化 ×5 000

2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色p62的分布觀測自噬流p62蛋白經(jīng)免疫熒光染色后分布在細(xì)胞質(zhì)，顯微鏡下觀察到神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)p62不同形態(tài)的含量變化及在細(xì)胞內(nèi)的定位，與OGD/R組相比，彌散型p62和聚集型p62的分布與含量在BafA1組中尤為顯著(圖5)。

圖4 SQSTM1 / p62 結(jié)合LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞自噬流

圖5 免疫熒光染色分析神經(jīng)元細(xì)胞中p62蛋白的變化判斷自噬流 ×400

3 討論

目前雖有多種方法用于檢測自噬流，但是在自噬的不同階段如何準(zhǔn)確應(yīng)用相應(yīng)方法尚不明確，每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)也不詳細(xì)。因此，精準(zhǔn)檢測自噬流已成為一種緊迫的需求和挑戰(zhàn)。課題組用動態(tài)檢測(RFP-GFP串聯(lián)熒光基因轉(zhuǎn)染)和靜態(tài)檢測(TEM、p62結(jié)合LC3蛋白翻轉(zhuǎn)、p62免疫熒光)方法觀察神經(jīng)元在OGD/R后的自噬流，在加或不加BafA1的情況下，自噬流顯現(xiàn)了兩種截然不同的趨勢，OGD/R后自噬流激活，加入BafA1后自噬流中斷，且不同的方法檢測了自噬過程的不同階段。

RFP-GFP-LC3B串聯(lián)熒光轉(zhuǎn)染細(xì)胞是研究自噬流不可或缺的利器，也是觀察RFP-GFP-LC3B融合蛋白的最佳儀器[9]。本實(shí)驗(yàn)用此技術(shù)后發(fā)現(xiàn)在OGD/R組中紅點(diǎn)的數(shù)量明顯多于黃點(diǎn)，提示自噬流激活，有學(xué)者用此方法得到了類似的效果[10- 11]。而加用自噬晚期抑制劑BafA1后黃點(diǎn)數(shù)量明顯增多，說明自噬流中斷。此實(shí)驗(yàn)最大的優(yōu)勢就是僅通過熒光強(qiáng)度的改變就可以觀測自噬流的狀態(tài)[5]。但這種方法僅能檢測到自噬的某一階段，要想充分評價自噬流的變化需要用動態(tài)的方法去檢測，比如在活細(xì)胞工作站下觀測。

TEM是檢測自噬流最經(jīng)典的方法[7]。實(shí)驗(yàn)顯示OGD/R組，自噬小體、溶酶體、自噬溶酶體結(jié)構(gòu)清晰且數(shù)量較多，而加入 BafA1后未見到完整的自噬小體，也未發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。TEM在納米分辨率下可視自噬體、溶酶體、自噬溶酶體等超微結(jié)構(gòu)，以及它們所處細(xì)胞成份的確切位置，甚至還提供了自噬完整過程的快照及超微結(jié)構(gòu)的變化[12]。但是要想觀察連續(xù)動態(tài)的圖像需要和熒光傳感器和免疫方法耦合。

完整的自噬流是將p62與LC3B相結(jié)合同時進(jìn)行檢測，這是目前判斷自噬流最為準(zhǔn)確的方法[5, 13]。通常LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，或LC3Ⅱ含量增多代表自噬流激活，LC3Ⅱ含量減少意味著自噬流的終止。p62被稱為選擇性自噬受體，它可與溶酶體融合形成自噬溶酶體而最終被清除。自噬流激活時p62水平降低，自噬流中斷時p62水平升高[11]。另外，若可溶性p62蛋白減少不可溶性p62蛋白無明顯變化，且LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化意味著自噬流激活；若可溶性p62蛋白減少不可溶性p62蛋白明顯增加，無論LC3Ⅰ是否向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化都證明自噬流中斷[14]。實(shí)驗(yàn)顯示OGD/R組的可溶性p62明顯低于BafA1組，而不可溶性p62蛋白之間無差異；OGD/R組的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，說明OGD/R后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的自噬流激活，加入BafA1后自噬流停滯。將p62結(jié)合LC3B同步檢測自噬流觀察的不僅有前期自噬小體形成過程還涉及到自噬流后期自噬溶酶體的降解，所以說是判斷自噬流最為準(zhǔn)確的方法[15]。

然而，自噬流也會出現(xiàn)波動。當(dāng)自噬流發(fā)生波動時，可溶性與不可溶性p62會滯后，為此通過p62免疫染色聯(lián)合Western blot可更為合適的去判斷自噬流[15]。實(shí)驗(yàn)中加或不加BafA1觀察到彌散型p62和聚集型p62的分布有明顯差異，正好與Western blot的結(jié)果相匹配，此方法反映了自噬流的最后環(huán)節(jié)——自噬溶酶體的降解。

總之，為了檢測神經(jīng)元OGD/R后自噬流的變化，課題組采用多種方法綜合評價，不同方法監(jiān)測了自噬流的不同階段，可以利用每種方法各自的優(yōu)點(diǎn)去互補(bǔ)，根據(jù)自噬發(fā)生的不同時期選擇最合適的方法去研究自噬流。