郭鵬飛 張永斌 許律捷 張寶月 趙君 劉艾林 杜冠華

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討“三藥三方”核心藥組用于治療新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）的中藥特性及其作用機制。方法：借助《中華人民共和國藥典》對治療新型冠狀病毒肺炎的“三藥三方”核心藥組進行中藥四氣五味歸經(jīng)毒性的分析?；赥CMATCOV平臺進行藥效分析，挖掘用藥規(guī)律。利用生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫預(yù)測核心藥組作用靶點。利用GeneCards、PubChem、DisGeNET和UniProt數(shù)據(jù)庫和文獻挖掘方法，獲取COVID-19靶點。在此基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建軟件Cytoscape進行化學(xué)成分-中藥-四氣五味歸經(jīng)毒性網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并通過韋恩圖和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，篩選核心藥組的候選靶標。然后，通過DAVID平臺、Metascape和FunRich數(shù)據(jù)庫對靶點進行富集分析。最后，應(yīng)用CB-Dock分子對接軟件對候選成分與關(guān)鍵靶點進行分子對接計算和驗證。結(jié)果：“三藥三方”共包含中藥48味，藥物四氣多屬溫、平、寒，五味多屬辛、甘、平，主要歸屬肺、胃、脾經(jīng)，最后得到“三藥三方”的核心藥組為麻黃、廣藿香、苦杏仁、甘草和石膏。核心藥組共預(yù)測得到100個化學(xué)成分和449個靶點。通過韋恩圖和PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選得到77個候選靶標作用于COVID-19。富集分析得到361個GO生物學(xué)過程條目和120條KEGG通路。通過對信號通路的歸類，發(fā)現(xiàn)核心藥組參與人體的感染性疾病系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多條信號通路起到治療COVID-19的作用。結(jié)論：本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和技術(shù)，探討了“三藥三方”治療新冠肺炎的藥性歸經(jīng)、潛在活性成分、作用靶標及其生物學(xué)過程和通路，為三藥三方的臨床應(yīng)用提供重要信息依據(jù)，并為新藥的進一步研究提供重要信息。

關(guān)鍵詞 新型冠狀病毒肺炎;“三藥三方”;核心藥組;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接

Mechanism of Core Combination in “Three Medicines and Three Prescriptions” for COVID-19 Treatment by Integrated Network Pharmacology and Molecular Docking

GUO Pengfei1，ZHANG Yongbin2，XU Lyujie1，ZHANG Baoyue1，ZHAO Jun1，LIU Ailin1，DU Guanhua1

（1 Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100050，China; 2 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Abstract Objective：To explore the characteristics and molecular mechanism of core combination in “three medicines and three prescriptions” against Coronavirus Disease 2019（COVID-19） based on network pharmacology.Methods：The core combination in “three medicines and three prescriptions” was analyzed for Chinese medicine properties（qi，flavor，and meridian tropism） and toxicity with the aid of the Chinese Pharmacopoeia（2015）.The drug efficacies were analyzed and the medication regularity was summarized based on the TCMATCOV platform.The targets of the core combination were predicted by the BATMAN-TCM and COVID-19 targets were obtained from data mining and databases，such as GeneCards，PubChem，DisGeNET，and UniProt.Cytoscape was used to construct a chemical component-core combination-Chinese medicine property and toxicity network.Subsequently，the Venn diagram and protein-protein interaction（PPI） network were employed to screen the candidate targets of the core combination.Then the targets were enriched and analyzed by DAVID，Metascape，and FunRich.Finally，CB-Dock was used for molecular docking calculation and verification of candidate components and key targets.Results：The “three medicines and three prescriptions” contain 48 Chinese medicinal drugs，and most of them are warm，plain，and cold in nature，pungent，sweet，and plain in flavor，and act on lung，stomach，and spleen meridians.Based on the frequency statistics，the core combination in “three medicines and three prescriptions” contains Ephedrae Herba，Pogostemonis Herba，Armeniacae Semen Amarum，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，and Gypsum Fibrosum.As revealed by results，100 chemical components and 449 potential targets of the core combination were obtained，and 77 candidate targets were screened out to act on COVID-19 according to the Venn diagram and PPI network.The enrichment analysis yielded 361 entries of GO biological processes and 120 KEGG pathways.In light of the classification of signaling pathways，the core combination may participate in multiple signaling pathways in the infectious disease system，immune system，nervous system，and endocrine system of the human body to treat COVID-19.Conclusion：The present study explored the Chinese medicine properties（qi，flavor，and meridian tropism），potential active components，and targets，as well as biological processes and pathways of “three medicines and three prescriptions” for the prevention and treatment of COVID-19 based on the network pharmacology，which is expected to provide references for clinical application of “three medicines and three prescriptions” and further development of new drugs.

Keywords COVID-19; “Three medicines and three prescriptions”; Core combination; Network pharmacology; Molecular docking

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.003

新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情自2019年12月以來全球已有200多個國家和地區(qū)受到影響。中醫(yī)藥用于治療新冠肺炎的戰(zhàn)役已經(jīng)取得了重要進展，并且取得了較好的臨床效果。夏文廣等[1]回顧性分析52例COVID-19中西醫(yī)結(jié)合治療療效，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥臨床治愈率為94.1%及普通型轉(zhuǎn)重型發(fā)生率為59%，均明顯優(yōu)于西醫(yī)組。國家衛(wèi)健委也已將中醫(yī)藥治療COVID-19納入《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第三版）》，并一直延續(xù)至“第六版”。

國家中醫(yī)藥管理局指出，“三藥三方”中金花清感顆粒（JHQGKL）、連花清瘟膠囊/顆粒（LHQWKL/JN）、血必凈注射液（XBJZSY）和清肺排毒湯（QFPDF）、化濕敗毒方（HSBDF）和宣肺敗毒方（XFPDF），在此次COVID-19疫情的防治工作中具有非常好的臨床優(yōu)勢。其中，JHQGKL是《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第四版至第七版）》推薦中成藥;LHQWKL/JN是《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第五、六七版）》推薦中成藥;五版和七版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》將XBJZSY分別納入治療重型和危重型COVID-19方案中。七版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》將QFPDF、HSBDF、XFPDF作為治療新冠肺炎各型的患者中成藥[2-6]。

現(xiàn)代藥理學(xué)對藥物的研究聚焦于單一成分作用于單一靶標的機制，而中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究旨在從系統(tǒng)層次和分子水平揭示中藥方劑“藥物多成分，多網(wǎng)絡(luò)靶標”的奧秘，開啟了中藥研發(fā)的新方法新模式，是目前中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要手段之一。分子對接技術(shù)是基于受體與藥物分子之間相互作用，通過計算研究配體和受體分子在結(jié)合過程中的構(gòu)象變化，從而達到輔助藥物篩選的目的，現(xiàn)已廣泛用于中藥及復(fù)方活性成分與疾病靶標的研究[7]。本研究對“三藥三方”的用藥頻次、藥組規(guī)律、核心藥組等進行系統(tǒng)分析，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)篩選出“三藥三方”核心藥組的候選化學(xué)成分和潛在靶點，構(gòu)建“化學(xué)成分-中藥-中藥四氣五味歸經(jīng)毒性”網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)、靶點功能富集網(wǎng)絡(luò)圖等多層次生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)，探討“三藥三方”核心藥組中抗COVID-19的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制，旨在為臨床精準遣方用藥、提高中醫(yī)救治水平提供理論依據(jù)。見圖1。

1 資料與方法

1.1 “三藥三方”中核心藥組中藥頻次和藥效的分析 本研究通過《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第四版至第七版）》檢索血必凈注射液（XBJZSY）、連花清瘟顆粒/膠囊（LHQWKL）、金花清感顆粒（JHQGKL）、清肺排毒方（QFPDF）、化濕敗毒方（HSBDF）、宣肺排毒方（XFPDF）的方藥組成。核心藥組的藥效分析通過中藥抗新型冠狀病毒肺炎藥效預(yù)測分析平臺（TCMATCOV：http：//tcmatcov.bbtcml.com/）進行預(yù)測分析[8]，平臺主要通過比較藥物干預(yù)前后對于疾病網(wǎng)絡(luò)拓撲特征的變化，最終以擾動分數(shù)來評價核心藥組對COVID-19的干預(yù)，從而實現(xiàn)對中藥藥效作用的快速預(yù)測分析（不涉及礦物藥）。

1.2 “三藥三方”中核心藥組化學(xué)成分和靶標的收集 本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索核心藥組中包含的藥物成分并進行口服生物利用度（OB）、藥物分子的類藥性（DL）和藥物成分半衰期（HL）的篩選。結(jié)合《中華人民共和國藥典（2015版）》查找核心藥組的四氣五味歸經(jīng)和毒性的信息。根據(jù)核心藥組中藥物的拼音從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進行藥物靶標的預(yù)測并通過UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫進行基因名的標準化。

1.3 COVID-19靶點的收集及潛在靶點預(yù)測 使用PubChem（COVID-19 Data Available）、DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫預(yù)測COVID-19的部分靶標。同時收集近期有報道COVID-19靶標的藥理學(xué)文獻確定COVID-19的靶標集[9-10]。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建?? 將篩選出來的藥物靶點和COVID-19潛在的靶標導(dǎo)入STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins）網(wǎng)絡(luò)平臺，設(shè)置置信度（High_confidence）≥0.9作為條件進行篩選，最終獲得候選靶標的互作關(guān)系。之后，將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中進行拓撲分析，并使用Cytoscape的MCODE功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行模塊劃分和分析。

1.5 候選靶點的富集分析 將候選靶點導(dǎo)入DAVID[11]、Metascape[12]和FunRich[13]數(shù)據(jù)庫進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。分析結(jié)果在Omishare Tools（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）和Circos Tableviewer（http：//mkweb.bcgsc.ca/tableviewer/visualize/）將其可視化。

1.6 候選成分-靶點分子對接 以篩選的候選成分及臨床推薦用藥（瑞德西韋、利巴韋林、洛匹那韋）和抗COVID-19藥物潛在作用靶點ACE2、RdRp、3CLpro進行分子對接。從RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載靶點的3D結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，在ChemicalBook（https：//www.chemicalbook.com/）數(shù)據(jù)庫中獲得候選化學(xué)成分的SDF格式文件，通過CB-Dock（http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）網(wǎng)站進行分子對接，CB-Dock執(zhí)行AutoDock Vina（1.1.2版本）。

2 結(jié)果

2.1 核心藥組的來源、性能分析和藥效預(yù)測 按照國家衛(wèi)生健康委員會頒布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（第七版）》《方劑學(xué)》（七版中醫(yī)教材）歸納“三藥三方”的由來、功效及核心藥組?！叭帯敝蠮HQGKL集經(jīng)典名方麻杏石甘湯、銀翹散、白虎湯為一體，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒之功效;LHQWKL/JN集經(jīng)典名方麻杏石甘湯、銀翹散為一體，具有清瘟解毒，宣肺泄熱之功效;XBJZSY在血府逐瘀湯基礎(chǔ)上研制成功，用于溫?zé)犷惣膊〉酿龆净ソY(jié)證?！叭健敝蠶FPDF集經(jīng)典名方麻杏石甘湯、麻杏薏甘湯、葶藶大棗瀉肺湯、千金葦莖湯為一體;HSBDF集經(jīng)典名方麻杏石甘湯、葶藶大棗瀉肺湯為一體;XFPDF集經(jīng)典名方麻杏石甘湯、麻杏薏甘湯、葶藶大棗瀉肺湯、千金葦莖湯為一體?！叭健笨山Y(jié)合患者實際情況使用，適合輕癥、普通型和重癥COVID-19患者的治療?！叭幦健敝泄灿嫹剿?8個，其中使用頻次大于3的有5味中藥：麻黃、甘草、苦杏仁、石膏和廣藿香，使用頻次小于等于3的方藥43個。本研究把頻次大于3的5味中藥作為“三藥三方”的核心藥組。核心藥組的5味中藥四氣主要屬辛、甘、苦和微苦，五味主要屬微溫、溫、平、大寒，其中苦杏仁有小毒。核心藥組主要歸脾、胃、肺經(jīng)。見圖2。

TCMATCOV數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明，麻黃、甘草和廣藿香的擾動總評分均大于陰性對照半夏天麻白術(shù)湯，說明麻黃、甘草和廣藿香對COVID-19疾病網(wǎng)絡(luò)有很強的干預(yù)作用，因此認為對COVID-19有一定的藥效。而苦杏仁的擾動總評分小于陰性對照半夏天麻白術(shù)湯，說明苦杏仁可能對于COVID-19的干預(yù)作用小于麻黃、甘草和廣藿香。見表1。

2.2 核心藥組-化學(xué)成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過篩選共收集到化學(xué)成分100個，包括常見的黃酮類如槲皮素（Quercetin）、甘草素（Licoisoflavone）;甾醇類如谷甾醇（Sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）;有機酸如沒食子酸（Gadelaidic Acid）。見圖3。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和候選靶標的篩選 韋恩結(jié)果表明，核心藥組的預(yù)測靶標和COVID-19靶標共有96個靶標重疊。見圖4A。運用STRING工具進行重疊靶標的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，選擇置信度（Highest_confidence）≥0.9作為篩選的標準，最后篩選出77個候選靶標。分值排名前6的靶標對分別是AKT1-GSK3B、JUN-FOS、MAPK8-JUN、CHUK-NFKBIA、CTNNB1-GSK3B。同時使用Cytoscape的MCODE功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行模塊分析，聯(lián)系最為緊密的前5個模塊見圖4B。其中，MCODE_1主要涉及的功能是白細胞介素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞因子介導(dǎo)的信號通路和白細胞介素-4、白細胞介素-13信號，主要調(diào)控免疫與炎癥反應(yīng)。MCODE_2主要涉及的功能是癌癥的通路、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)以及對無機物的反應(yīng)。周敏等[14]回顧性分析了60例COVID-19患者的臨床特征、血清多項炎癥細胞因子水平。依據(jù)患者是否發(fā)生嚴重事件（無創(chuàng)或有創(chuàng)機械性通氣，轉(zhuǎn)入ICU或死亡），分為嚴重事件組（25例）和非嚴重事件組（35例），并通過單因素及多因素logistic回歸分析影響預(yù)后的危險因素。結(jié)果表明，嚴重事件患者血清炎癥相關(guān)標志物hs-CRP、降鈣素原、鐵蛋白，以及炎癥細胞因子IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平均較非嚴重事件患者明顯升高。本研究預(yù)測的候選靶標的炎癥介質(zhì)有IL10、IL13、IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6和TNF。說明COVID-19和免疫與炎癥介質(zhì)緊密相關(guān)。

2.4 候選靶標的KEGG、GO富集分析 為了更進一步探討核心藥組通過調(diào)控候選靶標來預(yù)防和治療COVID-19的具體機制，通過DAVID和Metascape數(shù)據(jù)庫對77個候選靶點進行KEGG和GO富集分析。

KEGG通路富集分析最后得到120條信號通路，涉及傳染病的通路有20條，分為傳染?。毦魅静。纳x）、傳染?。ú《荆?類。其中富集顯著性最大的前5條傳染病相關(guān)的通路有hsa05133、hsa05142、hsa05140、hsa05164和hsa05145，候選靶標在傳染病系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要的作用。見表2，圖5A。將富集到的120條通路手動輸入到KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路的系統(tǒng)分類，最后發(fā)現(xiàn)，候選靶標富集的通路還包括免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。GO分析主要富集到361個生物學(xué)過程條目，主要囊括對脂多糖的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、凋亡信號通路、細胞因子的正調(diào)控和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等。見圖5B。

2.5 候選靶標分子功能、細胞組分、表達位點和臨床表型的富集分析 FunRich富集分析結(jié)果顯示，細胞組分中所涉及細胞外空間細胞外區(qū)域、胞質(zhì)溶膠、細胞質(zhì)、Axin-APC-β-連環(huán)蛋白-GSK3B復(fù)合物和血小板α顆粒腔等。分子功能集中于細胞因子活性、超氧化物歧化酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、配體依賴性核受體活性和轉(zhuǎn)氨酶活性等功能。表達位點主要涉及人體的子宮內(nèi)膜、前脂肪細胞、甲狀腺、腎和肺等器官。臨床表型主要集中于胰島素抵抗、免疫學(xué)、體力活動加劇、遺傳異質(zhì)性和頭痛等癥狀。見圖6。

2.6 分子對接結(jié)果分析 本研究選擇類藥性前4的化學(xué)成分與抗COVID-19藥物潛在作用靶點ACE2（PDB ID：1R42）、RdRp（PDB ID：6NUR）、3CLpro（PDB ID：6LU7）分別進行分子對接驗證。同時選擇ACE2的抑制劑瑞德西韋、RdRp抑制劑利巴韋林，3CLpro抑制劑洛匹那韋與對應(yīng)靶點對接作為陽性對照。利巴韋林和洛匹那韋已被《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》收錄，并廣泛應(yīng)用于臨床治療[15]，研究表明瑞德西韋可在低濃度下能有效控制Vero E6細胞的SARS-CoV-2感染情況[16]。對接結(jié)果表明候選化學(xué)成分與靶點的對接打分數(shù)值均小于-5 kcal/mol。其中化學(xué)成分kanzonol F和靶標ACE2對接分數(shù)為最好為-10.1 kcal/mol，而且，所選擇的候選化學(xué)成分與靶標的對接分數(shù)均優(yōu)于與陽性藥的對接結(jié)果。見表3，圖7。最后結(jié)果表明核心藥組的化學(xué)成分和所選擇對接的靶標很可能為“三藥三方”治療COVID-19的關(guān)鍵成分和靶點。

3 討論

在新冠肺炎疫情突然暴發(fā)時，臨床上缺乏有效防控的藥物，臨時篩選開發(fā)新藥周期長，難以及時應(yīng)用于臨床救治。中醫(yī)藥多靶點干預(yù)的獨特優(yōu)勢成為救治患者不可或缺的系統(tǒng)方案?！按笠叱隽挤健笔侵腥A民族幾千年來同疫病做斗爭的實踐經(jīng)驗的生動總結(jié)，其中“三藥三方”是中醫(yī)藥傳承和創(chuàng)新的精華的體現(xiàn)。Li等[17]證明連花清瘟膠囊在mRNA水平上顯著抑制SARS-CoV-2在Vero E6細胞中的復(fù)制，并顯著降低促炎細胞因子TNF-α、IL-6、CCL-2/MCP-1和CXCL-10/IP-10的產(chǎn)生而起到抵抗病毒的作用。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)血必凈通過調(diào)節(jié)肺部炎癥介質(zhì)p-p38 MAPK、NF-κB65、HIF-1α、p-IκB-α和TGF-β1的表達有效減輕大鼠的急性肺損傷。段璨等[19]將湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院123例新冠肺炎患者隨機分為觀察組82例（給予金花清感顆粒每次6 g，每日3次，聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療）和對照組41例（僅給予西醫(yī)常規(guī)治療）并觀察患者的臨床療效。結(jié)果顯示，金花清感顆粒聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療能有效改善輕型新冠肺炎發(fā)熱、咳嗽、乏力、咳痰等癥狀。2020年3月，化濕敗毒方分別選擇在金銀潭醫(yī)院、東西湖方艙醫(yī)院、將軍街社區(qū)衛(wèi)生院開展臨床療效觀察，結(jié)果顯示相比純西醫(yī)治療，本方在核酸轉(zhuǎn)陰和癥狀的改善方面有顯著差異[20]。臨床實踐證明，清肺排毒湯可以明顯改善COVID-19重癥患者的胸悶、氣促、干咳和呼吸衰竭等癥狀[21]。

在中醫(yī)藥治療新冠肺炎作用研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對接技術(shù)已用于發(fā)現(xiàn)“三藥三方”的潛在靶點與分子機制[22-27]，為臨床研究提供了寶貴的參考信息。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析了“三藥三方”中核心藥組治療COVID-19的潛在機制。

3.1 核心藥組候選靶標 本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到候選靶標涉及多種細胞因子，如IL10、IL13、IL1A、IL1B、IL2、IL4和IL6。研究表明，嚴重COVID-19中獨特的免疫失調(diào)特征為IL-6介導(dǎo)的單核細胞細胞HLA-DR低表達和淋巴細胞減少，這一現(xiàn)象與持續(xù)的細胞因子產(chǎn)生和免疫炎癥有關(guān)[28]。靶向ERK/MAPK（MAPK3）通路在病毒感染之前還是之后都在體外顯著抑制了MERS-CoV復(fù)制，數(shù)據(jù)表明ERK/MAPK信號反應(yīng)在MERS-CoV感染中起著重要作用[29]。通路富集分析表明，候選靶標JUN、CHUK、FOS、TNF、EGFR、IL1A、MAPK8、IL1B、CASP3、AKT1、MAPK1、RAF和MAPK3參與ERK/MAPK信號通路。

3.2 核心藥組候選化學(xué)成分 Zhu等[30]利用人工智能藥效預(yù)測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)甘草的主要成分之一甘草苷能抑制SARS-CoV-2在Vero細胞中的復(fù)制，EC50為2.39 μmol/L，揭示了甘草苷潛在的抗病毒機制，并在小鼠水平評價了甘草苷的安全性，實驗結(jié)果表明甘草苷可明顯抑制SARS-CoV-2在Vero細胞中的復(fù)制，其體外抗病毒效果與氯喹相近。本研究通過分子對接預(yù)測核心藥組部分候選成分與對應(yīng)靶點對接的分數(shù)均優(yōu)于陽性藥，說明其潛在的抗COVID-19的作用，但需后續(xù)進一步的藥理學(xué)實驗驗證。

3.3 核心藥組候選靶標通路富集分析

本研究表明，候選靶標富集的通路除了感染信號通路外，還涉及人體神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)等信號通路等。

3.3.1 神經(jīng)系統(tǒng) Jun等[31]研究發(fā)現(xiàn)病毒可以通過血源性途徑、周圍神經(jīng)途徑、嗅覺神經(jīng)元途徑對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的入侵而引起的神經(jīng)系統(tǒng)變化。Mao等[32]對214例確診為冠狀病毒SARS-CoV-2感染并診斷出為嚴重急性呼吸道綜合征SARS的住院患者的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，嚴重的COVID-19患者通常具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，具體表現(xiàn)為急性腦血管疾病、意識障礙和骨骼肌癥狀。因此，對于COVID-19患者，除了呼吸系統(tǒng)癥狀外，醫(yī)生還應(yīng)密切注意神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。

3.3.2 免疫系統(tǒng) Grifoni等[33]發(fā)現(xiàn)B細胞和T細胞表位在SARS-CoV-2和SARS-CoV之間具有高度保守性，靶向作用這些區(qū)域的疫苗或許能幫助機體產(chǎn)生特殊的免疫力，不僅能提供交叉感染的保護作用，還能有效抵御病毒未來的進化。Wen等[34]通過單細胞RNA測序技術(shù)全面表征COVID-19恢復(fù)期外周血單個核細胞的轉(zhuǎn)錄變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在COVID-19的早期恢復(fù)期（ERS）患者中，CD4+T和CD8+T細胞顯著減少，而CD14++？？和IL1β單核細胞增加。Bonam等[35]建議在嚴重的COVID-19病例中將免疫療法作為輔助療法，不僅可以減少炎癥、炎癥相關(guān)的肺損傷或病毒載量，而且還可以防止重癥監(jiān)護病房的住院和對機械通氣的依賴。

3.3.3 消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng) Wang等[36]收治了156例診斷為COVID-19的患者，通過電子顯微鏡、免疫組織化學(xué)、TUNEL分析和病理學(xué)研究患者肝功能損害的模式，發(fā)現(xiàn)肝臟感染SARS-CoV-2是COVID-19患者肝功能損害的重要原因。Zheng等[37]收集了3 000多個感染SARS-CoV-2患者樣本的病毒載量，并分析了病毒載量的時間變化以及不同樣本類型和疾病嚴重程度中病毒載量之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，糞便樣本中SARS-CoV-2的持續(xù)時間明顯比呼吸道和血清樣本長，并且在重癥患者中，病毒在呼吸組織中以更長的時間和更大的負荷持續(xù)存在，達到峰值的時間更晚。Xiao等[38]成功從COVID-19患者的糞便和尿液標本中分離到多株SARS-CoV-2，并對分離出的病毒進行了全基因組測序以及病毒學(xué)鑒定。上述研究證實了COVID-19患者的糞便和尿液的確存在感染性活病毒，揭示了SARS-CoV-2的傳播新途徑。Diao等[39]對武漢市某醫(yī)院收治的85例經(jīng)實驗室確認的COVID-19的患者的估算腎小球濾過率以及其他臨床參數(shù)進行了回顧性分析，最后發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2可誘導(dǎo)COVID-19患者發(fā)生急性腎衰竭，病毒直接感染人腎小管以引起急性腎小管損傷。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法開展“三藥三方”核心藥組中化學(xué)成分靶標的預(yù)測和分析，最后通過生物信息學(xué)的手段和分子對接技術(shù)來探討核心藥組候選靶標和成分治療COVID-19的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，其中部分機制的預(yù)測已經(jīng)有藥理學(xué)文獻驗證的證據(jù)，為進一步開展的實驗研究提供了參考和線索。但是，鑒于中藥化學(xué)成分不是簡單的加和、中藥成分含量和濃度會影響藥效、中藥成分與靶點的作用類型多樣化等復(fù)雜特點，后續(xù)仍需要對“三藥三方”藥效成分群和候選靶標開展進一步的體內(nèi)外驗證與臨床轉(zhuǎn)化研究，以期開發(fā)出更適用于臨床治療COVID-19的有效天然化學(xué)成分。

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（2020-10-13收稿 本文編輯：魏慶雙）