辜正策 鄧小婧 李璐池

摘要 目的：研究赤芍總苷對肺癌大鼠肺組織的作用機制。方法：將大鼠分為正常組、模型組和赤芍總苷組，觀察3組大鼠體質(zhì)量的變化情況，比較3組大鼠肺指數(shù)和肺組織形態(tài)變化，及大鼠肺組織中存活素（Survivin）、鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）表達及mRNA的表達。結(jié)果：在同一時間點，3組大鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對3組大鼠的體質(zhì)量增長幅度比較，赤芍總苷組大鼠顯著高于模型組，并且赤芍總苷組大鼠的末期體質(zhì)量也顯著重于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與正常組大鼠肺指數(shù)比較，模型組顯著升高（P<0.05），同時肺組織出現(xiàn)了明顯的惡化;與模型組比較，赤芍總苷組大鼠的肺指數(shù)顯著降低（P<0.05），并且肺組織得到了顯著的改善（P<0.05）。3組大鼠的Survivin和Kras比較，模型組陽性表達顯著增多，mRNA表達也顯著高于正常組（P<0.05）;赤芍總苷組大鼠的陽性表達和mRNA表達都顯著低于模型組（P<0.05）。結(jié)論：赤芍總苷可有效抑制肺癌大鼠肺組織中Survivin和KRAS基因的表達，同時抑制微血管的生成。

關(guān)鍵詞 赤芍總苷;肺癌;肺組織;肺指數(shù);存活素;鼠類肉瘤病毒癌基因;微血管生成;陽性表達

Mechanism of Action of Total Glucosides of Paeony on Lung Tissue of Lung Cancer Rats

GU Zhengce，DENG Xiaojing，LI Luchi

（Department of Pathology，Meishan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Meishan 620010，China）

Abstract Objective：To study the mechanism of total glucosides of paeony（TGP） on lung tissue of rats with lung cancer.Methods：The rats were divided into a normal group，a model group and a total paeony glycosides group.The body mass changes of the 3 groups were observed.The lung index and lung tissue morphology changes of the three groups were compared，and the survivin in the lung tissue of the rats was compared（Survivin），Kirsten rat sarcoma viral oncogene（KRAS） expression and mRNA expression.Results：There was no significant difference in the weight of the 3 groups at the same time（P<0.05）.Compared with the three groups of rats，the weight gain of TGP group was significantly higher than that of model group，and the final weight of TGP group was also significantly heavier than that of model group（P<0.05）.Compared with the normal group，the lung index of the model group increased significantly（P<0.05），and the lung tissue deteriorated significantly; compared with the model group，the lung index of the TGP group decreased significantly（P<0.05），and the lung tissue improved significantly（P<0.05）.The positive expression of Survivin and KRAS in the model group was significantly increased in the three groups，and the mRNA expression in the group was significantly higher than that in the normal group（P<0.05）; the positive expression and mRNA expression in the TGP group were significantly lower than that in the model group（P<0.05）.Conclusion：TGP can effectively inhibit the expression of Survivin and KRAS genes in lung tissue of lung cancer rats，and inhibit the angiogenesis.

Keywords TGP; Lung cancer; Lung tissue; Lung index; Survivin; KRAS; Angiogenesis; Positive expression

中圖分類號：R979.1;R734.2文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.006

在所有的惡性腫瘤中肺癌最為常見，并且其死亡率比其他惡性腫瘤高，患者的預(yù)后情況比其他惡性腫瘤差，通常肺癌患者5年生存率較低[1]。肺癌通常分為2種類型：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率顯著高于小細(xì)胞肺癌。在臨床上通常采用手術(shù)治療肺癌，但手術(shù)的時機非常重要，當(dāng)患者被確診為肺癌時基本都是肺癌的晚期，所以對肺癌晚期的患者來說藥物治療成為了最重要的手段[2]。芍藥和川芍藥干燥的根為赤芍，可有效抑制疼痛，同時還有清熱涼血的功效。赤芍總苷既能降低癌細(xì)胞基因的表達，還能抑制耐藥蛋白的合成，但其在肺癌中的具體作用目前尚無定論[3-4]。近年來新發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白Survivin在胚胎組織中大量地表達，但并未在人的終末分化組織中發(fā)現(xiàn)，并且其會重新地表達于各種腫瘤組織中[5]。Ras癌基因家族包括多種癌基因，其中鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene，KRAS）的突變介導(dǎo)著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。突變的KRAS會讓Ras基因產(chǎn)物p21（rasP21）蛋白持續(xù)性地激活，對靶分子進行一定的刺激，從而使細(xì)胞持續(xù)增殖，發(fā)生惡化[7]。Ponz-Sarvise等[8]研究表明，KRAS點突變的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者預(yù)后不佳。這些研究提示KRAS的突變及表達對會引發(fā)癌細(xì)胞的持續(xù)增殖和遷移等，進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，可用于NSCLC的診治以及預(yù)后評估。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程中，微血管生長是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其中微血管密度（MVD）是對惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移評估的關(guān)鍵指標(biāo)[9-10]。本研究主要探討赤芍總苷對肺癌大鼠肺組織Suivivin和KRAS的表達的影響，并探討其對肺癌大鼠微血管生成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

15周齡SD大鼠共30只，體質(zhì)量220～250 g，均購買自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，許可證號：SCXK（新）2011-0004。將大鼠飼養(yǎng)在溫度為35～40 ℃，濕度為50%～60%的動物房內(nèi)統(tǒng)一飼養(yǎng)1周，普通飼料飼養(yǎng)，所有大鼠正常攝食飲水，對新的環(huán)境讓大鼠進行適應(yīng)。動物實驗方法符合動物倫理學(xué)要求（倫理審批號：20120220005）。

1.1.2 藥物 赤芍總苷（南京希元生物醫(yī)藥科技有限公司，批號：0736-20015）

1.1.3 試劑與儀器 Suivivin和KRAS試劑盒（武漢博士德生物公司，貨號：ADxKR01）;Trizol試劑盒廠家（浙江簡石生物技術(shù)有限公司，貨號：TR205-50）;HE染色試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號：C0105S）;石蠟切片機（QIAGEN公司，德國，型號：HY-1508）;臺式低溫超速離心機（Sigma公司，美國，型號：TGL-18M）;熒光顯微鏡（北京測維光電儀器廠，型號：LW600LT）;脫水機（徠卡公司，德國，型號MWF77J型）;-80 ℃低溫冰箱（三洋公司，日本，型號：DW-86L728J）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立 將大鼠分為正常組、模型組與赤芍總苷組3組，每組10只。其中正常組大鼠不做任何處理;模型組為非小細(xì)胞肺癌大鼠模型;赤芍總苷組為非小細(xì)胞肺癌大鼠模型加赤芍總苷干預(yù)觀察組。把模型組大鼠和赤芍總苷組大鼠制備肺癌模型，均采用左肺支氣管內(nèi)一次性灌注法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)出現(xiàn)碘油時，即為肺癌模型制備成功。

1.2.2 給藥方法 造模成功后，正常組和模型組大鼠均經(jīng)背靜脈注射等體積的生理鹽水;赤芍總苷組大鼠經(jīng)同樣的位置注射240 mg/kg的赤芍總苷溶液。所有藥物均在周一至周五對大鼠進行注射，連續(xù)注射16周。

1.2.3 收集指標(biāo) 給藥16周后，處死大鼠，取兩側(cè)肺組織，稱量體質(zhì)量，并置于-80 ℃的冰箱中保存待用。

1.2.4 大鼠體質(zhì)量的測定 分別測量并比較給藥后4周、12周和16周大鼠的體質(zhì)量。

1.2.5 大鼠肺指數(shù)的測定 分別斷頭處死3組大鼠，取出大鼠的雙側(cè)肺組織，稱取其總質(zhì)量，計算大鼠的肺指數(shù)。

1.2.6 肺組織病理形態(tài)觀察 取大鼠肺組織固定于甲醛溶液中，24 h后對大鼠的肺組織進行切片處理，保證切片的厚度為4 μm，脫蠟后進行HE染色并觀察。

1.2.7 微血管密度（MVD）計算 首先用100倍光鏡掃描整個切片，尋找高血管密度區(qū)，然后用400倍光鏡對該區(qū)域進行觀察，取5個清晰的視野，分別計算視野的微血管數(shù)量，微血管密度是微血管數(shù)的平均值。

1.2.8 免疫組織化學(xué)（SP）檢測Survivin和KRAS的表達 把正常組、模型組和赤芍總苷組大鼠的肺組織用甲醛鈉溶液浸泡，染色步驟參照說明書。陽性判定：每組大鼠的陽性細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞的染色程度的評分相加。每張肺組織切片取10個清晰的視野用光鏡進行觀察。染色0分為無染色，染色1分為輕度，染色2分為深度。觀察陽性細(xì)胞數(shù)，當(dāng)小于10%時記為0分，得1分為陽性細(xì)胞在10%～25%區(qū)間，得2分為陽性細(xì)胞所占比在26%～50%區(qū)間，得3分為陽性細(xì)胞所占比在51%～75%區(qū)間，得4分為陽性細(xì)胞所占比在75%以上。把每組細(xì)胞的2個得分相加為判定最后陽性細(xì)胞的分?jǐn)?shù)，當(dāng)總得分小于2時為陰性，當(dāng)?shù)梅执笥诘扔?時為陽性。

1.2.9 qRT-PCR檢測肺組織Survivin和KRAS mRNA的表達 分別取出3組大鼠的肺組織，用Trizol進行裂解并提取總的DNA，所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照說明書進行，對所得的cDNA進行熒光實驗。嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進行擴增，變性3 min 94 ℃，變性10 s 95 ℃，退火7 min 72 ℃，一共35個循環(huán)。取平均值后得到Ct值，計算方法用2-△△Ct法。見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對3組大鼠的體質(zhì)量、肺指數(shù)、肺組織病理變化和MVD進行分析比較，并對3組大鼠的Survivin、KRAS和VEGF的表達進行檢測，用t檢驗比較2組數(shù)據(jù)，用單因素分析法對3組數(shù)據(jù)進行分析，計算采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠的體質(zhì)量比較 隨著時間的增加，3組大鼠的體質(zhì)量也逐漸地增長，但在初始體質(zhì)量、給藥4周、12周內(nèi)，3組大鼠的體質(zhì)量沒有顯著的變化（P>0.05）。見表2。給藥16周后，模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于正常組;赤芍總苷組大鼠體質(zhì)量明顯高于模型組（P<0.05）。見圖1。

2.2 3組大鼠肺指數(shù)比較 與正常組大鼠的肺指數(shù)比較，模型組顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，赤芍總苷組大鼠的肺指數(shù)顯著降低（P<0.05）。見表3，圖2。

2.3 3組大鼠肺組織病理形態(tài)比較 模型組大鼠的肺組織較正常組肺組織體積明顯變大，肺泡囊也顯著擴張，并且模型組的纖毛上皮細(xì)胞也損傷嚴(yán)重;干預(yù)后的赤芍總苷組大鼠肺組織明顯好轉(zhuǎn)。見圖3。

2.4 3組大鼠微血管密度（MVD）比較 模型組大鼠的MVD顯著高于正常組（P<0.05）;干預(yù)后的赤芍總苷組大鼠的MVD顯著低于模型組（P<0.05）。見表4，圖4～5。

2.5 免疫組織化學(xué)（SP）檢測Survivin和KRAS表達的比較 模型組大鼠Survivin和KRAS陽性表達顯著高于正常組，干預(yù)后的赤芍總苷組大鼠Survivin和KRAS陽性表達顯著降低（P<0.05）。見表5，圖6。

2.6 qRT-PCR檢測肺組織Survivin和KRAS mRNA的表達 3組大鼠的Survivin和KRAS mRNA表達比較，模型組顯著高于正常組（P<0.05）;干預(yù)后的赤芍總苷組大鼠的Survivin和KRAS mRNA表達明顯降低（P<0.05）。見表6，圖7。

3 討論

肺癌目前已經(jīng)是全世界共同關(guān)注的健康問題，我國肺癌患者每年增加60萬以上[11]。在惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率和病死率都排在第一位，雖然手術(shù)是治療肺癌的最佳方法，但患者被確診時就已經(jīng)錯過了最佳的手術(shù)時機，多數(shù)患者采用放療、化療等方法，但治療效果往往不理想，對社會和患者造成較大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。肺癌的發(fā)生發(fā)展，以及肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是由多種基因、多個步驟共同完成的病理過程，在這個病理過程中會有大量的微血管生成[12]。細(xì)胞外微環(huán)境出現(xiàn)局部缺氧時，腫瘤血管生成會自動啟動，使促血管生長因子表達;當(dāng)腫瘤血管生成出現(xiàn)異常時，機體血管中生成因子和抑制因子的平衡就會被打破，即腫瘤組織中促血管生成因子占主導(dǎo)，減少血管生成抑制因子的表達，會誘發(fā)大量的血管生成，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[13-14]。當(dāng)恢復(fù)血管生成平衡時，會促進腫瘤組織異常血管凋亡，使血管暫時恢復(fù)到基本正常狀態(tài)。所以，有效阻斷腫瘤血管的大量生成可為肺癌的診治提供新的思路。

赤芍總苷為赤芍藥中不同苷類的總稱。赤芍總苷能有效的保護肝臟，還能抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，保護神經(jīng)系統(tǒng)和心臟不受損傷，對血栓、氧化和內(nèi)毒素都有一定的抑制作用[15]。

近年來，對赤芍的研究隨著中藥化學(xué)的進展而不斷的增多，由此發(fā)現(xiàn)赤芍總苷可有效抑制腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌大鼠的體質(zhì)量明顯減少，赤芍總苷干預(yù)后肺癌大鼠的體質(zhì)量明顯增加，由此說明，赤芍總苷能有效抑制腫瘤因子導(dǎo)致的營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂，進而使體質(zhì)量在平穩(wěn)狀態(tài)下增長。肺癌大鼠的肺指數(shù)出現(xiàn)明顯異常，肺體積也明顯增大，赤芍總苷干預(yù)后肺癌大鼠的肺指數(shù)明顯降低，且肺組織明顯改善。由此可見，赤芍總苷可有效地減輕肺臟的病變程度，保護肺臟的同時抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展。陳儀坤等通過對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，赤芍總苷能有效的抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。高曉會等[17]研究發(fā)現(xiàn)，赤芍總苷可抑制人肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，主要的機制是對AKT通路的抑制，使MMP-2表達降低。

血管新生是指機體在正常生長發(fā)育過程中，或創(chuàng)傷修復(fù)和缺血缺氧條件下，在原有血管叢基礎(chǔ)上經(jīng)出芽或其他方式形成新血管的過程。血管的生成或通過腫瘤的發(fā)展進行誘導(dǎo)，并且腫瘤也會依賴新生的血管進行生長和轉(zhuǎn)移[18]。癌細(xì)胞的增殖和癌的復(fù)發(fā)都受新生腫瘤血管影響，其也影響著癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前衡量新血管生成的標(biāo)準(zhǔn)為微血管的密度，其可反映腫瘤血管的生成和腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，同時還能反映治療后腫瘤復(fù)發(fā)的情況[19]。肺癌大鼠的微血管密度出現(xiàn)異常升高，赤芍總苷干預(yù)后肺癌大鼠的微血管密度減少?？梢?，赤芍總苷可顯著抑制微血管的密度，進而有效抑制腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)Survivin和KRAS在肺癌大鼠的中陽性表達，赤芍總苷可抑制肺癌大鼠中Survivin和KRAS的陽性表達。有研究發(fā)現(xiàn)，在促腫瘤微血管成長因子中，Survivin是其中最主要的一員，介導(dǎo)腫瘤組織的表達和血管的生成，并且Survivin對三維血管的形成有重要的影響，對內(nèi)皮細(xì)胞的生長和趨化有一定的刺激，同時能有效保護細(xì)胞的完整性，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的成活和血管的生成。Ras是癌基因的一種，在惡性腫瘤基因突變中，Ras占據(jù)30%以上。KRAS是Ras的一種亞型，多發(fā)于胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中，由此可見KRAS突變腫瘤極具危害性。王海艷等[20]對結(jié)直腸癌患者研究證實，在直腸癌患者中KRAS的突變是頻發(fā)性的，雖然體內(nèi)的Nras基因和Braf基因的突變相對較弱，但也不能小覷。赤芍總苷組大鼠的Survivin和KRAS的陽性表達和mRNA表達均顯著降低，可見赤芍總苷可明顯抑制肺癌的發(fā)生，肺癌發(fā)生可能和抑制Survivin和KRAS的表達有關(guān)。赤芍總苷具有多種藥理作用，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，同時對血管的生成和腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移均有一定的抑制作用。張立廣等[21]研究發(fā)現(xiàn)，赤芍總苷可抑制肺癌大鼠中MRP、MDR1、P21及P53基因的表達。

綜上所述，赤芍總苷可有效的抑制肺癌大鼠肺組織中Survivin和KRAS的表達，同時對微血管的生成也有顯著的抑制作用。

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（2020-06-30收稿 本文編輯：楊燕）