郭 晶，麥銳杰，董 浩,2,3,4，曾曉房,2,3,4，白衛(wèi)東,2,3,4，楊 娟,2,3,4,*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510225；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，廣東 廣州 510225；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣東 廣州 510225）

味覺增強(qiáng)劑通常是指那些本身無味但能增強(qiáng)基本味感的物質(zhì)，這些物質(zhì)在食品行業(yè)越來越受到關(guān)注，因為它們往往具有某些特殊屬性，例如，無熱量甜味增強(qiáng)劑能夠取代部分糖用于食品和飲料中，以供如患有肥胖和糖尿病等有健康問題的人群選用[1-2]，增咸劑代替部分鈉鹽的使用可以降低患心血管疾病的風(fēng)險，同時還能保持食品的口感[3]。因此，健康、天然的味覺增強(qiáng)劑具有重要的保健養(yǎng)生價值和商業(yè)價值。

γ-谷氨酰-纈氨酸（γ-Glu-Val）是一種N端含有γ-谷氨酰殘基的小分子二肽，廣泛存在于菜豆、奶酪、酵母提取物、發(fā)酵饅頭等食物中[4]。γ-Glu-Val在水溶液中呈現(xiàn)澀味，閾值為3 300 μmol/L[5]。將γ-Glu-Val添加至醬油、雞湯中可賦予食物厚味味感，其閾值分別為550 μmol/L和400 μmol/L[6]，其厚味強(qiáng)度是還原型谷胱甘肽的0.61 倍[7]。γ-Glu-Val可通過谷氨酰胺酶或者谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶法合成，其產(chǎn)率達(dá)到31.7%[6]，是一種能夠商業(yè)化生產(chǎn)的呈味基料。事實上，幾乎所有具有厚味呈味特性的γ-谷氨酰肽均具有多變的呈味特性，即它們在水溶液中主要呈澀味[5,8-10]，少部分在水溶液中還具有基本呈味特性，如γ-Glu-Glu具有鮮味[11]，γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Phe具有輕微的酸味[10]，γ-Glu-Tyr、γ-Glu-γ-Glu-Tyr、γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu-Tyr具有苦味[12]；這類肽最主要的特征是可賦予食物濃厚感、滿口味、豐富度和持續(xù)性等厚味味感[5-6,8-9,11-18]；此外，“厚味”γ-谷氨酰肽還可以增強(qiáng)基本呈味物質(zhì)的呈味強(qiáng)度[9,12,19]，如增強(qiáng)食鹽的咸度、蔗糖的甜度、味精和雞湯的鮮度[4,6-7,12,18-20]。而目前對于γ-谷氨酰肽增味作用的關(guān)注較少，尤其是機(jī)制方面，少量的研究主要集中于其增鮮作用方面[6,12,16,18,20]。

G蛋白偶聯(lián)受體家族中異源二聚體T1R1-T1R3和T1R2-T1R3[21]是鮮味和甜味的味覺感受器受體，它們除了可以感知鮮味、甜味物質(zhì)外，也可以感知增鮮、增甜物質(zhì)，如核苷酸和鮮味肽通過與T1R1-T1R3受體相互作用，表現(xiàn)出鮮味增強(qiáng)作用[22-26]；本身無味的小分子增甜劑因能夠正向變構(gòu)調(diào)節(jié)T1R2-T1R3而被證實具有增甜作用，在食品和飲料中能夠取代蔗糖的使用，降低產(chǎn)品中的熱量[1-2]；此外，有學(xué)者通過研究γ-谷氨酰肽與T1R3的相互作用，驗證了其增鮮作用[19]。分子對接模擬技術(shù)主要用于識別小分子與蛋白受體結(jié)合的正確構(gòu)象和估計蛋白質(zhì)-配體相互作用的強(qiáng)度，目前已廣泛用于分析呈味物質(zhì)與味覺受體間的相互作用[19,22-24,26]。因此，本實驗將通過分子模擬技術(shù)和感官實驗對γ-谷氨酰肽（以γ-Glu-Val為例）的增味作用機(jī)制進(jìn)行研究，并對γ-Glu-Val的增味作用，尤其是增甜和增鮮作用進(jìn)行感官驗證，同時通過分子模擬實驗比較γ-Glu-Val增味作用差異性，以期為進(jìn)一步驗證其呈味機(jī)理提供理論支撐，并為此類小肽增味作用的機(jī)理研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

γ-Glu-Val購于南京肽生物技術(shù)有限公司。NaCl、味精和蔗糖均購自廣州當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204B型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1γ-Glu-Val增味作用的感官分析

參照Oshu等[7]的方法，將2 mmol/Lγ-Glu-Val添加到適當(dāng)醬油（體積分?jǐn)?shù)1%）或者雞湯粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）溶液（pH（6.50±0.05））中，得到相應(yīng)的混合溶液，對比并記錄添加γ-Glu-Val前后溶液所具有的咸味、甜味和鮮味呈味得分，以評價它對基本呈味物質(zhì)的味覺增強(qiáng)作用）。實驗通過五分制評分法進(jìn)行評分，0 分表示被檢測的樣品沒有味道，5 分則表示樣品具有顯著的味道。選擇11 名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官評價人員（男、女分別6 名和5 名，年齡在21～32 歲之間），在專業(yè)的感官評價室進(jìn)行呈味評價，室內(nèi)溫度為（23±2）℃。品評員需品嘗的樣品量為10 mL，樣品在口中停留25 s后緩慢吞咽。記錄基本味覺評分。

1.3.2 同源建模

利用同源建模軟件Modeller 9.20構(gòu)建T1R1、T1R2和T1R3的三維結(jié)構(gòu)，模板選用1EWK的A鏈。受體分子從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下載。配體包括谷氨酸、蔗糖和γ-Glu-Val，通過ChemBioOfficer 2010軟件畫出配體的結(jié)構(gòu)式。

同源建模：在建模過程中，氨基酸序列的疊合利用Modeller 9.20軟件自帶的align2d script程序進(jìn)行，T1R1、T1R2和T1R3三維結(jié)構(gòu)的同源構(gòu)建利用Modeller 9.20軟件自帶的model-single script程序進(jìn)行。最后綜合利用GA341 score（值越大越好）、molpdf score（值越小越好）、DOPE score（值越負(fù)越好）3 個指標(biāo)選取最優(yōu)的同源建模結(jié)果。

1.3.3 分子對接

為了評價γ-Glu-Val的增味作用機(jī)理，首先需要將同源建模得到的受體蛋白結(jié)構(gòu)與1EWK的A鏈蛋白利用Pymol軟件進(jìn)行分子疊合，得到T1R1-谷氨酸鈉（monosodium glautamate，MSG）、T1R2-蔗糖、T1R3-MSG復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)，以此復(fù)合蛋白為分子對接受體，在進(jìn)行分子對接前進(jìn)行加氫原子和加AMBER7 FF99電荷處理。配體γ-Glu-Val同樣需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化與加電荷處理。利用Sybyl x-2.1軟件進(jìn)行加氫原子加和Gasteiger-Huckel電荷，利用Sybyl x-2.1軟件的Powell能量最小化法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，采用的優(yōu)化最大步長為1 000 步，能量梯度為0.021 kJ/（mol·?）。此后采用Sybyl x-2.1軟件的Surflex分子對接模塊進(jìn)行配體-受體的分子對接，記錄對接得分和參與的氨基酸殘基情況。

1.3.4 分子動力學(xué)模擬

將分子對接得到的3 個復(fù)合物的構(gòu)象作為分子動力學(xué)模擬的起始構(gòu)象，并將3 個動力學(xué)模擬體系分別命名為T1R1-Peptideγ-Glu-Val、T1R2-Peptideγ-Glu-Val和T1R3-Peptideγ-Glu-Val。

動力學(xué)模擬參數(shù)設(shè)置：將以上3 個體系分別置于由TIP3P水分子組成的立方體水盒子中心。以標(biāo)準(zhǔn)的AMBER03（ff03）力場和常用的小分子AMBER（gaff）力場分別作用于受體蛋白T1R3和γ-Glu-Val。由于在gaff力場中缺乏γ-Glu-Val的電荷參數(shù)，所以先用Gaussian 03軟件的HF/6-31G*方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和計算靜電勢，然后利用Amber 12軟件中的Antechamber程序，應(yīng)用Restrained Electrostatic Potential（RESP）靜電勢收斂方法計算γ-Glu-Val的靜電荷，最后利用Antechamber程序整合所有γ-Glu-Val所需的力場參數(shù)。

優(yōu)化之后采用逐步升溫法進(jìn)行升溫，即整個體系要從0 K升到310 K（生理環(huán)境的溫度），分7 次完成，每次60 ps。最后對每個體系進(jìn)行10 ns恒溫310 K的分子動力學(xué)模擬，采用的步長為2.0 fs。在模擬過程中，SHAKE和Particle mesh Ewald算法分別用來處理所有含氫化學(xué)鍵的運動和長程靜電相互作用。在構(gòu)象采樣過程中，軌跡每隔1 ps進(jìn)行保存，可用于后期MM/GBSA法計算結(jié)合自由能和分解自由能。T1R-Peptide的結(jié)合自由能按公式（1）～（3）計算。

式中：Gcomplex為復(fù)合物自由能/（kJ/mol）；Gprotein為蛋白自由能/（kJ/mol）；Gligand為配體自由能/（kJ/mol）；ΔEMM表示蛋白與配體的氣相（即真空下）相互作用能/（kJ/mol），它包含范德華力能ΔEvdw/（kJ/mol）和靜電相互作用能ΔEele/（kJ/mol）；ΔGGB和ΔGSA分別表示極性溶劑效應(yīng)能/（kJ/mol）和非極性溶劑效應(yīng)能/（kJ/mol）；-TΔS表示在T溫度下的構(gòu)型熵/（kJ/mol）。在ΔGbind計算過程中，溶劑和溶質(zhì)的介電常數(shù)分別設(shè)置為80和4，計算所需的構(gòu)象來源于6～10 ns平均抽樣得到的200 幀?？紤]到構(gòu)型熵的計算耗費機(jī)時過長且不會影響氨基酸的貢獻(xiàn)差異，本項目將不計算TΔS。MM/GBSA自由能分解分析用來計算蛋白的每個殘基與配體的相互作用，采用Amber 12軟件中的mm_pbsa.pl模塊進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗重復(fù)3 次平行，數(shù)據(jù)取以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-Glu-Val的增味作用

γ-Glu-Val已經(jīng)被證實具有多變的呈味特性[5-7]。為了進(jìn)一步證實它對于基本味感的增強(qiáng)作用，將適量γ-Glu-Val分別添加到醬油或者雞湯中，評價溶液基本味感（甜、鮮、咸和酸）和厚味味感的增強(qiáng)作用。如圖1所示，γ-Glu-Val的添加可以增強(qiáng)醬油和雞湯的厚味味感和基本味感（甜、鮮、咸和酸）；其中，對于厚味味感的增強(qiáng)效果最為明顯，其次是鮮味和咸味。γ-Glu-Val對于酸味也有輕微的增強(qiáng)效果，可能是由于γ-Glu-Val本身含有羧酸基團(tuán)。對于鮮味和咸味的增強(qiáng)效果明顯強(qiáng)于甜味，這與文獻(xiàn)[4,6,13]的報道吻合。Yang Juan等[19]的研究表明存在MSG時，γ-谷氨酰肽可以通過與T1R3的交互作用增強(qiáng)鮮味。目前鮮見對于增味作用的差異性機(jī)制研究。

圖1 γ-Glu-Val對食品（雞湯和醬油）風(fēng)味的增強(qiáng)作用Fig.1 Taste enhancement of foods (chicken broth and soy sauce)by γ-Glu-Val

2.2 γ-Glu-Val的增味作用機(jī)理

2.2.1 同源建模分析結(jié)果

如圖2所示，在T1R1-MSG復(fù)合受體中，MSG中的α-羧酸基團(tuán)與T1R1中Ser-300的羰基基團(tuán)、Arg-277和Thr-149的—NH基團(tuán)相互作用；MSG中的—NH基團(tuán)與Ala-170和Asp-147的羰基基團(tuán)相互作用；MSG中的γ-羧酸基團(tuán)與Ala-170的羰基基團(tuán)相互作用。其中，Asp-147、Thr-149和Arg-277也存在于谷氨酸與T1R1之間的結(jié)合位點[22]，以及MSG和IMP與T1R1之間的結(jié)合位點[21]。在T1R2-蔗糖復(fù)合受體中，T1R2的活性中心及附近有6 個關(guān)鍵氨基酸殘基（Ser-40、Asp-142、Ser-144、Ser-165、Asp-278和Ser-303）參與受體與蔗糖的交互作用。其中Ser-40、Asp-142、Ser-144、Ser-165和Asp-278也存在于阿斯巴甜與T1R2之間的結(jié)合位點[27]。在T1R3-MSG復(fù)合受體中，MSG的α-羧酸基團(tuán)與Gly-168和Asp-190的羰基基團(tuán)、Ser-170的—NH基團(tuán)相互作用；MSG的—NH基團(tuán)與Glu-301的羰基基團(tuán)相互作用。其中Glu-301和Gly-168被報道分別為茶氨酸與T1R3之間的結(jié)合位點[28]、谷氨酸與T1R3之間的結(jié)合位點[29]。

圖2 復(fù)合受體構(gòu)象及其氨基酸殘基位置Fig.2 Conformations and amino acid locations of taste receptor complexes

2.2.2 分子對接分析結(jié)果

采用Sybyl x-2.1軟件中Surflex分子對接程序測定γ-Glu-Val與不同受體復(fù)合物的親和力大小，用于評價γ-Glu-Val的味覺增強(qiáng)作用。對接分?jǐn)?shù)越高，說明其與受體的親和力越高。如表1所示，γ-Glu-Val與3 個受體復(fù)合物（T1R1-MSG、T1R3-MSG和T1R2-蔗糖）對接得分分別為8.180 1、6.354 8 分和4.539 7 分，表明γ-Glu-Val對T1R1的親和力最高，對T1R2的親和力最低，其中T1R1-T1R3、T1R2-T1R3分別是鮮味和甜味的味覺受體蛋白，此結(jié)果也暗示了γ-Glu-Val對鮮味受體的親和力強(qiáng)于對甜味受體的親和力。

表1 γ-Glu-Val與受體復(fù)合物對接得分Table 1 Scores for molecular docking of γ-Glu-Val with receptor complexes

如表2所示，γ-Glu-Val分別調(diào)動了3 個受體中的17、7 個和11 個氨基酸殘基參與小肽與受體復(fù)合物的交互作用，調(diào)動的氨基酸數(shù)量與文獻(xiàn)報道的類似小肽對味覺受體的調(diào)動效果[22,26,30-31]基本吻合。由表2可知，仍然是T1R1中被調(diào)動的氨基酸殘基數(shù)更多，顯示出小肽與此受體的超強(qiáng)結(jié)合力，此結(jié)果也暗示γ-Glu-Val對T1R1的親和力最強(qiáng)。此外，γ-Glu-Val與復(fù)合受體中的呈味物質(zhì)（MSG和蔗糖）有較強(qiáng)的交互作用，表明呈味物質(zhì)與增味劑在呈味受體活性中心可能存在一定的相互作用。

表2 γ-Glu-Val與受體復(fù)合物中發(fā)生交互作用的氨基酸殘基Table 2 Interaction of γ-Glu-Val with amino acid residues in taste receptor complexes

2.2.3 分子模擬分析結(jié)果

通過MM/GBSA計算了T1Rx-Peptide間的結(jié)合自由能，結(jié)果見表3，其中T1R1-Peptideγ-Glu-Val、T1R3-Peptideγ-Glu-Val、T1R2-Peptideγ-Glu-Val3 個配體-受體間總的結(jié)合自由能分別為（-165.807 5±10.255 7）、（ -118.505 7± 10.716 2） kJ/mol和（-93.557 1±12.013 8）kJ/mol?？梢钥闯?，T1R1-Peptideγ-Glu-Val間相互作用力最強(qiáng)，T1R2-Peptideγ-Glu-Val間相互作用力最弱。這3 個體系總的結(jié)合自由能中主要貢獻(xiàn)來自于范德華力能（ΔEvdw）。雖然各個體系中靜電作用力能ΔEele也較大，但極性溶劑效應(yīng)能ΔGGB幾乎完全抵消了靜電吸引作用力，即在考慮溶劑效應(yīng)的情況下，總的靜電作用（ΔEele+ΔGGB）對于T1Rx-Peptide間相互作用貢獻(xiàn)較小?？偟膩碚f，γ-Glu-Val對T1R1的親和力最強(qiáng)，暗示其對鮮味的增強(qiáng)作用最強(qiáng)。

表3 通過MM/GBSA計算結(jié)合自由能Table 3 Binding free energy calculated from MM/GBSA

鑒于γ-Glu-Val對T1R1的親和力最強(qiáng)，為了進(jìn)一步評價γ-Glu-Val的增味作用差異性，同時揭示γ-Glu-Val與受體進(jìn)行動力學(xué)模擬的過程中是否發(fā)生明顯的構(gòu)象變化，計算了受體蛋白T1R1主鏈原子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD），如圖3所示，受體蛋白在6 ns內(nèi)的時間就很快達(dá)到了動態(tài)平衡，且RMSD的平均值只有3.0 ?左右，表明受體蛋白T1R1的主鏈原子位移偏移很小，也說明T1R1-Peptide體系很快達(dá)到了動態(tài)平衡狀態(tài)。此外，從圖3中可以看出，6 ns后T1R1-Peptide體系處于動態(tài)平衡狀態(tài)，因此在最后4 ns平穩(wěn)的運動軌跡構(gòu)象進(jìn)行MM/GBSA結(jié)合自由能計算和自由能分解計算是合理的。

圖3 在10 ns的動力學(xué)模擬過程中主鏈原子的均方根偏差Fig.3 Root mean square deviation of backbone atoms during 10 ns kinetic simulation

如圖4所示，T1R1-Peptideγ-Glu-Val體系中，T1R1中有6 個氨基酸殘基參與了和γ-Glu-Val的交互作用，它們分別為Phe-274、Ser-275、Ser-300、Trp-303、Ala-147、Ala-170。其中γ-Glu-Val與Ser-300側(cè)鏈羥基、Trp-303側(cè)鏈吲哚環(huán)上的氨基、Ala-147主鏈羰基形成了5 條氫鍵。同時γ-Glu-Val與Phe-274、Trp-303和Ala-147間也通過疏水作用相互交聯(lián)。如圖5所示，參與交互作用的各個氨基酸殘基，如Phe-274、Ser-275、Ser-300、Trp-303、Ala-170也參與自由能的形成，說明它們對于γ-Glu-Val與受體T1R1的相互作用具有至關(guān)重要的作用。

圖4 γ-Glu-Val-T1R1-MSG之間結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)表示（A）和γ-Glu-Val-T1R1-MSG晶體結(jié)構(gòu)的LIGPLOT輪廓（B）Fig.4 Structural representations of binding sites between γ-Glu-Val-T1R1-MSG (A) and LIGPLOT profile of the crystal structure of γ-Glu-Val-T1R1-MSG (B)

圖5 參與自由能形成的γ-Glu-Val-T1R1-MSG的主要氨基酸殘基的分解Fig.5 Major amino acid residues involved in binding free energy decomposition of γ-Glu-Val-T1R1-MSG

3 結(jié) 論

γ-Glu-Val具有多變的呈味特性，可以通過生物酶制劑大量制備，因此是一種具有潛在商業(yè)價值的增味劑。本研究采用感官實驗結(jié)合分子模擬技術(shù)，針對其增味作用差異性進(jìn)行探究。首先通過感官實驗驗證了γ-Glu-Val的增味作用，結(jié)果顯示此小肽具有增強(qiáng)味精和醬油厚味和基本味感的作用，其中對于鮮味和咸味的增強(qiáng)效果明顯強(qiáng)于甜味。利用同源建模軟件Modeller 9.20分別構(gòu)建得到T1R1-MSG、T1R2-蔗糖和T1R3-MSG 3 種受體復(fù)合物構(gòu)象，模擬基本呈味物質(zhì)和γ-Glu-Val同時作用于受體的生理環(huán)境。γ-Glu-Val對3 個味覺受體的親和力大小（對接得分）分別是：T1R1-MSG對接得分8.180 1 分、T1R3-MSG對接得分6.354 8 分、T1R2-蔗糖對接得分4.539 7 分，說明此γ-Glu-Val對于鮮味受體的親和力明顯強(qiáng)于對甜味受體的親和力。計算得到γ-Glu-Val與T1R1間相互作用力最強(qiáng)。T1R1中有6 個氨基酸殘基參與了和γ-Glu-Val的交互作用，它們分別為Phe-274、Ser-275、Ser-300、Trp-303、Ala-147、Ala-170。分子對接驗證結(jié)果與感官評定結(jié)果相符合，表明γ-Glu-Val對于鮮味的增強(qiáng)效果優(yōu)于對于甜味的增強(qiáng)效果，其原因可能在于γ-Glu-Val與鮮味受體結(jié)合更為緊密，能調(diào)動更多受體的活性位點參與兩者的交互作用。研究結(jié)果為此類小肽的增味作用機(jī)理性研究提供了新的思路。