田霄艷，鄭斐庭，馮 濤，喻 晨，宋詩清,*，孫 敏，姚凌云

（1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

大豆蛋白水解物是大豆蛋白經過酶解、微生物發(fā)酵后通過分離提取得到的低分子肽類[1]，其氨基酸組成與大豆蛋白完全相同，而且比起大豆蛋白有更加豐富的營養(yǎng)特性和生理功能[2-3]。然而大豆蛋白水解物具有人們所不喜歡的苦味，影響感官品質，從而限制了其應用。

目前關于蛋白水解物的苦味評價方法有感官評價、電子舌評價和動物實驗評價等。Lang等[4]在研究咖啡中苦味物質卡奧韋醇時，通過感官評價方法中的半舌實驗和強制選擇實驗評價每種稀釋液的苦味，最終得到了卡奧韋醇的閾值。劉瑞新等[5]在研究多類苦味抑制劑對鹽酸小檗堿的苦味抑制作用時，基于口嘗法和電子舌法建立了ΔI-ρ威布爾規(guī)律模型，發(fā)現(xiàn)電子舌與感官的評價結果基本一致。Wu Xiao等[6]在研究苦味物質和苦味受體的掩蔽中，通過感官評定考察了高效甜味劑的苦味抑制效果。通過電子舌苦味和甜味傳感器響應值進行模型回歸分析，提出了苦味預測公式。Zhen Qin等[7]研究發(fā)現(xiàn)大鼠的生物電子舌與體質指數(shù)相結合的方法能夠以高靈敏度檢測苦味化合物，這為高靈敏度的苦味檢測提供了一種有前途的方法。核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜常被用來分析物質中的化學組分，而NMR代謝組學分析被認為是感官評估蛋白質水解產物的新工具。它可以獲得樣品化學成分與感覺屬性強度之間的相關性，而不僅僅是某種特性的信號[8]。目前NMR已被用于番茄罐頭、魚蛋白水解液和雞蛋白水解液等的感官評價研究中[8-9]。

通過文獻報道及預實驗發(fā)現(xiàn)，動物實驗因存在實驗難度大、成本較高、個體差異大、成功率也低等缺點而較少被應用，感官評價與電子舌分析依然是最常用的方法。本研究通過感官評價及電子舌分析苦味強度，同時對大豆蛋白水解物進行了游離氨基酸組成和含量以及肽分子質量分布進行了分析，為快速準確預測水解物的苦味提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆肽F1（實驗室自制樣品A）、大豆肽F2（行業(yè)標桿A）、大豆肽F3（實驗室自制樣品B）和大豆肽F4（行業(yè)標桿B）、大豆低聚肽粉、玉米低聚肽粉 安琪酵母股份有限公司；氨基酸標準品 日本Wako公司；三氯乙酸、酒石酸、氯化鉀、硫酸奎寧 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑 國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

JA2003精密電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；TZ-5000Z電子舌系統(tǒng) 日本Insent公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；ICS2500型離子色譜儀、Carbo Pac MA-1陰離子交換柱、CarboPac PA-20陰離子交換分析柱 美國Dionex公司；600高效液相色譜儀 美國Waters公司；Ultimate AQ-C18色譜柱 上海月旭材料科技有限公司；Green ODS-AQ C18色譜柱 上海易創(chuàng)儀器分析有限公司；電熱鼓風干燥箱 上一恒科學儀器有限公司；Milli-Q超純水設備美國Ultra公司。

1.3 方法

1.3.1 感官評價

稱取一定量樣品，分別按照不同質量濃度（1、3、5 g/100 mL）制備樣品溶液。

為了對樣品的苦味進行科學的感官評價，參考ISO 8589—2007[10]，感官評價實驗在標準感官實驗室進行（上海應用技術大學感官實驗室）。選取10 名人員組成感官小組（5 名男性和5 名女性，年齡20～30 歲），感官小組共接受6 h的培訓（2 周內分別進行3 次2 h的培訓）。培訓環(huán)節(jié)如下：1）根據(jù)苦味對應的參照物（硫酸奎寧水溶液[11]）來訓練感官小組，使小組成員熟悉苦味屬性且達成共識；2）感官小組對不同質量濃度參照物感官評定，使其對強度達成共識，以0、2.9×10-3、5.8×10-3、1.2×10-2、2.4×10-2mmol/L硫酸奎寧溶液作為參比溶液，通過5點強度等級從1到5評估苦味強度；“1”表示無，“5”表示最強。

培訓結束后，感官小組在感官實驗室對樣品的苦味進行感官評定，確定苦味強度。感官評價員評價前用蒸餾水漱口，將2～3 mL樣品液含在口中10 s，使樣品溶液能夠充分分散于整個口腔，主要讓舌根部感受味道，吐掉后用蒸餾水漱口。每兩個樣品之間有5～10 min休息間隔，每個小組成員進行3 次平行分析，為減少實驗誤差，小組成員在3 d內同一時間段進行3 次感官評定。采用10 個成員的平均分數(shù)作為該味感強度值，確定不同樣品的苦味強度。

1.3.2 電子舌分析

采用TZ-5000Z電子舌系統(tǒng)，該裝置配有6 個傳感器：AAE（鮮味）、CAO（酸味）、CTO（咸味）、COO（苦味）、AE1（澀味）和GL1（甜味）。為了使實驗結果更準確，整個測試過程在25 ℃左右環(huán)境溫度下進行。實驗開始前，先對電子舌進行以下環(huán)節(jié)調試：活化、初始化和校準等，樣品（1、3、5 g/100 mL）用30 mmol/L KCl和0.3 mmol/L酒石酸的基準液配制。實驗開始時，將不含樣品的基準液倒入小燒杯中放置在電子舌樣品1號位，然后將樣品倒入小燒杯中，裝有樣品（包含樣品1號位基準液）與清洗液的燒杯交替擺放在電子舌自動進樣槽中。所有樣品進行3 次電子舌測試，每個樣品數(shù)據(jù)重復采集4 次，采集時間為120 s，通過參差法取3 次誤差最小值為每個樣本的測量數(shù)據(jù)[12]，最后將傳感器響應值作為樣本數(shù)據(jù)分別進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.3 游離氨基酸含量及肽分子質量分布的測定

游離氨基酸含量及肽分子質量分布的測定參考劉伯業(yè)[13]的方法，樣品重復測定3 次，每次平行測定3 次。

1.3.4 呈味物質的呈味貢獻分析

采用滋味強度值（taste active value，TAV）進行呈味物質呈味貢獻的評價[14]，根據(jù)TAV可以判斷該呈味物質對呈味貢獻大小[15]。當TAV大于1時代表該物質有呈味貢獻，貢獻程度與TAV呈正比；當TAV小于1時，則認為該物質呈味貢獻較小。按下式計算TAV。

式中：w1為該物質在樣品中含量/（mg/g）；w2為該物質的呈味閾值/（mg/g）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結果用平均值±標準差表示，采用SPSS軟件進行單因素方差分析，采用最小顯著差法（least significant rang，LSR）進行顯著性分析，采用偏最小二乘回歸分析（partial least squares regression，PLSR）進行建模預測分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 大豆水解物感官評價結果

味道是食物帶給人們的基本感受，是食物對味覺器官化學感應系統(tǒng)刺激后所產生的一種感覺。目前世界各國對于味覺的分類并不一致，但都包含了甜、苦、酸、咸這4 種味感。感官評價是在食品風味研究中常用的方法之一，如Yin Haicheng等[16]通過感官評價來分析枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵過程中兩種胞外酶及豆粕苦味的變化。Kirsten等[17]通過感官評價進行味道稀釋分析，在燕麥粉中發(fā)現(xiàn)了兩種新型呋喃固醇皂苷以及獨特的燕麥成分。

本研究將4 個樣品分別配制成不同質量濃度（1、3、5 g/100 mL）的樣品溶液，10 個感官人員對其進行感官評價，結果如圖1所示。相同質量濃度（1、3、5 g/100 mL）下，表示4 個樣品苦味強度間顯著性的P值分別為0.576、0.354、0.589（P＞0.05），因此相同質量濃度下的不同樣品的苦味強度無顯著差異。造成此結果的原因一方面可能是樣品濃度過高，除苦味外，其他感官屬性強度也較高，影響感官評價人員對苦味的評價；另一方面也有可能樣品間苦味強度的確無顯著性差異。

圖1 不同樣品感官苦味強度Fig.1 Sensory evaluation of bitterness intensity of different samples

2.2 大豆水解物的電子舌分析結果

電子舌由3 部分組成，分別為味覺傳感器陣列、信號采集系統(tǒng)和模式識別系統(tǒng)。味覺傳感器陣列是其中最重要的結構單元，相當于生物系統(tǒng)中的舌頭，能采集識別不同化學物質的信號信息[18]。Xu Qingbiao等[19]在研究雞蛋白水解液時，利用電子舌技術篩選出苦味最低的母雞蛋白水解物組分。Newman等[20]發(fā)現(xiàn)電子舌具有作為篩選功能性食品的苦味掩蔽成分工具的潛力，可用于確定合適的甜味劑來掩蓋苦味。由于4 個樣品在1、3、5 g/100 mL下感官評價結果無顯著差異，因此選取5 g/100 mL質量濃度下的4 個樣品進行電子舌分析。

PCA是一種投影方法，與原始變量相比，PCA使用較少數(shù)量的主成分來實現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維，可用于模式識別、分類、建模和其他數(shù)據(jù)評估方面[21]。王聰[22]在研究不同區(qū)域檸檬桉葉風味成分時采用PCA，判別結果可以準確顯示檸檬桉葉的區(qū)域性特征，可用于檸檬桉葉的產地判別。Milosavljevi等[23]在研究不同品種草莓時采用PCA評價草莓中各指標對總抗氧化活性的重要性。

將4 個樣品電子舌結果進行PCA，結果如圖2所示。在PCA圖中兩個主成分的累積貢獻率為98.8%，說明前兩個主成分幾乎包含樣品全部信息，可以反映樣品整體信息。4 個樣品間未重疊，說明在味覺屬性上樣品間存在一定的差異，也說明電子舌可以較好地將不同樣品進行區(qū)分。

圖2 4 個樣品電子舌分析PCA圖Fig.2 Principal component analysis (PCA) plot of electronic tongue data of four samples

電子舌苦味響應值結果如圖3所示。樣品間苦味響應值差異顯著（P＜0.05），其中F1樣品苦味響應值最高，達到9.24；F2樣品苦味響應值最低，為6.73。因此，相較于感官評價，電子舌可以更好地從苦味方面區(qū)分4 個樣品。

圖3 5 g/100 mL不同樣品電子舌苦味響應值Fig.3 Bitterness response values of electronic tongue for different samples at a concentration of 5 g/100 mL

2.3 大豆水解物的游離氨基酸含量和肽分子質量分布

2.3.1 不同樣品中游離氨基酸含量及其TAV

游離氨基酸是非揮發(fā)性風味物質中重要的組成部分，具有呈味閾值低、呈味能力強的特點[24]。Yang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸呈味特性可以分為以下其4 種：鮮味、甜味、苦味和無味。4 個樣品中游離氨基酸含量如表1所示，將表1中的氨基酸按呈味特性進行如下分類，鮮味氨基酸：天門冬氨酸、谷氨酸；甜味氨基酸：蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸；苦味氨基酸：纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸；無味氨基酸：半胱氨酸、酪氨酸、賴氨酸。

表1 4 個樣品中游離氨基酸含量Table 1 Contents of free amino acids in four samples

由表2可知，4 個樣品中呈現(xiàn)苦味的游離氨基酸含量遠高于其他呈味游離氨基酸。樣品F1中苦味氨基酸含量達4 154.33 mg/100 g，分別約是其鮮味氨基酸和甜味氨基酸的8、4 倍，也是4 個樣品中含量最高的。樣品F3中苦味氨基酸含量次之，F(xiàn)2中含量最少。

表2 4 個樣品中游離氨基酸分類及含量Table 2 Free amino acid composition of four samples

采用TAV評價呈味物質呈味貢獻[26]。從表3中可以看出，樣品中呈鮮味、甜味和苦味的游離氨基酸對味感都有一定的貢獻，但呈苦味的游離氨基酸TAV明顯大于其他味感游離氨基酸，如F1樣品中苦味游離氨基酸TAV總和為59.39，而鮮味游離氨基酸和甜味游離氨基酸分別為13.51和10.79，因此4 個樣品具有明顯苦味。F1樣品中纈氨酸和精氨酸TAV分別為10.85和16.28，是主要呈味貢獻游離氨基酸，其TAV遠高于其他樣品。這與電子舌檢測結果相符合，F(xiàn)1樣品的苦味最強。

表3 4 個樣品中游離氨基酸TAVTable 3 Taste active values of free amino acids in four samples

2.3.2 肽分子質量分布

對于多肽，其分子質量大于6 000 Da時基本無苦味，分子質量較小時，苦味強度與其鏈長有一定的關聯(lián)[13]。苦味肽一般具有“結合單元”和“刺激單元”兩個功能單元，在苦味受體中苦味肽的直徑約為1.5 ?，兩個功能單元之間距離為4.1 ?，對于大分子蛋白質和多肽，疏水性氨基酸被包裹在內部，無法與苦味受體相結合，因此無法產生苦味[28-30]。對4 個樣品進行肽分子質量分布測定，結果如表4所示。4 個樣品中F1樣品小于1 000 Da的多肽相對含量最高，為94.17%，這與電子舌苦味響應值相互驗證。

表4 4 個樣品肽分子質量分布Table 4 Molecular mass distribution of four peptides

2.3.3 游離氨基酸含量、電子舌響應值以及感官評價苦味強度相關性分析結果

PLSR是一種常用的多元統(tǒng)計分析工具，用于快速同時定量預測復雜混合物成分的濃度。PLSR是一種基于因子的多元回歸將數(shù)據(jù)分解為不同主成分，并建立預測校準模型的方法[31]。Bantadjan等[32]在研究鮮木薯根淀粉含量時運用PLSR建模，發(fā)現(xiàn)便攜式光譜儀預測新鮮木薯根的淀粉含量可行。Steinsholm等[8]在研究鮭魚和雞肉中蛋白質水解產物時運用PLSR建模，發(fā)現(xiàn)NMR具有對鮭魚和雞肉中蛋白質水解產物感官特性進行預測的潛力。

本實驗采用PLSR對4 個樣品中游離氨基酸含量與電子舌響應值以及感官評價苦味強度進行相關性分析，結果如圖4所示。建立的PLSR模型共包括2 個主成分，解釋的方差為94%，說明模型可靠性較高。除了F3和F4樣品，其他數(shù)據(jù)都在兩個橢圓之間，表明PLSR模型可以很好地解釋它們。亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和蛋氨酸為苦味呈味氨基酸，與電子舌苦味響應值都在模型左側，其含量與電子舌苦味響應值呈現(xiàn)正相關。4 個樣品中只有F1樣品與游離氨基酸中蛋氨酸、纈氨酸和亮氨酸都在模型左下角且距離很近，說明這些指標呈顯著正相關。感官苦味強度（模型左側）、游離氨基酸含量（模型右側）和電子舌苦味響應值（模型右側）都在兩個橢圓之間，說明感官苦味強度與二者呈明顯負相關，這進一步驗證了上面的猜測，由于樣品其他風味強烈和感官評價本身會受到的客觀因素影響干擾了苦味評價的準確性。

圖4 4 個樣品中游離氨基酸含量、電子舌響應值以及感官評價苦味強度的相關性分析結果Fig.4 Correlation analysis of free amino acids contents in four samples with electronic tongue response and sensory evaluation

2.4 苦味值評價方法建立

首先選取4 個樣品中最苦的F1樣品進行感官評價苦味強度和電子舌苦味響應值相關性研究，探究二者的相關性；在此基礎上分別選取不同處理方式及不同質量濃度的大豆蛋白水解物及玉米蛋白水解物進行預測模型的建立及評價。

2.4.1 感官評價結果

將F1樣品按0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/100 mL的質量濃度進行感官評價，結果如圖5所示，苦味強度與質量濃度間相關系數(shù)為0.984 2，呈現(xiàn)出良好的正相關性。其中0.25 g/100 mL F1樣品苦味強度最高（3.5）；0.05 g/100 mL F1苦味強度最低（1.8）。這一結果說明5 g/100 mL質量濃度下4 個樣品間感官評價結果無顯著差異的主要原因是樣品質量濃度過高。

圖5 不同質量濃度F1樣品感官評價苦味強度Fig.5 Sensory evaluation of sample F1 at different concentrations

2.4.2 電子舌分析結果

將5 個樣品電子舌酸味、苦味、澀味、苦味回味、澀味回味、鮮味、咸味、豐富度響應值結果（苦味回味、澀味回味、豐富度為電子舌系統(tǒng)軟件綜合響應值得出）進行PCA。如圖6所示，在PCA圖中兩個主成分的累積貢獻率為97.0%（＞70%），說明前兩個主成分幾乎包含樣品全部信息，可以反映樣品整體信息。5 個質量濃度的樣品沿PC1和PC2分散分布，說明5 個樣品在呈味上有明顯差異。

圖6 不同質量濃度F1樣品電子舌分析PCA圖Fig.6 Principal component analysis (PCA) plot of electronic tongue data of sample F1 at different concentrations

不同質量濃度F1樣品電子舌檢測苦味響應值結果如圖7所示，樣品間苦味響應值呈線性關系，其中0.25 g/100 mL質量濃度下樣品苦味響應值最高，達到3.51；0.05 g/100 mL樣品苦味響應值最低，為1.58?？辔俄憫底兓厔莺透泄僭u價結果一致。

圖7 不同質量濃度F1樣品電子舌苦味響應值Fig.7 Bitterness response values of electronic tongue for sample F1 at different concentrations

2.4.3 感官評價與電子舌評價模型建立及驗證

通過以上感官評價苦味強度和電子舌苦味響應值趨勢圖發(fā)現(xiàn)，感官評價苦味強度和電子舌苦味響應值均與樣品質量濃度呈正相關，因此，為了實現(xiàn)電子舌對感官強度值的快速預測，建立電子舌響應值對感官評價苦味強度的預測模型，并對預測模型的可信度及準確性進行評價。

2.4.3.1 預測模型（定量校正模型）的建立

分別測定不同質量濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/100 mL）的F1樣品、大豆低聚肽粉的感官評價苦味強度和電子舌響應值（苦味、鮮味、豐富度、咸味響應值），建立感官評價苦味強度的預測模型，在建模過程中，模型所包含的主成分數(shù)采用交叉驗證的方法確定。校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）和決定系數(shù)R2用于檢驗模型的內部穩(wěn)健性和擬合效果。模型的預測能力通過驗證數(shù)據(jù)集檢驗，預測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）為其評價參數(shù)，以防模型過擬合。

采用PLSR方法建立預測模型時，主成分數(shù)與模型的實際預測能力直接相關，因此需要先確定主成分再進行后續(xù)模型建立。主成分數(shù)過少時，不能充分反映樣品被測指標信息，模型擬合不充分，從而降低模型預測的準確度；主成分數(shù)過多時，一些包含了噪音的信息會摻入其中進行計算，導致過擬合，從而導致模型的預能力降低，得出錯誤的預測結論。本實驗采用舍一交叉驗證法，通過RMSEC和RMSEP兩個參數(shù)確定主成分數(shù)，當RMSEC與RMSEP均較小時即為合適主成分數(shù)。通過PLSR建模發(fā)現(xiàn)，模型中RMSEC和RMSEP參數(shù)都隨主成分數(shù)增加而降低，因此PLSR預測模型最適主成分數(shù)為3。

采用最優(yōu)的條件，建立感官評價苦味強度預測的最優(yōu)模型，通過校正集樣品對最優(yōu)模型進行內部交叉驗證，結果如圖8所示，其回歸方程為Y＝0.484X1+0.537X2+0.509X3+0.522X4（式中：Y為感官苦味強度預測值；X1、X2、X3、X4分別為電子舌傳感器苦味、鮮味、豐富度、咸味響應值）。

圖8 基于電子舌響應值預測感官評價苦味強度模型Fig.8 Predictive correction model for sensory bitterness intensity based on electronic tongue response

結果表明，所建立的基于電子舌響應值預測感官評價苦味強度模型的決定系數(shù)（R2）分別為0.93（校正數(shù)據(jù)集）和0.97（驗證數(shù)據(jù)集），RMSEC分別為0.18（校正數(shù)據(jù)集）和0.10（驗證數(shù)據(jù)集），說明模型的擬合效果較好，能夠通過電子舌預測感官評價苦味強度。

2.4.3.2 模型的預測效果分析

分別測定不同質量濃度（0.07、0.12、0.17、0.22 g/100 mL）大豆低聚肽粉和不同質量濃度（0.05、0.10 g/100 mL）玉米低聚肽粉的感官評價苦味強度和電子舌響應值，利用建立的最優(yōu)定量預測模型，基于電子舌響應值對6 個樣品的感官苦味強度進行預測，預測值與感官評價苦味強度的相關性如圖9所示?；陔娮由囗憫档玫降母泄僭u價苦味強度預測值與實測值吻合良好，6 個樣品的感官評價苦味強度預測值與感官評價苦味強度實測值的相關性為0.93，RMSEP為1.00，說明所建立的預測模型預測能力較好。

圖9 感官評價苦味強度預測值校正模型的預測結果Fig.9 Prediction of prediction set samples by sensory bitterness intensity correction model based on electronic tongue response

3 結 論

本實驗研究了質量濃度5 g/100 mL條件下4 個樣品的游離氨基酸含量和肽分子質量分布以從側面印證4 個樣品間苦味值不同的原因。游離氨基酸結果顯示F1樣品的苦味游離氨基酸含量明顯高于其他樣品。肽分子質量分布結果顯示F1樣品小于1000 Da的多肽分子質量高于其他樣品。將游離氨基酸與電子舌評價和感官評價之間進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)F1樣品與游離氨基酸中蛋氨酸、纈氨酸和亮氨酸相關性較高，相較于其他樣品感官苦味評價相關性也較高，因此選用F1樣品進行數(shù)學建模。

以電子舌和感官分析技術為基礎，利用PLSR建立了電子舌響應值與感官評價苦味強度分析模型，得感官評價苦味強度預測回歸方程：Y＝0.484X1+0.537X2+0.509X3+0.522X4。對感官評價苦味強度進行預測，很好地克服了傳統(tǒng)感官評價方法的缺點。實驗結果也表明本實驗所建立的校正模型具有很高的預測能力，預測結果完全可以接受，可以替代常規(guī)感官評價分析方法。因此電子舌分析技術可以用于植物蛋白水解物的苦味強度的評價。