栗俊廣，馬旭陽，周月瑩，王 昱，劉 驍，白艷紅,*

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質(zhì)量與安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

在肉及肉制品加工中，冷凍能更長時間保證肉制品的食用品質(zhì)與安全。然而，傳統(tǒng)凍結(jié)方式如空氣凍結(jié)（air freezing，AF）等，凍結(jié)完成后通常會在肌肉細胞間形成大小不均的冰晶[1-2]，其機械損傷會導致組織細胞萎縮變形，進而造成肌纖維扭曲斷裂及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的改變，引起肉品汁液營養(yǎng)損失、感官和質(zhì)構(gòu)劣變等問題，嚴重制約了肉品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

超聲波（20～100 kHz）在食品凍結(jié)中的應用已得到廣泛探索[3]。Hu Songqing等[4]采用超聲輔助凍結(jié)面團時發(fā)現(xiàn)凍結(jié)時間顯著縮短；Sun Qinxiu等[5]發(fā)現(xiàn)超聲誘導成核提高鯉魚凍結(jié)速率的同時減小了樣品的持水性劣變，維持了品質(zhì)。此外，超聲空化效應與機械作用還可修飾蛋白質(zhì)，改變蛋白空間結(jié)構(gòu)，調(diào)控產(chǎn)品功能特性。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）約占肌肉總蛋白質(zhì)量的40%～60%，對肉制品的嫩度、保水性、乳化凝膠性有著重要影響[6-7]。Rastogi等[8]闡明超聲波能夠促進MP在肉產(chǎn)品中的釋放，并改善肉的韌性、嫩度和黏性。Arzeni等[9]利用高強度超聲處理乳清蛋白濃縮物發(fā)現(xiàn)，樣品的粒徑減小，溶解度提高，可用于調(diào)控蛋白功能性質(zhì)。

然而，目前關(guān)于超聲波改善MP功能特性的研究主要集中在對MP本身的處理[10-11]，針對肉及肉制品凍結(jié)過程的報道相對較少。因此，有必要探討超聲輔助浸漬凍結(jié)（ultrasonic-assisted immersion freezing，UIF）處理豬肉后MP功能特性的改變。因此，本實驗以鮮肉為對照，對比研究AF、浸漬凍結(jié)（immersion freezing，IF）和UIF處理對豬肉中MP乳化凝膠功能特性的影響，旨在為超聲波技術(shù)在肉品冷凍加工中的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的豬背最長肌和金龍魚大豆油購于鄭州市丹尼斯超市，豬肉樣品保持在0～4 ℃于15 min內(nèi)運至實驗室。

標準牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、乙二醇-雙-(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid，EGTA） 北京索萊寶公司；NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、HCl、NaOH、MaCl2天津市大茂化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SJT-I-10L超聲波輔助速凍儀 無錫新上佳生物科技有限公司；BPHJ-500C高低溫交變箱 上海一恒科學儀器有限公司；AT4508多通路溫度巡檢儀 常州精密儀器有限公司；LS13320/ULM2激光粒度儀 美國貝克曼庫爾特公司；BX53M偏光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Turbiscan LabMeasuringExpert多重光散射儀法國Formulaction儀器公司；Discovery旋轉(zhuǎn)流動儀美國TA儀器有限公司；TA.XT plus型質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；NMI20低場核磁共振儀紐邁電子科技（蘇州）有限公司；Regulus8100高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡（high-resolution field emission scanning electron microscope，F(xiàn)E-SEM） 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

新鮮的肌肉樣品去除四周可見的脂肪與結(jié)締組織后，分割為6 cm×6 cm×3 cm大小的肉塊，4 ℃冰箱保存6 h，以獲得均勻的初始凍結(jié)溫度。除對照組（4 ℃放置6 h）外，其余各組分別為AF、IF和UIF。其中，AF在（-20.0±0.5）℃高低溫交變箱中完成。IF與UIF均在超聲波輔助速凍儀（20 kHz、50～2 000 W、（-20.0±0.5）℃）中完成。其中，IF組凍結(jié)時，樣品完全浸漬于95%的工業(yè)酒精中，不施加超聲處理，而UIF組凍結(jié)時，當樣品中心溫度降至0 ℃時開啟300 W超聲，工作模式5 s開/5 s關(guān)。所有樣品中心溫度使用溫度巡檢儀實時監(jiān)測，-18 ℃時凍結(jié)完成。

1.3.2 MP提取

MP的提取參考栗俊廣等[12]的方法。將樣品置于4 ℃冰箱中隔夜解凍后絞碎，先后分別與提取緩沖液（10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、2 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L NaCl、0.1 mol/L EGTA，pH 7.0，4 ℃）和NaCl洗液（0.1 mol/L，4 ℃）以1∶4（m/V）混合、均質(zhì)、3 000×g離心15 min，以上步驟重復3 次（4 ℃），得到MP。MP質(zhì)量濃度采用雙縮脲法測定，并用磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L NaCl、50 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0，4 ℃）調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3 MP乳液及凝膠的制備

調(diào)整MP質(zhì)量濃度至10 mg/mL，與大豆油4∶1（m/V）混合后，10 000 r/min均質(zhì)20 s，重復均質(zhì)3 次，得到新鮮MP乳液。調(diào)整MP質(zhì)量濃度至30 mg/mL，1 000×g下離心5 min除去氣泡（4 ℃），準確稱取5 g MP（除去氣泡后得到的部分）于10 mL燒杯中，保鮮膜封口，80 ℃水浴30 min，煮制后迅速置于冰水中降溫，冷卻后放于4 ℃冰箱12 h，得到MP凝膠。

1.3.4 MP乳液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定

參考Li Ke等[13]的方法測定MP乳液的乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsion stability index，ESI）。取50 μL的新鮮MP乳液與5 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%十二烷基硫酸鈉溶液漩渦混合，于500 nm波長處測定吸光度并記為A0，室溫靜置10 min，同樣方法讀取底部MP乳液的吸光度，記為A10，EAI與ESI分別按公式（1）、（2）計算。

式中，ρ為MP乳液質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分數(shù)（20%）；N為稀釋倍數(shù)（100）。

1.3.5 MP乳液粒徑及微觀分布測定

利用LS13320/ULM2激光粒度儀測定MP乳液的粒徑分布及平均粒徑。

吸取10 μL稀釋的MP乳液于載玻片中心，利用偏光顯微鏡在放大100 倍下觀察液滴形態(tài)及微觀分布。

1.3.6 MP乳液動態(tài)光散射總體穩(wěn)定指數(shù)測定

總體穩(wěn)定指數(shù)（total stable index，TSI）的測定參考李可等[14]的方法。取制備好的新鮮MP乳液18 mL置于樣品瓶中，使用多重光散射儀測定樣品TSI，每60 s掃描一次，掃描總時間3 600 s。

1.3.7 MP乳液流變學特性測定

參考Yang Fang等[15]的方法使用旋轉(zhuǎn)流動儀測定MP乳液的流變學特性。采用40 mm平板夾具，乳液加載于平行板之間，狹縫設(shè)置400 μm。角頻率掃描參數(shù)：頻率掃描記錄儲能模量（G′）和損耗模量（G″），應變設(shè)置為1%，角頻率0.1～100 rad/s。

1.3.8 MP凝膠蒸煮損失率及凝膠強度測定

準確記錄蒸煮前MP乳液的質(zhì)量記為m0/g，80 ℃水浴30 min，于冰水混合物中快速冷卻，吸干析出的水分，再次稱質(zhì)量記為m1/g，蒸煮損失率按式（3）計算。

MP凝膠強度參考劉驍?shù)萚16]的方法并略作調(diào)整，具體采用質(zhì)構(gòu)儀測定。探頭選擇P/0.5，測前、測試與測后速度分別為2、1、2 mm/s，觸發(fā)力5 g，壓縮模式應變40%。每個處理組測6 個平行樣品。

1.3.9 MP凝膠水分分布測定

使用紐邁核磁共振圖像處理軟件對MP凝膠中的氫質(zhì)子密度進行成像掃描。樣品成像采用Osiris軟件進行偽彩處理。

1.3.10 MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考Zhou Feibai等[17]的方法并有所調(diào)整，將制備好的MP凝膠置于FE-SEM專用樣品盤中觀察凝膠微觀形貌。液氮凍結(jié)后于樣品制備腔室設(shè)置升華時間10 min，經(jīng)5 mA、60 s的噴金濺射后，加速電壓1 kV下，放大1 000 倍觀察凝膠結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究所有實驗均重復3 次，通過SPSS Statistics 25軟件進行單因素方差分析，Duncan多重比較用于檢驗樣本均值間的顯著性，采用Origin 2019軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍結(jié)方式對MP乳液EAI和ESI的影響

MP的EAI與ESI對肉制品尤其是乳化型肉制品具有重要影響，包括質(zhì)構(gòu)特性、持水持油性等。MP的部分變性、結(jié)構(gòu)的改變以及蛋白質(zhì)粒度和比表面積的變化均會影響其在水-油界面的吸附能力。圖1顯示了不同處理方法的MP樣品的EAI與ESI變化。其中，與對照組相比，AF、IF樣品的EAI、ESI均有所降低，可能是緩慢凍結(jié)造成的蛋白變性和更多不溶性聚集體的形成，不利于MP在油滴表面的吸附，進而減弱了其乳化性。UIF樣品的ESI相比于對照組差異不顯著（P＞0.05），且經(jīng)超聲處理后MP的EAI比對照組提高了37.83%，可能是超聲的空化效應、剪切力及湍流作用破壞了MP聚集體，減小了MP粒徑，增加了MP表面積/體積比，提高了MP的溶解度，使得乳化時更多蛋白參與界面層的形成[18]。

圖1 不同凍結(jié)方法對MP乳液EAI和ESI的影響Fig.1 Effects of different freezing methods on EAI and ESI of MP emulsion

2.2 不同凍結(jié)方式對MP乳液粒徑及微觀分布的影響

乳液粒徑通過影響乳析速度來影響其穩(wěn)定性。不同樣品的乳液粒徑分布及平均粒徑分別如圖2A、B所示。相比于AF、IF更分散的液滴分布，UIF與對照組具有類似的更集中且均勻的液滴分布情況，可能是由于超聲的空化作用維持了MP結(jié)構(gòu)，減少了MP的聚集，使得MP乳液分布更加均勻。此外，與對照組相比，AF與IF樣品的乳液平均粒徑分別顯著增加了92.7%和18.9%（P＜0.05），可能是凍結(jié)過程中冰晶的形成對蛋白結(jié)構(gòu)造成了破壞，加工凍藏期間導致更多的聚集體形成，從而增加了乳液的平均粒徑[19]。經(jīng)UIF處理的乳液平均粒徑最?。?2.23 μm），與對照組差異不顯著（P＞0.05）。較小的粒徑增加了油滴表面吸附的蛋白含量，因此UIF處理更有利于維持乳液的穩(wěn)定性[20]。

圖2 不同凍結(jié)方式對MP乳液粒徑分布（A）及大小（B）的影響Fig.2 Effects of different freezing methods on particle size distribution(A) and particle size (B) of MP emulsion

2.3 不同凍結(jié)方式對MP乳液穩(wěn)定性的影響

多重光散射儀用于測定不同處理對MP乳液的物理穩(wěn)定性及聚集程度的影響。TSI是對給定時間內(nèi)乳液穩(wěn)定性進行定量的指標，TSI越大，表明乳液穩(wěn)定性越差。不同處理組MP乳液的TSI變化如圖3所示。隨著放置時間的延長，所有樣品的TSI升高，且給定的3 600 s時間內(nèi)，凍結(jié)造成了乳液穩(wěn)定性下降。其中，AF樣品的TSI最高，其次為IF，而UIF與對照組鮮肉TSI差異不明顯，表明UIF時空化效應作用于MP，有助于乳液粒徑減小，不易發(fā)生絮凝、聚集或相分離等失穩(wěn)現(xiàn)象[14]，3 600 s時間內(nèi)穩(wěn)定性更好。該結(jié)果與乳化穩(wěn)定性變化趨勢一致。

圖3 MP乳液的TSI變化Fig.3 Change in Turbiscan stability index (TSI) of MP emulsions

2.4 不同凍結(jié)方式對MP乳液流變特性的影響

黏性和彈性對乳化型肉制品的加工具有重要影響。不同MP乳液的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）隨振蕩頻率的變化如圖4所示，在所有的樣品中，G′與G″曲線接近平行，且G′遠高于G″，具有彈性凝膠特征，且整個頻率范圍均表現(xiàn)較小的頻率依賴性[21]。與對照組相比，凍結(jié)處理降低了樣品的G′和G″，表明冷凍引起了蛋白質(zhì)分子變性，造成天然構(gòu)象的改變和結(jié)構(gòu)解折疊，蛋白變性越大，樣品G′和G″越低[22]。在所有處理組中，UIF具有較高的G′和G″，表明MP乳液具有較好的黏彈特性。

圖4 不同凍結(jié)方式對MP乳液G′、G″的影響Fig.4 Effects of different freezing methods on G′ and G″ of MP emulsion

2.5 不同凍結(jié)方式對MP凝膠蒸煮損失率和凝膠強度的影響

不同凝膠樣品的蒸煮損失率如圖5所示。與對照組相比，AF、IF造成了蒸煮損失率的顯著升高，分別提高了1.12%和0.94%（P＜0.05），而UIF蒸煮損失率與對照組差異不顯著。持水性的改變可能與MP中肌球蛋白的完整性有關(guān)，凍結(jié)生成的冰晶造成蛋白的結(jié)構(gòu)損傷與變性，不利于形成良好的凝膠網(wǎng)絡，導致持水力的下降[23-24]。UIF樣品蒸煮損失率與對照組相比略微增加，但低于AF和IF樣品，可能源自于超聲空化引起的物理化學效應加速了凍結(jié)過程，部分展開了MP結(jié)構(gòu)，暴露了相應的活性基團，加熱過程中有利于蛋白-蛋白相互作用，形成更緊密均勻的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，增加其持水力，減少蒸煮損失。

凝膠強度是反映MP凝膠特性的一個重要參數(shù)。圖5反映了不同處理下MP凝膠強度的改變。與對照組（155.66 g）相比，AF、IF和UIF樣品的凝膠強度分別降低了52.73%、26.44%和17.96%（P＜0.05）。加熱凝膠化過程MP的聚集與解折疊速率對凝膠的形成至關(guān)重要[25]。AF造成了蛋白二三級結(jié)構(gòu)的破壞，暴露了更多的疏水基團和活性巰基[26]，因此加熱凝膠化時蛋白解折疊速率慢得多，聚集速率較快，形成的凝膠粗糙松散，降低了其凝膠強度。相反，UIF處理可以減小凝膠的弱化，凝膠強度保持較好。

圖5 不同處理對MP凝膠蒸煮損失率及凝膠強度的影響Fig.5 Effects of different freezing treatments on cooking loss and gel strength of MP gel

2.6 不同凍結(jié)方式對MP凝膠水分分布的影響

為了進一步研究MP凝膠內(nèi)水分分布狀態(tài)，采用核磁共振成像技術(shù)結(jié)合偽彩處理對凝膠中氫質(zhì)子密度進行測定，結(jié)果如圖6所示。從藍色到紅色依次代表水分含量的增加[27]。對照組顯示出更強的質(zhì)子密度，且水分分布最均勻，凍結(jié)后不同樣品顯示出不同程度的質(zhì)子密度及水分含量的降低。與對照組鮮肉相比，AF成像有明顯的紅黃分界，IF的紅黃分界線與AF相比略變模糊，但顏色分布仍不均勻。相反，UIF樣品的凝膠成像顏色均勻度提高，說明UIF處理更好保持了MP凝膠的持水性，水分分布更加均勻。肌球蛋白是唯一在加熱后參與凝膠形成的蛋白質(zhì)，UIF提高了凍結(jié)速率，減緩了肌球蛋白變性，形成了孔徑小、連續(xù)均勻的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，因此合適的毛細管力增強了凝膠的持水能力。

圖6 不同處理對MP凝膠水分分布的影響Fig.6 Effects of different freezing treatments on water distribution in MP gel

2.7 不同凍結(jié)方式對MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

不同處理組的MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖7所示。AF樣品顯示出較大空腔且松散的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)束部分斷裂，可能是緩慢凍結(jié)形成的大冰晶擠壓、扭曲肌纖維，造成MP變性，加熱時蛋白過度聚集，最終形成的凝膠疏松多孔不連續(xù)，毛細管力降低，進而導致持水性的降低。UIF樣品形成的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更加密實、均勻，與鮮肉最為接近，可能是超聲的空化效應加速了凍結(jié)過程，減弱了蛋白變性，更多MP參與凝膠的形成，重新聚合后MP分子間結(jié)合更加緊密[28]。此外，超聲也可能通過減小粒徑或加強蛋白二硫鍵及疏水作用促進形成了密集的凝膠網(wǎng)絡[22]。Wang Yaoyao等[20]也發(fā)現(xiàn)超聲減小MP粒徑有助于形成更小間距蛋白凝膠，本研究結(jié)果與之相似。

圖7 不同處理組MP凝膠FE-SEM圖Fig.7 FE-SEM images of MP gels in different treatment groups

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)UIF可以提高豬背最長肌MP乳化活性，抑制凍結(jié)后乳化穩(wěn)定性的降低，更好地保持其乳化凝膠性能。與鮮肉相比，AF、IF乳液平均粒徑分別顯著增加了92.7%和18.9%，而UIF增加不顯著。流變學結(jié)果顯示，UIF樣品相比于其他凍結(jié)處理組具有更高的G′和G″值，表明UIF抑制了MP乳液黏彈性的劣變。經(jīng)蒸煮后，UIF樣品的蒸煮損失率與鮮肉相比差異不顯著（P＞0.05），并低于其他凍結(jié)組，且凝膠強度更大，水分分布更均勻。FE-SEM結(jié)果顯示，UIF組MP凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更為均勻致密，與對照組MP相似，孔隙明顯小于其他凍結(jié)處理組。因此，與其他凍結(jié)方式相比，UIF豬肉MP乳化性與凝膠功能最佳，與鮮肉組最為接近，更有利于保持肉的加工品質(zhì)。