魏穎，尹湉，張宇，唐星

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)1.藥學(xué)院；2.功能食品與葡萄酒學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

藥學(xué)中的微球制劑被定義為藥物分散或被吸附在高分子聚合物基質(zhì)中，從而形成粒徑1～250 μm的微小球狀實(shí)體。微球給藥后藥物隨基質(zhì)降解而緩慢釋放，減小藥物不良反應(yīng)，有效提高生物利用度，降低給藥頻率，這對(duì)患者十分有利[1]。近年來(lái)，由于緩釋微球具有巨大的工業(yè)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，使其成為藥劑學(xué)研究熱點(diǎn)之一，被各大國(guó)際醫(yī)藥巨頭所重視[2]。目前，經(jīng)過(guò)美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的微球制劑有10余種，見(jiàn)表1。

表1 FDA批準(zhǔn)上市的微球制劑

但到目前為止，我國(guó)市場(chǎng)上可供選擇的幾種微球產(chǎn)品，幾乎都是國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品，亮丙瑞林微球作為唯一國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的微球產(chǎn)品，北京博恩特藥業(yè)有限公司在2009年首先獲批上市，同年麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司同種微球產(chǎn)品也緊隨其后上市，此后再無(wú)國(guó)產(chǎn)微球獲批。緩釋微球仿制藥具有價(jià)格較低的優(yōu)勢(shì)，如果我國(guó)能擁有更多國(guó)產(chǎn)化緩釋微球仿制藥，將提升整體醫(yī)療服務(wù)水平，產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益與巨大的社會(huì)效益。為保證國(guó)產(chǎn)緩釋微球仿制藥質(zhì)量可靠，療效一致，一致性評(píng)價(jià)是必經(jīng)環(huán)節(jié)。

1 仿制藥一致性評(píng)價(jià)及質(zhì)量管理

仿制藥一致性評(píng)價(jià)不但在我國(guó)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史中具有重大意義，并且能促進(jìn)我國(guó)制藥產(chǎn)業(yè)整體升級(jí)。

首先，能科學(xué)合理地淘汰重復(fù)率高、質(zhì)量低下的仿制藥，提高市場(chǎng)集中度，促進(jìn)醫(yī)藥市場(chǎng)良性競(jìng)爭(zhēng)[3]。其次，帶領(lǐng)我國(guó)仿制藥企業(yè)與國(guó)際市場(chǎng)接軌，促進(jìn)我國(guó)從仿制藥大國(guó)邁向仿制藥強(qiáng)國(guó)[4-5]。但在整個(gè)仿制藥一致性評(píng)價(jià)中，一個(gè)很可能被忽略的地方是生產(chǎn)質(zhì)量管理體系。一致性并不是要求仿制藥生產(chǎn)質(zhì)量管理過(guò)程與參比制劑完全一致，而是通過(guò)嚴(yán)格監(jiān)控仿制藥生產(chǎn)過(guò)程來(lái)確保批內(nèi)及批間制劑與參比制劑一致性。一個(gè)成熟的工藝參數(shù)的控制對(duì)于確保質(zhì)量穩(wěn)定性和一致性而言尤為重要。因此，形成完整的產(chǎn)業(yè)鏈后，為了連續(xù)穩(wěn)定地保證每批仿制藥都能符合標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)家應(yīng)該建立標(biāo)準(zhǔn)的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice，GMP)體系，嚴(yán)格把控仿制藥研發(fā)以及生產(chǎn)過(guò)程。由此可見(jiàn)，指導(dǎo)仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)估的相關(guān)文件的編撰與發(fā)布也勢(shì)在必行。對(duì)于企業(yè)而言，不僅研發(fā)、分析和檢測(cè)能力必不可少，并且要始終堅(jiān)持貫徹“質(zhì)量管理”理念[6]。

2 微球制劑關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)

緩釋微球是一種新型儲(chǔ)庫(kù)型藥物制劑，但其無(wú)法掌控的釋藥行為，對(duì)質(zhì)量控制而言是個(gè)不小的挑戰(zhàn)。長(zhǎng)效緩釋微球制劑的質(zhì)量管理應(yīng)把重點(diǎn)放在那些由于生產(chǎn)工藝變動(dòng)而產(chǎn)生波動(dòng)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

2.1形態(tài) 微球形態(tài)和結(jié)構(gòu)與載藥量和藥物釋放行為密切相關(guān)，微球表面粗糙度越高，表面積越大，藥物釋放越快；微球表面微孔越多，孔徑越大，釋放也加快。微球制備方法可能影響微球表面形態(tài)，從而間接影響藥物釋放。

制備微球的常用方法有溶劑揮發(fā)法、相分離法以及噴霧干燥法等。KIM等[7]首先采用傳統(tǒng)乳化溶劑揮發(fā)法制備人生長(zhǎng)激素微球，該微球表面多孔。然后利用流化床設(shè)備將分散在去離子水中的微球與乙腈混合，離心后得“無(wú)孔”微球。該“無(wú)孔”微球釋藥速度明顯減慢，24 h累積釋放量?jī)H(6.2±1.1)%，可以釋放超過(guò)1個(gè)月；而未經(jīng)過(guò)處理的“多孔”微球24 h累積釋放量達(dá)到(85.6±1.0)%。

干燥作為微球制備工藝中的關(guān)鍵步驟，常用的方法為減壓干燥和冷凍干燥。不同干燥方法會(huì)對(duì)微球釋放量有一定影響。KIM等[8]考察了不同干燥方法對(duì)微球釋放的影響。結(jié)果表明，經(jīng)減壓干燥和冷凍干燥制備的微球體外突釋率分別為25%和67%。原因可能是冷凍時(shí)微球中水分固化成結(jié)晶態(tài)的冰，體積增大，使微球內(nèi)部形成更大孔道，促進(jìn)藥物快速釋放。綜上所述，微球制備方法和過(guò)程會(huì)改變微球形態(tài)，進(jìn)一步影響其釋放曲線，可以通過(guò)控制制備過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，來(lái)達(dá)到調(diào)整釋放行為的目的。微球常用形態(tài)表征方法及其特點(diǎn)見(jiàn)表2。

表2 微球常用形態(tài)表征方法及其特點(diǎn)

2.2粒徑及其分布 粒徑大小及其分布是質(zhì)量控制中非常重要的指標(biāo)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谝欢ǔ潭壬蠒?huì)影響藥物釋放行為[9]。微球粒徑不同，釋藥速度不同。武莉等[10]利用乳化-溶劑揮發(fā)法制備了5種不同粒徑載藥PLGA微球，其球徑分別為150，500 nm，1，5，10和20 μm。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，球徑越小，藥物釋放速度越快。結(jié)果提示，可通過(guò)選擇微球的大小來(lái)控制藥物釋放快慢。

2.3有機(jī)溶劑殘留 在制備過(guò)程中引入的有機(jī)溶劑可能無(wú)法完全去除。這不僅對(duì)微球的儲(chǔ)存穩(wěn)定性有一定影響，同時(shí)給藥后接受者可能出現(xiàn)不良反應(yīng)，因此應(yīng)嚴(yán)格控制微球中有機(jī)溶劑殘留量。

2.4載藥量/包封率 工藝成熟度的兩項(xiàng)重要指標(biāo)是載藥量和包封率。載藥量=制劑中藥量/制劑總質(zhì)量×100%；包封率=制劑中包封的藥量/制劑中包封與未包封總藥量×100%。二者越高表示被包裹入微球中的藥物含量越多，增加藥物利用率的同時(shí)又會(huì)延長(zhǎng)藥物緩釋時(shí)間。

2.5釋放行為 初期研發(fā)階段，應(yīng)確立適合的體外釋放條件。由于載藥微球釋放周期較長(zhǎng)，可以通過(guò)加快釋放試驗(yàn)方法來(lái)預(yù)測(cè)模擬常規(guī)釋放行為[11]。突釋效應(yīng)是緩釋微球研發(fā)的重難點(diǎn)之一，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》明確表示，在前0.5 h內(nèi)微球釋放的藥量不得高于40%[12]。目前報(bào)道的微球制劑體外釋放度測(cè)定方法主要有：①直接釋藥法，是目前最常用的方法[13]，包括搖床法、恒溫水浴靜態(tài)法。微球制劑置含有介質(zhì)的容器中保持恒溫封閉，一定時(shí)間取樣并補(bǔ)充新鮮介質(zhì)；②流通池法，系統(tǒng)由恒流泵、溫控流通池、存儲(chǔ)瓶、過(guò)濾系統(tǒng)、取樣系統(tǒng)和樣品收集系統(tǒng)組成，此法已被《美國(guó)藥典》收載，被廣泛應(yīng)用于緩釋制劑的研發(fā)[14-15]；③透析膜擴(kuò)散法，該法是指將微球放入透析管，并將其放入介質(zhì)中測(cè)定。測(cè)定微球體外釋放度的主要方法及其優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表3。

表3 微球制劑體外釋放度實(shí)驗(yàn)方法比較

2.6細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定和無(wú)菌檢查 微球產(chǎn)品的內(nèi)部以及外部都要進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定和無(wú)菌檢查。產(chǎn)品罐裝時(shí)可能感染微生物，因此需要檢測(cè)外部。同時(shí)由于微球粒徑很大，能包藏住真菌和細(xì)菌，因此也必須檢驗(yàn)內(nèi)部。

3 藥物分布

以上是微球質(zhì)量管理中的幾個(gè)關(guān)鍵屬性，因此仿制藥均應(yīng)與參比制劑保持一致性。但通常對(duì)于緩釋微球來(lái)講，釋放是一大重難點(diǎn)，應(yīng)為重點(diǎn)控制的質(zhì)量屬性。由于緩釋微球釋放時(shí)間普遍為數(shù)周甚至數(shù)月，釋放周期過(guò)長(zhǎng)，影響釋放因素過(guò)多，故體外釋放數(shù)據(jù)并不完全可信。YANG等[16]制備了含有牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)/PLGA微球，研究改變制備參數(shù)對(duì)其形貌、藥物分布和釋放動(dòng)力學(xué)的影響，并研究這些因素之間的關(guān)系。ROY等[17]報(bào)道，藥物釋放與微球的大小成反比。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)外水相的聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)濃度較低時(shí)，所制備的較大微球反而具有更快的BSA釋放速度。分析認(rèn)為，這種現(xiàn)象可能因?yàn)檩^高的PVA濃度能夠更好地穩(wěn)定乳狀液，阻礙了BSA與環(huán)境的傳質(zhì)，因此藥物在微球內(nèi)部分布更均勻，從而影響了藥物的釋放，這充分說(shuō)明微球的藥物分布顯著影響藥物的釋放特性，因此關(guān)于制劑中藥物空間分布分析的表征至關(guān)重要。

藥物空間分布的表征，一般使用掃描電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡觀察表面和截面形貌，但它們?nèi)狈Ω敿?xì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)信息。共聚焦顯微鏡拉曼技術(shù)則具有微米級(jí)別的分辨率，它將拉曼光譜儀與光學(xué)顯微鏡結(jié)合在一起，不僅可以在平面XY軸方向進(jìn)行成像，顯示成分分布情況，還能夠分析樣品表面以下的結(jié)構(gòu)特征，即Z軸方向[18]。所以可以利用共聚焦顯微鏡拉曼技術(shù)進(jìn)行高級(jí)表征，直接獲得微球中包含的聚合物、藥物更精確的物質(zhì)鑒定及其空間分布[19]。據(jù)報(bào)道該技術(shù)還可分析多種制劑樣品：固體分散體[20-23]、藥物洗脫涂層[24-26]、聚合物微粒[27-29]和片劑[30-32]等。共聚焦顯微鏡拉曼技術(shù)不僅可以直接提供更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)信息，從而補(bǔ)充微球的表征，且具有一定的通用性，在藥物釋放測(cè)試期間的特定時(shí)間間隔之后對(duì)微球進(jìn)行分析，有助于進(jìn)一步進(jìn)行藥物釋放曲線研究，從而更好建立體內(nèi)外相關(guān)性[33]。

PU等[18]通過(guò)乳化-溶劑揮發(fā)法制備黃體酮(progesterone，PRG)微球，利用共聚焦顯微鏡拉曼技術(shù)以Z軸為掃描方向，掃描不同位置藥物在微球內(nèi)部分布情況。越接近微球表面的位置，黃體酮的分布越密集，該部分藥物是造成微球初期突釋的主要原因，表面藥物釋放后，會(huì)進(jìn)入相對(duì)平緩的釋放階段，隨著PLGA溶蝕降解，微球內(nèi)部藥物也會(huì)隨之釋放出來(lái)。然而，由于微球表面黃體酮只占總藥物含量的一小部分，微球內(nèi)似乎存在更多藥物。因此，盡管有顯著突釋?zhuān)蟛糠炙幬锓植荚谖⑶騼?nèi)，不容易釋放。PRG-PLGA微球制劑的空間分布結(jié)果和體外釋放研究相互印證。利用共聚焦顯微鏡拉曼技術(shù)對(duì)黃體酮微球進(jìn)行研究，直觀地反映了藥物在PLGA微球內(nèi)的分布狀況，證明微球爆發(fā)釋放可歸因于存在于微球表面的藥物快速擴(kuò)散，因此研究藥物在微球內(nèi)的分布對(duì)研究釋放至關(guān)重要。

實(shí)際上，共聚焦拉曼顯微鏡不僅可以觀察到藥物分布位置，還可觀察到藥物存在的形式。CAI等[34]通過(guò)復(fù)乳法制備PLGA微球，以了解聚合物性質(zhì)、形態(tài)、藥物分布和釋放行為等方面的協(xié)同作用和綜合效應(yīng)。為研究載藥量和藥物分布的綜合作用針對(duì)結(jié)構(gòu)相似的微球的釋放過(guò)程，制備了不同理論載藥量的微球，并研究了其各自釋藥行為。在低載藥量(1%)時(shí)，共聚焦拉曼顯微鏡顯示異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-葡聚糖以<0.5 mm的小藥鏈均勻分布在微球中，而在較高載藥量(10%)時(shí)，F(xiàn)ITC-葡聚糖以>1 mm藥鏈分布。研究發(fā)現(xiàn)，低載藥量下，氟康唑以無(wú)定形狀態(tài)或以分子分散體形式摻入微球基質(zhì)，但在高載藥量下，部分藥物以結(jié)晶形式存在，所以在共聚焦拉曼顯微鏡下，藥物鏈也有所不同。藥物存在狀態(tài)對(duì)初始釋放的影響較小，對(duì)釋藥速率影響較大。在小藥鏈(理論載藥量為1%)時(shí)，1 d釋放5%，7 d釋放12%，30 d釋放45%，在大藥鏈(理論載藥量為10%)時(shí)，1 d釋放12%，7 d釋放30%，30 d釋放70%。該文獻(xiàn)說(shuō)明載藥量的不同影響了藥物在制劑中的形式，從而影響藥物釋放曲線。由此看來(lái)，共聚焦顯微鏡拉曼技術(shù)不但可以觀察到藥物分布，還可以觀察到藥物在微球中的存在形式，這有助于進(jìn)一步理解藥物釋放曲線。

4 結(jié)論

針對(duì)緩釋微球仿制產(chǎn)品的研發(fā)，應(yīng)注意下列問(wèn)題：①對(duì)微球制備過(guò)程中需要的輔料進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，原則上處方及生產(chǎn)工藝應(yīng)與參比制劑保持一致；②結(jié)合制劑特點(diǎn)，考察的關(guān)鍵質(zhì)量屬性可能包括但不限于以下內(nèi)容：載藥量、粒徑、藥物釋放、相關(guān)物質(zhì)、有機(jī)溶劑殘留、細(xì)菌及內(nèi)毒素等。除此之外，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)說(shuō)明，藥物在微球內(nèi)部或表面的定位會(huì)影響擴(kuò)散路徑的長(zhǎng)度和釋放曲線。并且在微球中特定位置的藥物分布會(huì)導(dǎo)致微球內(nèi)部分或全部藥物結(jié)晶，也影響藥物從微粒的釋放，因此合理有效的藥物空間分布及存在形式限度范圍的建造對(duì)于藥物釋放度控制而言是一個(gè)重要的補(bǔ)充。可以利用拉曼顯微鏡將光譜學(xué)與測(cè)繪和成像技術(shù)相結(jié)合，獲得被研究樣品的空間信息，進(jìn)而觀察樣品在空間維度上的詳細(xì)化學(xué)分布以及存在形式。然后根據(jù)微球粒徑大小，將其沿 Z 軸方向劃分為幾個(gè)不同深度的區(qū)域，分析各區(qū)域內(nèi)藥物含量，與參比制劑進(jìn)行比較，如果均在允許限度范圍內(nèi)，則視為符合一致性評(píng)價(jià)。綜上所述，建議將藥物空間分布及存在形式也列為仿制緩釋微球制劑質(zhì)量控制的技術(shù)要求之一，從而加強(qiáng)仿制藥一致性評(píng)價(jià)過(guò)程的質(zhì)量管理。力求為今后緩釋微球仿制藥的相關(guān)法律法規(guī)、審評(píng)監(jiān)管工具、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及方法的制定與完善提供依據(jù)和參考。