劉亞麗，周明月，宋永貴，周志煒，謝明敏，徐貞權(quán)，李澤協(xié)，關(guān)志宇，張凌，王萌，蘇丹

(江西中醫(yī)藥大學(xué)1.科技學(xué)院；2.藥學(xué)院，南昌 330004)

白頭翁為毛茛科植物白頭翁[Pulsatillachinensis(Bunge)Regel]的干燥根，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，具有較好的退熱作用，與板藍(lán)根、金銀花等同為 “清熱解毒，涼血止痢”傳統(tǒng)中藥[1]。近年來，國內(nèi)外對白頭翁有效成分進(jìn)行了較深入研究[2-4]，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤[5]和抗血吸蟲活性顯著，抗氧化作用強(qiáng)，抗炎作用明確，可以有效抑菌、殺蟲，該藥應(yīng)用范圍日益廣泛[6]。皂苷是中藥中常見的一大類生物活性物質(zhì)，近年越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[7-9]。YU等[10]曾對中藥皂苷類化合物的藥動學(xué)研究現(xiàn)狀進(jìn)行過詳細(xì)歸納和總結(jié)，涉及人參皂苷、甘草皂苷、薯蕷皂苷、黃芪皂苷和柴胡皂苷等。中草藥口服后某些成分經(jīng)腸道菌群降解生成苷元而發(fā)揮藥理作用，這類藥被認(rèn)為是天然前體藥物[11]，只有較小部分以原型形式被吸收，體內(nèi)環(huán)境中腸道菌群是完成中藥有效成分代謝的重要因素之一[12]。近年來大量研究表明，腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主營養(yǎng)與代謝、維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面，發(fā)揮著極其重要的作用[13]。此外，腸道菌群能夠產(chǎn)生不同種類藥物代謝酶，不同代謝酶參與各種不同類型藥物代謝，從而改變藥物作用趨向，包括藥效改變、發(fā)生毒性反應(yīng)等[14-15]。相對于傳統(tǒng)肝臟和腸道黏膜藥物代謝場所，腸道菌群最先直接與口服藥物接觸，己被認(rèn)為是影響藥物代謝的“器官”，研究藥物在腸道菌群的處置對于理解其在體內(nèi)的作用機(jī)制具有重要意義。筆者所在課題組前期對白頭翁總皂苷進(jìn)行分離鑒定和構(gòu)效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)齊墩果烷母核的白頭翁皂苷為其主要活性成分。由于皂苷類物質(zhì)在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化器和酶系的多樣性作用下其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度較低，腸內(nèi)滯留時間長，易受到腸道菌群的作用[16]。筆者在本實驗采用16S核糖體RNA(16S rRNA)高通量測序分析方法，研究白頭翁皂苷對腸道菌群組成和多樣性的影響，以期為白頭翁皂苷的應(yīng)用研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠，體質(zhì)量 (200±20)g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(贛)2018-003，實驗動物使用許可證號：SYXK(贛)2017-0004。飼養(yǎng)室溫度：(22±2) ℃，相對濕度：(50±20)%。自然光-暗循環(huán)飼養(yǎng)3 d，動物實驗按照國家科學(xué)技術(shù)委員會《實驗動物管理條例》規(guī)定進(jìn)行。

1.2藥品與試劑 白頭翁根購自蘇州一家中藥店，由蘇州大學(xué)藥學(xué)院李笑然教授鑒定為毛茛科白頭翁屬植物白頭翁Pulsatillachinensis (Bge.) Regel的干燥根。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，作為白頭翁皂苷的助溶劑)，天津市福晨化學(xué)試劑廠提供，批號：20161202，凈含量500 g。

1.3白頭翁總皂苷提取物的制備 白頭翁皂苷為筆者所在實驗室 (中藥固體制造技術(shù)國家工程研究中心天然藥物部) 提取。回流條件下，70%乙醇萃取干燥的植物材料(2.5 kg)3次，減壓干燥提取物。D101樹脂柱上對殘余物(280 g)進(jìn)行色譜分析，水-乙醇梯度洗脫，組合用60%乙醇洗脫部分，凍干，獲得粉末(125 g)[17]，純度75.1%。

1.4儀器與設(shè)備 HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；SZ-93自動雙重水蒸餾器(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)；DT5-3 型低速臺式自動平衡離心機(jī)(北京時代北利離心有限公司)；IKA 渦旋儀(北京金達(dá)陽光科技有限公司)；KQ3200E 型超聲波儀(上海巴玖實業(yè)有限公司)；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)。

1.5動物的分組與處理 取清潔級SD雄性大鼠12只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，因?qū)嶒炈么笫鬄橥慌錾掌?，且體質(zhì)量均勻，均通過屏障內(nèi)動物檢疫，按照隨機(jī)數(shù)目分組法分為對照組和給藥組各6只。對照組給予空白溶劑(羧甲基纖維素鈉溶液)，給藥組給予白頭翁皂苷(將白頭翁皂苷溶解于0.5% 羧甲基纖維素鈉)，300 mg·kg-1，均連續(xù)灌胃7 d。

1.6樣品的處理

1.6.1樣品的采集 實驗結(jié)束時，在無菌操作臺上取大鼠糞便標(biāo)本。具體操作步驟為：戴一次性無菌手套，右手抓取大鼠，75%乙醇消毒其肛周部位，無菌棉簽輕柔按摩大鼠腹部，刺激大鼠排便，使用滅菌鑷子盡量從大鼠肛門口部直接夾取糞便，迅速保存至已消毒的自封袋并做好標(biāo)記，取糞便時大鼠正下方擺放滅菌稱量紙，以防止糞便不能及時夾取而落地受到污染，糞便收集后在30 min 內(nèi)放入-80 ℃低溫冰箱保存，每次收集1或2粒完整糞便，大鼠糞便保存在干冰中，寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，委托該公司進(jìn)行16S rRNA基因測序。

1.6.2目的基因的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增與測序 根據(jù)細(xì)菌通用引物338F (5′-ACTC-CTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌16S rRNA V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，利用Illumina 公司的 MiSeqPE300 平臺進(jìn)行測序，原始數(shù)據(jù)上傳至國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫。

1.6.3生物信息學(xué)分析 Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)，聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU聚類分析結(jié)果，對OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度檢測；基于分類學(xué)信息，在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 基于群落組成信息，進(jìn)行OTU分析、稀釋曲線分析、豐度等級曲線分析、ANOSIM/Adonis分析，得樣本的豐富度和均勻度，說明分組的科學(xué)意義；通過Venn圖分析、Beta多樣性層級聚類分析和主坐標(biāo)分析以及組間差異顯著性檢驗等，進(jìn)一步比較2組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)和豐度，反映不同分組的腸道菌群間差異。

2 結(jié)果

2.1可行性分析 本次測序選擇97%相似度的OTU，繪制稀釋曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，樣本曲線趨于平緩且分布較集中，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)微生物信息。

圖1 大鼠糞便樣品稀釋曲線

為證實本次測序的多樣性達(dá)到實驗要求，繪制豐度等級曲線，見圖2。由圖2可知，所有樣品水平寬度較寬，下降趨勢平緩，說明本次樣品物種豐度和均勻度較好。

圖2 大鼠糞樣品菌群等級豐度曲線

2.2ANOSIM/Adonis分析 通過ANOSIM/Adonis分析可以檢驗組間差異是否大于組內(nèi)差異，判斷實驗分組是否有意義。由圖3可知，組間距離值大于組內(nèi)距離值，說明本實驗分組組間差異大于組內(nèi)差異，分組有科學(xué)意義。

圖3 ANOSIM/Adonis分析結(jié)果

2.3β多樣性分析 采用β多樣性分析比較不同樣本間微生物群落間差異，結(jié)果見圖4。由圖4可知每個樣本距離遠(yuǎn)近，除k3樣本和Y2樣本顯示個體差異外，其他樣本根據(jù)樹枝的距離可以劃分出不同分組。

圖4 大鼠糞樣品菌群層級聚類樹

主坐標(biāo)分析見圖5。PC1和PC2對總體方差解釋的百分比分別為78.84%和 16.64%，對照組樣本點與給藥組樣本點除個別樣本有差異外，其他樣本可以完全分開，表明白頭翁皂苷給藥組腸道菌群整體結(jié)構(gòu)與組成產(chǎn)生了較大變化。

圖5 大鼠糞樣品菌群主坐標(biāo)分析

2.4白頭翁皂苷對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的影響

2.4.1OTU的Venn分析 對照組和給藥組12個糞便樣品(每只大鼠取的糞便算1份樣品，兩組一共12只大鼠，即12份糞便樣品)共產(chǎn)生OTU 488個，其中共有OTU 452個，兩組特有OTU分別為9和27個；對照組菌群OTU數(shù)目較給藥組少，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，滿足歸類分析要求(圖6)。

圖6 OTU水平下 的Venn圖

2.4.2群落組成分析

2.4.2.1門分類水平的豐度值及構(gòu)成比較 門水平下各組樣本腸道菌群的組成情況見圖7，在所有樣本中共檢測到細(xì)菌門5個，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優(yōu)勢類群，給藥組的疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度顯著增加，給藥組與對照組腸道菌群組成類似，結(jié)果表明白頭翁皂苷雖然沒有改變門水平上腸道菌群組成，但改變了菌群構(gòu)成比例。

K.對照組；Y.給藥組。

2.4.2.2屬水平分析 由圖8可知，在屬水平上，對照組優(yōu)勢菌群為(norank_f_Muribaculaceae)和乳桿菌屬(Lactobacillus)；給藥組優(yōu)勢菌群為(norank_f_Muribaculaceae)和艾克曼菌屬(Akkermansia)。與對照組比較，給藥組相對豐度降低的菌種有乳桿菌屬(Lactobacillus)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group、 norank_f_Muribaculaceae)、未分類毛螺菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_UCG_014)；豐度增加的菌種有艾克曼菌屬(Akkermansia)、(Romboutsia)、瘤胃球菌型(Ruminococcus_1)、其他(Others)。

K.對照組；Y.給藥組。

通過物種差異分析揭示兩組之間科水平上具有顯著差異的微生物類群，由圖9可知，與對照組比較，給藥組中艾克曼菌屬(Akkermansia)豐度顯著增高(P<0.05)；脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_UCG-013)豐度顯著降低(P<0.05)。

圖9 組間差異顯著性檢驗

3 討論

腸道菌群是腸道的生物屏障，可以與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，共同抑制病原菌的生長和入侵，在維持腸道健康中發(fā)揮重要作用。正常動物腸道內(nèi)寄生細(xì)菌約10萬億個，分為有益菌、條件致病菌和有害菌，它們之間存在相互競爭、相互依存的關(guān)系，正常菌群對機(jī)體生理活動十分重要，具有保護(hù)、屏障、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、參與代謝等作用[18-19]，而菌群的平衡極易受飼養(yǎng)環(huán)境、飲食、自身免疫力等因素的影響。菌群平衡被打破，則會導(dǎo)致菌群失調(diào)，增加腸道疾病發(fā)生的概率[20-21]。

基于16S rRNA的高通量測序技術(shù)克服了培養(yǎng)依賴及非培養(yǎng)依賴的傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法費時、費力、通量低、低豐度菌種難以鑒定等缺陷，實現(xiàn)了對復(fù)雜樣品中混合菌種的分類學(xué)鑒定和精確定量，已成為腸道微生物研究的主流技術(shù)[22]。本實驗運用稀釋曲線、豐度等級曲線和ANOSIM/Adonis分析，測序深度充分，測序量合理，樣本豐富度和均勻度都較好，且組間差異大于組內(nèi)差異，分組具有科學(xué)意義，測序數(shù)據(jù)具有可靠性和科學(xué)性；通過 β 多樣性層級聚類樹和主成分分析(PCoA)發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷對腸道菌群整體結(jié)構(gòu)與組成產(chǎn)生了較大影響；通過Venn圖分析發(fā)現(xiàn)兩組之間差異性有統(tǒng)計學(xué)意義，滿足歸類分析要求；通過門水平和屬水平群落組成分析發(fā)現(xiàn)在不同分類水平上群落組成情況及比例，也可以找出在不同分類水平上對照組和給藥組優(yōu)勢菌群；通過組間差異性顯著檢驗分析，發(fā)現(xiàn)在屬水平上給藥組和對照組具有顯著性差異的菌種。

測序結(jié)果表明，對照組和給藥組大鼠在門水平上的優(yōu)勢菌均是厚壁菌門(Firmicutes)，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)。白頭翁皂苷可以降低有害菌如毛螺菌屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、(norank_f_Muribaculaceae)、未分類毛螺菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_UCG_014)，增加有益菌如艾克曼菌屬(Akkermansia)、(Romboutsia)、瘤胃球菌型(Ruminococcus_1)的豐度。

綜上所述，本研究表明兩組大鼠腸道菌群具有顯著差異，白頭翁皂苷能夠顯著影響大鼠腸道菌群構(gòu)成，顯著增加有益菌艾克曼菌屬豐度，降低有害菌毛螺菌屬豐度。有研究表明，腸道菌群具有抗癌等積極作用，它們通過增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)抵抗腸道以外的惡性腫瘤[23]。同時有研究顯示，腸道菌群能提高免疫檢查點抑制劑反應(yīng)性，如嗜黏蛋白-艾克曼菌具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞雙重活性，進(jìn)而提高免疫檢查點抑制劑的療效，白頭翁具有抗腫瘤療效[24]。本研究結(jié)果表明，大鼠灌胃白頭翁皂苷可以提高艾克曼菌屬豐度。白頭翁皂苷是否通過調(diào)節(jié)腫瘤模型動物中腸道菌群中與抗腫瘤有關(guān)的菌種來發(fā)揮療效，是下一步要解決的問題?；蚪M學(xué)、代謝組學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，有助于深入探索腸道菌群對人體健康的影響途徑，從而更好地理解白頭翁皂苷作用機(jī)制，全面認(rèn)識白頭翁皂苷與腸道菌群的作用及關(guān)系，為更好地開發(fā)利用該成分、建立其質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。