梅孝臣，王 磊，王 娟，張理想，陸 瑩，張 娟，孫萬日*

基于miR-208a-3p探究蘿卜硫素對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

梅孝臣1，王 磊2，王 娟3，張理想1，陸 瑩1，張 娟1，孫萬日1*

1.鄭州大學(xué)附屬南陽市中心醫(yī)院普外科，河南 南陽 473000 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科，河南 鄭州 450000 3.南陽市宛城區(qū)第一人民醫(yī)院普外科，河南 南陽 473000

探討蘿卜硫素對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響及其作用機制。用10、20、40 μmol/L蘿卜硫素處理人正常肝細(xì)胞L02、肝癌HepG2細(xì)胞48 h，通過CCK-8法篩選合適的蘿卜硫素濃度用于后續(xù)實驗；將HepG2細(xì)胞分為對照組和蘿卜硫素（20 μmol/L）組，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖；Transwell測定細(xì)胞遷移與侵襲。設(shè)置對照組、模擬物（mimic）組及其陰性對照（mimic NC）組、抑制物（inhibitor）組及其陰性對照（inhibitor NC）組、真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，EIF4E3）過表達(dá)物（pcDNA-EIF4E3）組及其陰性對照（pcDNA）組、EIF4E3小干擾RNA（si-EIF4E3）組及其陰性對照（si-NC）組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組和pcDNA-EIF4E3＋mimic組，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒對HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，各組分別加入20 μmol/L蘿卜硫素處理24 h，qRT-PCR檢測HepG2細(xì)胞中表達(dá)；CCK-8法檢測細(xì)胞增殖；Transwell測定細(xì)胞遷移與侵襲；雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-208a-3p與EIF4E3靶向關(guān)系；Western blotting檢測細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)。與對照組比較，蘿卜硫素組HepG2細(xì)胞在24、48 h的450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著降低（＜0.05）；HepG2細(xì)胞中呈高表達(dá)，EIF4E3蛋白呈低表達(dá)；靶向負(fù)調(diào)控EIF4E3的表達(dá)；下調(diào)或過表達(dá)EIF4E3可增強蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，而過表達(dá)或沉默EIF4E3則呈相反趨勢；同時過表達(dá)和EIF4E3不會影響蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用。蘿卜硫素可能通過下調(diào)進(jìn)而上調(diào)EIF4E3的表達(dá)來抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

肝癌；miR-208a-3p；蘿卜硫素；真核翻譯起始因子4E；增殖

肝癌是世界范圍內(nèi)的主要癌癥，其發(fā)病率不斷升高，且存活率低于10%[1]。盡管在醫(yī)學(xué)、局部治療和手術(shù)治療方面取得了進(jìn)展，但肝癌轉(zhuǎn)移率高且易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致其治愈率仍然較低[2]。因此，開發(fā)有效的治療藥物至關(guān)重要。蘿卜硫素是一種異硫氰酸酯，廣泛存在于西蘭花和其他十字花科植物中[3]。研究表明，蘿卜硫素可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]；蘿卜硫素可抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲和遷移[5]。而關(guān)于蘿卜硫素對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響鮮有報道。miRNA在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，下調(diào)miR-208-3p表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的的增殖和侵襲[6]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，）為的靶基因，且EIF4E3可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[7]。而蘿卜硫素對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響是否與miR-208-3p/EIF4E3軸有關(guān)尚不明確。因此本研究以miR-208-3p/EIF4E3軸為切入點，探究蘿卜硫素對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期為肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞L02均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

蘿卜硫素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號4478-93-7）購自青島捷世康生物科技有限公司；阿霉素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%，批號23214-92-8）購自武漢華玖醫(yī)藥科技有限公司；模擬物（mimic）及其陰性對照（mimic NC）、抑制物（inhibitor）及其陰性對照（inhibitor NC）、EIF4E3過表達(dá)物（pcDNA-EIF4E3）及其陰性對照（pcDNA）、EIF4E3小干擾RNA（si-EIF4E3）及其陰性對照（si-NC）均購自廣州基迪奧生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號205111）購自上海玉博生物科技有限公司；ECL發(fā)光檢測試劑盒（批號36222ES60）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號RG027）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（批號190521）購自美國Invitrogen公司；EIF4E3兔多克隆抗體（批號201103）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號200908）及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（批號201007）購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 儀器

Elx800型酶標(biāo)儀購自美國伯樂公司；CX23型光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；EPICS-ALTRA型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；ImageMaster型凝膠成像分析儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；7700型qRT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞及L02細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測蘿卜硫素對L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞存活率的影響

取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞及L02細(xì)胞，以4×103個/孔接種至96孔板中，設(shè)置對照組及蘿卜硫素低、中、高劑量（10、20、40 μmol/L）組和阿霉素（2.5 μmol/L）組，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)藥物進(jìn)行處理，對照組加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，另設(shè)置空白孔（無細(xì)胞），處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(給藥－空白)/(對照－空白)

2.3 細(xì)胞分組

取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，設(shè)置對照組（正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞）和蘿卜硫素組（20 μmol/L蘿卜硫素處理的HepG2細(xì)胞），處理48 h后，用于檢測蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，設(shè)置對照組、mimic NC組、mimic組、inhibitor NC組、inhibitor組、pcDNA組、pcDNA-EIF4E3組、si-NC組、si-EIF4E3組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組、pcDNA-EIF4E3＋mimic組，將LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑與對應(yīng)的轉(zhuǎn)染物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)，或采用Western blotting檢測EIF4E3蛋白表達(dá)以驗證轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，將上述對應(yīng)各組細(xì)胞分別加入20 μmol/L蘿卜硫素處理24 h，分別標(biāo)記為蘿卜硫素組、mimic NC＋蘿卜硫素組、mimic＋蘿卜硫素組、inhibitor NC＋蘿卜硫素組、inhibitor＋蘿卜硫素組、pcDNA＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋蘿卜硫素組、si-NC＋蘿卜硫素組、si-EIF4E3＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋mimic＋蘿卜硫素組用于后續(xù)實驗。

2.4 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖情況

按“2.2”項下方法進(jìn)行細(xì)胞增殖測定，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的值來評價細(xì)胞增殖能力。

2.5 Transwell檢測細(xì)胞侵襲與遷移情況

2.5.1 侵襲實驗 用不含胎牛血清的培養(yǎng)基將各組細(xì)胞稀釋至6×104個/mL，取200 μL各組細(xì)胞接種到包被有Matrigel的Transwell上室，再向Transwell下室加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去上部未遷移的細(xì)胞，然后將細(xì)胞用甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，于光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野進(jìn)行觀察并計數(shù)。

2.5.2 遷移實驗 用不含胎牛血清的培養(yǎng)基將各組細(xì)胞稀釋至6×104個/mL，取200 μL各組細(xì)胞接種到Transwell上室，再向Transwell下室加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，按“2.5.1”項下方法處理。

2.6 qRT-PCR檢測HepG2細(xì)胞miR-208a-3p mRNA表達(dá)

按照試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。以為內(nèi)參，通過2???Ct方法計算的相對表達(dá)量。引物序列：上游引物5’-ATAAGACGAG- CAAAAAGCTTGT-3’，下游引物5’-GGAACGATA- CAGAGAAGATTAGC-3’；上游引物5’-TGCG- GGTGCTCGCTTCGCAGC-3’，下游引物5’-CCAG- TGCAGGGTCCGAGGT-3’。

2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

分別構(gòu)建EIF4E3的野生型（WT）和突變型（MUT）3’-UTR區(qū)質(zhì)粒，標(biāo)記為WT-EIF4E3、MUT-EIF4E3。利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將WT-EIF4E3和MUT-EIF4E3分別與mimic NC或mimic共轉(zhuǎn)染于HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，通過雙熒光素酶測定系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

2.8 Western blotting檢測HepG2細(xì)胞EIF4E3蛋白表達(dá)情況

各組細(xì)胞加入RIPA裂解液，提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入EIF4E3和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；用TBST洗膜3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，采用ECL發(fā)光檢測試劑盒顯影，Image軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為，檢驗用于兩組間的比較，單因素方差分析用于多組間的比較，兩組之間比較采用SNK-檢驗。

3 結(jié)果

3.1 蘿卜硫素對L02和HepG2細(xì)胞存活率的影響

如表1所示，與對照組相比，蘿卜硫素（20、40 μmol/L）組L02及HepG2細(xì)胞存活率均顯著降低（＜0.05），且蘿卜硫素濃度為20 μmol/L時，L02細(xì)胞存活率為96.33%，HepG2細(xì)胞存活率為50%，并高于阿霉素組，因此選用20 μmol/L蘿卜硫素用于后續(xù)研究。

表1 蘿卜硫素對L02和HepG2細(xì)胞存活率的影響(, n = 6)

Table 1 Effect of sulforaphane on survival rate of L02 and HepG2 cells (, n = 6)

表1 蘿卜硫素對L02和HepG2細(xì)胞存活率的影響(, n = 6)

組別劑量/(μmol·L?1)L02細(xì)胞HepG2細(xì)胞 A450細(xì)胞存活率/%A450細(xì)胞存活率/% 對照—0.220±0.004100.00±0.000.340±0.008100.00±0.00 蘿卜硫素100.219±0.00598.75±1.030.298±0.004*82.52±2.62* 200.216±0.004*#96.33±1.31*#0.223±0.003*#51.32±2.24*# 400.192±0.003*#&76.25±1.27*#&0.185±0.002*#&35.22±1.82*#& 阿霉素2.50.207±0.002*#&%89.22±2.16*#&%0.203±0.002*#&%43.13±1.25*#&%

與對照組比較：*＜0.05；與蘿卜硫素（10 μmol·L?1）組比較：#＜0.05；與蘿卜硫素（20 μmol·L?1）比較：&＜0.05；與蘿卜硫素（40 μmol·L?1）組比較：%＜0.05

*<0.05control group;#<0.05sulforaphane (10 μmol·L?1) group; compared with SFN-20 group;&<0.05sulforaphane (20 μmol·L?1) group;%<0.05sulforaphane (40 μmol·L?1) group

3.2 蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

如圖1所示，與對照組比較，蘿卜硫素組細(xì)胞的450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著降低（＜0.05）。

3.3 miR-208a-3p在L02、HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對蘿卜硫素處理后的HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

如表2所示，與L02細(xì)胞比較，HepG2細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與HepG2細(xì)胞比較，20 μmol/L蘿卜硫素處理后的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低（＜0.05）。

如表3所示，與對照組、mimic NC組比較mimic組HepG2細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）；與對照組、inhibitor NC組比較，inhibitor組HepG2細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）。

圖1 蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖(A)、侵襲(B)和遷移(C) 的影響(, n = 6)

表2 miR-208a-3p在L02、HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況(, n = 6)

Table 2 Expression of miR-208a-3p in L02 and HepG2 cells (, n = 6)

表2 miR-208a-3p在L02、HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況(, n = 6)

組別劑量/ (μmol·L?1)miR-208a-3p mRNA相對表達(dá)量 L02—1.00±0.00 HepG2—2.85±0.13* 蘿卜硫素＋HepG2201.35±0.11#

與L02細(xì)胞比較：*＜0.05；與HepG2細(xì)胞比較：#＜0.05

*<0.05L02 cells;#<0.05HepG2 cells

表3 miR-208a-3p在各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)情況(, n = 6)

Table 3 Expression of miR-208a-3p in cells of each transfection group (, n = 6)

表3 miR-208a-3p在各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)情況(, n = 6)

組別miR-208a-3p mRNA相對表達(dá)量 對照1.00±0.00 mimic NC1.08±0.07 miR-208a-3p mimic2.12±0.15*# inhibitor NC1.06±0.05 miR-208a-3p inhibitor0.36±0.02*&

與對照組比較：*＜0.05；與mimic NC組比較：#＜0.05；與inhibitor NC組比較：&＜0.05

*<0.05control group;#<0.05mimic NC group;&<0.05inhibitor NC group

如圖2所示，與蘿卜硫素組、mimic NC＋蘿卜硫素組比較，mimic＋蘿卜硫素組HepG2細(xì)胞450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著升高（＜0.05）；與蘿卜硫素組、inhibitor NC＋蘿卜硫素組比較，inhibitor＋蘿卜硫素組細(xì)胞450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著降低（＜0.05）。

圖2 過表達(dá)或抑制miR-208a-3p對蘿卜硫素處理的HepG2細(xì)胞侵襲 (A、D)及遷移 (B、E)和增殖 (C) 的影響(, n = 6)

3.4 miR-208a-3p靶向調(diào)控EIF4E3的表達(dá)

Targetscan網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-208a-3p與EIF4E3存在結(jié)合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與mimic NC和WT-EIF4E3共轉(zhuǎn)染組比較，mimic和WT-EIF4E3共轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（＜0.05）；與mimic NC和MUT-EIF4E3共轉(zhuǎn)染組比較，mimic和MUT-EIF4E3共轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞的熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

Western blotting結(jié)果（圖4）顯示，與對照組、mimic NC組比較，mimic組HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與對照組、inhibitor NC組比較，inhibitor組HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

圖3 Targetscan網(wǎng)站預(yù)測miR-208a-3p與EIF4E3的結(jié)合位點

表4 各組熒光素酶活性比較(, n = 6)

Table 4 Comparison of luciferase activity in each group (, n = 6)

表4 各組熒光素酶活性比較(, n = 6)

組別熒光素酶活性 WT-EIF4E3MUT-EIF4E3 mimic NC1.07±0.141.28±0.15 miR-208a-3p mimics0.33±0.02*1.21±0.13

與mimic NC組比較：*＜0.05

*<0.05mimic NC group

A-對照組 B-mimic NC組 C-miR-208a-3p mimic組 D-inhibitor NC組 E-miR-208a-3p inhibitor組 與對照組比較：*P＜0.05；與mimic NC組比較：#P＜0.05；與inhibitor NC組比較：&P＜0.05

3.5 蘿卜硫素通過調(diào)控miR-208a-3p/EIF4E3抑制HepG2細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

如圖5所示，與L02細(xì)胞比較，HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與HepG2細(xì)胞比較，蘿卜硫素處理后的HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

如圖6所示，與對照組、pcDNA組比較，pcDNA- EIF4E3組HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）；與對照組、si-NC組比較，si-EIF4E3組HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與pcDNA-EIF4E3組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組比較，pcDNA-EIF4E3＋miR-208a-3p mimic組HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與對照組比較，pcDNA-EIF4E3＋mimic組HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)水平無顯著性差異。

A-L02細(xì)胞 B-HepG2細(xì)胞 C-蘿卜硫素＋HepG2細(xì)胞 與L02細(xì)胞比較：*P＜0.05；與HepG2細(xì)胞比較：#P＜0.05

A-對照組 B-pcDNA組 C-pcDNA-EIF4E3組 D-si-NC組 E-si-EIF4E3組 F-pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組 G-pcDNA-EIF4E3＋mimic組 與對照組比較：*＜0.05；與pcDNA組比較：#＜0.05；與pcDNA-EIF4E3組比較：&＜0.05；與si-NC組比較：%＜0.05；與pcDNA-EIF4E3＋mimic NC組比較：@＜0.05

A-control group B-pcDNA group C-pcDNA-EIF4E3 group D-si-NC group E-si-EIF4E3 group F-pcDNA- EIF4E3 + mimic NC group G-pcDNA-EIF4E3 +group*<0.05control gr+oup;#<0.05pcDNA group;&<0.05pcDNA-EIF4E3 group;%<0.05si-NC group;@<0.05pcDNA-EIF4E3 + mimic NC group

圖6 各組HepG2細(xì)胞中EIF4E3蛋白表達(dá)情況(,= 6)

Fig.6 EIF4E3 protein expression in HepG2 cells in each group (, n = 6)

如圖7所示，與蘿卜硫素組、pcDNA＋蘿卜硫素組比較，pcDNA-EIF4E3＋蘿卜硫素組HepG2細(xì)胞450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著降低（＜0.05）；與蘿卜硫素組、si-NC＋蘿卜硫素組比較，si-EIF4E3＋蘿卜硫素組HepG2細(xì)胞450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著升高（＜0.05）；與pcDNA-EIF4E3＋蘿卜硫素組、pcDNA-EIF4E3＋mimic NC＋蘿卜硫素組比較，pcDNA-EIF4E3＋miR-208a-3p mimic＋蘿卜硫素組HepG2細(xì)胞450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著升高（＜0.05）；與蘿卜硫素組比較，pcDNA-EIF4E3＋mimic＋蘿卜硫素組HepG2細(xì)胞450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目無顯著差異。

4 討論

蘿卜硫素是一種在十字花科蔬菜中發(fā)現(xiàn)的植物化學(xué)物質(zhì)，可靶向參與癌癥發(fā)展的多種途徑[8]。研究表明，蘿卜硫素可通過阻斷Notch通路活化，下調(diào)Hes1表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[9]；蘿卜硫素與索拉菲尼聯(lián)用對HepG2細(xì)胞具有協(xié)同抗腫瘤作用，其機制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]；蘿卜硫素可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路活化進(jìn)而降低胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力[11]。本研究結(jié)果顯示，蘿卜硫素可抑制HepG2細(xì)胞存活率，呈劑量相關(guān)性，且蘿卜硫素濃度為20 μmol/L時，細(xì)胞存活率接近50%，因此選用20 μmol/L蘿卜硫素用于后續(xù)研究；本研究還發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，蘿卜硫素組HepG2細(xì)胞在24、48 h的450值、侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)目顯著降低，提示蘿卜硫素可抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

miRNA是長度為22～25 nt的非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，可參與許多細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等[12]。越來越多的證據(jù)表明，多種miRNA在肝癌等人類惡性腫瘤中異常表達(dá)，miRNA的失調(diào)表達(dá)與癌癥的發(fā)病機制密切相關(guān)[13]。miR-208a-3p作為miRNA家族的一員，已有研究報道m(xù)iR-208a-3p在宮頸癌中高表達(dá)，抑制miR-208a-3p可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[14]；過表達(dá)miR-208a-3p能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[15]；抑制miR-208-3p可減弱肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[6]；miR-208a-3p通過靶向程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）在結(jié)直腸癌中發(fā)揮致癌基因的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，miR-208a-3p在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，過表達(dá)miR-208a-3p可減弱蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，下調(diào)miR-208a-3p可增強蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，提示miR-208a-3p參與了HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移過程，蘿卜硫素可能通過下調(diào)miR-208a-3p表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

圖7 過表達(dá)或抑制EIF4E3對蘿卜硫素處理的HepG2細(xì)胞侵襲 (A、D)及遷移 (B、E)和增殖 (C) 的影響(, n = 6)

為了進(jìn)一步探究蘿卜硫素通過下調(diào)miR-208a-3p表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的作用機制，本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實EIF4E3為miR-208a-3p的靶基因。EIF4E3是真核細(xì)胞翻譯起始和調(diào)控的核心成分，能夠選擇性地控制腫瘤基因的翻譯和表達(dá)[17]。研究表明，過表達(dá)EIF4E3通過下調(diào)周期蛋白B1蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞周期的G2/M期，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及克隆形成能力[18]；敲低EIF4E3可顯著增強胃癌BGC-823和MGC-803細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[7]。本研究結(jié)果顯示，EIF4E3蛋白在HepG2細(xì)胞中低表達(dá)，miR-208a-3p可靶向負(fù)調(diào)控EIF4E3，沉默EIF4E3可減弱蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，過表達(dá)EIF4E3可增強SFN對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，同時過表達(dá)miR-208a-3p和EIF4E3不會影響蘿卜硫素對HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，提示蘿卜硫素可能通過調(diào)控miR-208a-3p/EIF4E3抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

綜上所述，蘿卜硫素可能通過下調(diào)miR-208a-3p進(jìn)而上調(diào)EIF4E3的表達(dá)來抑制HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of sulforaphane on proliferation, invasion and migration of liver cancer cells based on miR-208a-3p

MEI Xiao-chen1, WANG Lei2, WANG Juan3, ZHANG Li-xiang1, LU Ying1, ZHANG Juan1, SUN Wan-ri1

1.Department of General Surgery, Nanyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Nanyang 473000, China2.Department of Pediatric Surgery, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China 3.Department of General Surgery, The First People’s Hospital of Wancheng District, Nanyang 473000, China

To investigate the effect and mechanism of sulforaphane on proliferation, invasion and migration of liver cancer cells.Human normal liver cells L02 and hepatocarcinoma HepG2 cells were treated with 10, 20, 40 μmol/L sulforaphane for 48 h, and the appropriate sulforaphane concentration was screened by CCK-8 method for subsequent experimental studies; HepG2 cells were divided into control group and sulforaphane (20 μmol/L) group, CCK-8 method was used to detect cell proliferation; Transwell was used to measure cell migration and invasion.HepG2 cells were divided into control group,mimic group, mimic group,inhibitor group, inhibitor NC group, pcDNA-eukaryotic translation initiation factor 4E (EIF4E3) group, pcDNA group, si-EIF4E3 group, si-NC group, pcDNA-EIF4E3 + mimic NC group and pcDNA-EIF4E3 +mimic group, HepG2 cells were transfected with LipofectamineTM2000 transfection kit, after 48 h of transfection, each group was treated with 20 μmol/L sulforaphane for 24 h.qRT-PCR was used to detect the expression ofin HepG2 cells; CCK-8 method was used to detect cell proliferation; Transwell method was used to measure cell migration and invasion; Dual luciferase reporter gene detection experiment was used to verify the targeting relationship between miR-208a-3p and EIF4E3; Western blotting was used to detect the EIF4E3 protein expression in cells.Compared with control group,450value, number of invasion and migration cells of HepG2 cells in sulforaphane group were significantly reduced (< 0.05);in HepG2 cells was highly expressed and EIF4E3 protein was low expressed; miR-208a-3p targeted and negatively regulated the expression of EIF4E3; Down-regulation ofor over-expression of EIF4E3 could enhance the inhibitory effects of sulforaphane on HepG2 cell proliferation, invasion and migration, while overexpression ofor silence of EIF4E3 showed the opposite trend; Overexpression ofand EIF4E3 at the same time would not affect the inhibitory effects of sulforaphane on HepG2 cell proliferation, invasion and migration.Sulforaphane may down-regulateto up-regulate the expression of EIF4E3, thereby inhibiting the proliferation, invasion and migration of HepG2 cells.

liver cancer; miR-208a-3p; sulforaphane; eukaryotic translation initiation factor 4E; proliferation

R285.5

A

0253 - 2670(2022)05 - 1450 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.020

2021-11-04

梅孝臣（1981—）男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事肝膽外科方面研究。E-mail: mx1981c@163.com Tel: 18538976966

通信作者：孫萬日（1971—）男，碩士研究生，主任醫(yī)師，主要從事肝膽外科方面研究。E-mail: 15890879873@163.com Tel: 15890879873

[責(zé)任編輯 李亞楠]