袁文雅，康益晨，楊昕宇，張茹艷，周春濤，王 勇，陳喜鵬，余慧芳，秦舒浩

(甘肅農業(yè)大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯(L.)具備產量高、耐貧瘠、易管理等優(yōu)良性狀，栽培面積不斷擴大，已逐漸成為我國多地的主栽作物。西北地區(qū)是我國馬鈴薯主產區(qū)之一，日趨加劇的連作障礙嚴重影響該地區(qū)馬鈴薯生產力，伴隨著馬鈴薯產業(yè)新格局的形成，連作障礙帶來的問題急需解決。緩解或消除連作障礙，對馬鈴薯優(yōu)質高效生產、打破馬鈴薯產業(yè)發(fā)展瓶頸具有重要意義。與土壤養(yǎng)分虧缺相比，土壤中有害微生物增加導致的土傳病害對作物生產更具危害性。馬鈴薯在生產上極忌連作，長期連作會抑制馬鈴薯植株與塊莖中干物質的累積，且隨著連作年限的增加，地上和地下部發(fā)育均受到顯著影響，干物質積累量逐年降低，最終嚴重影響馬鈴薯產量與薯塊品質形成。

近年來，輪作豆科牧草成為緩解馬鈴薯連作障礙的有效方法之一，豆科植物特有的根瘤菌能固化空氣中釋放的氮，使植物更容易吸收。豆科作物輪作主要通過改變土壤氮素狀況和根際其他生物理化性質來影響土壤微生物群落組成和土壤環(huán)境酶活性。已有研究證明，豆科作物輪作不僅增強了土壤環(huán)境酶活性和微生物群落的多樣性，而且在一定程度上顯著增加了可培養(yǎng)細菌和真菌的數(shù)量。苜蓿是“草田輪作”系統(tǒng)中應用最廣泛的豆科作物，其根系復雜，在水土保持與改良、改善農田土壤物理性質和土壤質量、維護生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著極其重要的作用。目前，對馬鈴薯與豆科作物輪作的研究主要集中在土壤有效養(yǎng)分、理化性質、生長特性、品質和產量等方面，而對豆科植物和連作馬鈴薯土壤浸提液對馬鈴薯根際土壤環(huán)境酶活性和微生物群落影響的研究較少。因此，本研究旨在探討4年齡清水苜蓿土壤浸提液對連作馬鈴薯根際土壤環(huán)境酶活性和微生物群落的影響，以探討清水苜蓿土壤浸提液對連作馬鈴薯根際環(huán)境的改善作用，為克服馬鈴薯連作障礙提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

于2019年3—9月在甘肅農業(yè)大學校內遮雨棚(36°1′N～37°9′N，106°21′E～107°44′E)進行試驗。用于提取土壤浸提液的連作馬鈴薯和清水苜蓿分別來自甘肅農業(yè)大學定西農業(yè)科學院試驗站和甘肅農業(yè)大學草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室。其中，馬鈴薯采用全膜壟播種植模式，為第4年連作，清水苜蓿為4年齡。土壤的基本理化性質如表1所示。

表1 供試土壤理化性質

1.2 試驗處理

選擇馬鈴薯品種新大坪進行盆栽試驗，基質選擇體積比為4∶1的蛭石和珍珠巖，播種前對基質進行充分消毒，以確?；|無菌。馬鈴薯出苗后，定期灌溉營養(yǎng)液，直到苗齊，然后澆灌馬鈴薯連作田土壤浸提液1 L對所有樣本進行預處理，模擬馬鈴薯連作障礙。以4年齡清水苜蓿根際土壤浸提液與水5種不同配比混合液(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，分別標記為T1、T2、T3、T4、T5)為處理組，以澆灌同量水為對照組。各處理澆灌10盆，每盆600 mL。從苗期開始處理，每7 d澆灌1次，共處理4次。

1.3 供試土壤浸提液制備

分別在清水苜蓿和馬鈴薯采收期采用抖落法進行根際土壤的采樣工作，將植株整體挖出，先去除細根和須根上不含根系的部分土壤，再抖落緊貼根系的土壤，去除異物和雜質，得到根際土壤，用無菌密封袋包裹密封，帶回實驗室儲藏備用。浸提液制備時按土∶水=1∶5的比例混合，恒溫振蕩器中振蕩1 h(轉速150 r·min)，取出并過濾以獲取浸提液，置于4 ℃冰箱中用于澆灌馬鈴薯盆栽基質。

1.4 樣品采集

于2019年8月(馬鈴薯塊莖膨大期)進行樣品采集。采用抖根法收集根際土，各處理3個重復，每個重復取樣100 g左右，分為2份，取其中一份鮮樣立即測定土壤微生物群落；另一份樣品在陰涼干燥處風干，研磨過2 mm篩，置于4 ℃冰箱，用于土壤環(huán)境酶活性的測定。

1.5 測定項目與方法

1.5.1 土壤環(huán)境酶活性測定

1.5.2 微生物群落測定

稱取新鮮樣品5 g，用無菌水在無菌條件下制備不同濃度的懸浮液(真菌、放線菌、細菌和好氧型自生固氮菌的濃度分別為10、10、10和10)，從每種懸浮液中取50 μL，接種至無菌培養(yǎng)基(真菌接種孟加拉紅培養(yǎng)基，放線菌接種改良高氏1號培養(yǎng)基，細菌接種牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，好氧型自生固氮菌接種阿須貝無氮瓊脂培養(yǎng)基)，真菌在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，放線菌在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，細菌和好氧型自生固氮菌在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察菌落與培養(yǎng)基情況。按下列公式計算以上4種菌的菌落數(shù)量：

菌落數(shù)量(CFU·g)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×20×鮮干比。

厭氧型自生固氮菌、硝化細菌和反硝化細菌分別接種于玉米面培養(yǎng)基、斯蒂芬遜改良培養(yǎng)基和組合培養(yǎng)基，反硝化細菌和厭氧型自生固氮菌稀釋梯度為10、10、10、10，硝化細菌采用10、10、10、10的稀釋梯度，之后置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d。厭氧型自生固氮菌和硝化細菌分別采用格里斯試劑和二苯胺試劑顯色，反硝化細菌采用奈氏試劑顯色，所有操作過程均在無菌條件下進行，最后依據分析得出各自的數(shù)量指標與各種菌的近似值。

計算公式為：菌落數(shù)量(MPN·g)=近似值×數(shù)量指標首位稀釋倍數(shù)×鮮干比。

1.6 數(shù)據處理

采用Origin 2018軟件繪圖，利用SPSS 25.0進行方差分析(LSD法)，比較差異顯著水平。

2 結果與分析

2.1 清水苜蓿土壤浸提液對馬鈴薯根際土壤酶活性的影響

由圖1可知，不同濃度清水苜蓿土壤浸提液處理后土壤蔗糖酶活性均顯著(<0.05)高于對照組，T1、T2、T3、T4和T5處理較對照組分別提高29.27%、38.56%、51.70%、18.65%和37.78%(圖1-A)；各處理組的土壤過氧化氫酶活性均顯著(<0.05)高于對照組，其中，T1、T4處理的過氧化氫酶活性較高，分別比對照組提高8.93%和10.14%(圖1-B)；除T5處理外，其他處理的脲酶活性均高于對照組，T1、T3、T4處理較對照組分別提高33.37%、55.27%和52.57%，T3、T4處理差異不顯著(圖1-C)；T4處理的堿性磷酸酶活性高，較對照組提高47.65%(圖1-D)。

CK，對照組(灌溉等量水)；T1～T5，清水苜蓿根際土壤浸提液與水1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1配比。無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 清水苜蓿土壤浸提液對馬鈴薯根際土壤微生物群落的影響

2.2.1 細菌、真菌和放線菌數(shù)量

由表2可知：T3處理的細菌數(shù)量顯著高于對照組，其他處理與對照組無顯著差異，各處理細菌數(shù)量增幅順序為T3>T4>T5>T1>T2；T2和T3處理的真菌數(shù)量顯著低于對照組，降幅分別為10.91%和12.42%，其他處理的真菌數(shù)量顯著高于對照組；各處理的放線菌數(shù)量較對照組都有所提高，T3處理的放線菌數(shù)量分別比對照組、T1、T4、T5處理高58.91%、9.56%、6.64%和8.45%。

表2 清水苜蓿土壤浸提液對馬鈴薯根際土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量的影響

2.2.2 自生固氮菌數(shù)量

由圖2可以看出，各處理組土壤好氧型自生固氮菌數(shù)量均顯著(<0.05)多于對照組，T1、T3、T5處理間無顯著差異，T3處理的好氧型自生固氮菌數(shù)量最多，比T2和T4處理分別顯著提高35.14%和12.83%(圖2-A)；T4處理的厭氧型自生固氮菌數(shù)量最多，分別比照組、T1、T2、T3、T5處理高54.80%、61.19%、74.58%、12.21%、14.71%(圖2-B)。

圖2 清水苜蓿土壤浸提液對馬鈴薯根際土壤自生固氮菌數(shù)量的影響

2.2.3 硝化細菌數(shù)量

由圖3可知，T4處理硝化細菌數(shù)量最多，比T1和T3處理分別高69.62%、29.81%，但與對照組、T2和T5處理差異未達顯著水平(>0.05)(圖3-A)；T1、T2處理的反硝化細菌數(shù)量顯著少于對照組，其他處理均顯著(<0.05)高于對照組，其中，T4處理的反硝化細菌數(shù)量分別比對照組、T3和T5處理高36.78%、15.78%、20.07%(圖3-B)。

圖3 清水苜蓿土壤浸提液對馬鈴薯根際土壤硝化細菌數(shù)量的影響

2.3 清水苜蓿土壤浸提液對馬鈴薯產量的影響

由圖4可知，馬鈴薯單株產量隨清水苜蓿土壤浸提液比例的增加呈先升高后降低的趨勢，T1～T5處理的馬鈴薯單株產量均顯著(<0.05)高于對照組，其中，T4處理產量增幅最大，分別比對照組、T1、T2、T3和T5處理高10.52%、6.59%、5.54%、1.78%和2.81%。

圖4 清水苜蓿土壤浸提液對馬鈴薯產量的影響

3 討論

土壤環(huán)境酶在誘導土壤代謝，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、土壤肥力形成和土壤凈化等生化過程中發(fā)揮著至關重要的作用，且隨著連作年限的增加土壤環(huán)境酶活性呈下降趨勢。有研究顯示，苜蓿等豆科植物通過共生固氮作用可以顯著提高馬鈴薯田的土壤環(huán)境酶活性，其根系能夠增加土壤中的有機氮含量，從而產生積極的環(huán)境效應。本試驗通過提取苜蓿土壤浸提液澆灌馬鈴薯種植土壤代替輪作豆科牧草來緩解馬鈴薯連作障礙，在增加馬鈴薯種植面積的基礎上改善馬鈴薯的土壤環(huán)境，從而對土壤活性產生不同程度直接或間接的影響。

土壤過氧化氫酶通過分解過氧化氫降低其毒害作用，常用作評價土壤質量好壞的生物活性指標。本研究結果表明，清水苜蓿土壤浸提液能提高連作馬鈴薯土壤過氧化氫酶活性，T3處理促進作用最顯著，這與王儀明等的研究結果一致。土壤脲酶活性反映了土壤對無機氮的供給能力和酰胺態(tài)氮的轉化能力，也間接反映了土壤的生產力和土壤成熟程度，以及肥力水平。蔗糖酶活性強弱反映土壤熟化程度和肥力水平，對增加土壤中營養(yǎng)物質含量起重要作用。本研究中，不同濃度清水苜蓿土壤浸提液對連作馬鈴薯根際土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性均有顯著影響，這可能是因為苜蓿的固氮作用提高了土壤有機質含量，微生物生長和繁殖也隨之加快，酶活性增加，這與前人的研究結果一致。T5處理的脲酶活性低于對照組，同黎舒等的研究結果相似，均表明高濃度浸提液抑制了土壤脲酶活性。

土壤堿性磷酸酶通過催化磷酸酯或磷酸酐的水解來釋放無機磷酸鹽，這些物質可以被植物和微生物吸收，其活性直接影響土壤有機磷的分解、轉化和利用。Moulin等研究表明，豆科植物和馬鈴薯輪作后，對馬鈴薯根際土壤酶活性有明顯的促進作用，本研究結果與此相似，清水苜蓿根際土壤浸提液與水體積比4∶1處理對馬鈴薯根際土壤酶活性促進效果較好。

土壤微生物是土壤的重要組成部分，其通過分解和參與養(yǎng)分循環(huán)在土壤肥力中發(fā)揮重要作用。土壤“細菌型”微生物減少、“真菌型”微生物增多被認為是造成連作障礙的主要原因之一。與連作相比，輪作更有利于馬鈴薯根系生長和對土壤養(yǎng)分的吸收利用，進而促進土壤微生物生長和繁殖。本研究結果表明，T4處理增加了土壤中厭氧型自生固氮菌、硝化菌和反硝化菌的數(shù)量，T3處理顯著增加了細菌、放線菌和好氧型自生固氮菌的數(shù)量，同時有效地減少了真菌數(shù)量，這與王勁松等的研究結果一致。T2和T3處理真菌數(shù)量均低于對照組，說明豆科植物土壤浸提液對真菌有一定的抑制作用。鄒莉等研究表明，大豆連作顯著增加了土壤中細菌的數(shù)量，減少了真菌數(shù)量，本研究結果與此相一致。

連作障礙會嚴重影響作物的生長，最直接的表現(xiàn)為產量降低，但高產是種植農作物追求的目標之一。本研究中，清水苜蓿土壤浸提液顯著提高了馬鈴薯產量，且隨著清水苜蓿土壤浸提液比例的增加馬鈴薯產量呈先升后降的趨勢，可能是清水苜蓿土壤浸提液改善了土壤中的微生物組成及其群落結構，從而促進了植株對土壤養(yǎng)分的吸收能力，進而提高產量。

4 結論

不同濃度清水苜蓿土壤浸提液均可提高馬鈴薯根際土壤環(huán)境過氧化氫酶、堿性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶活性，增加部分微生物數(shù)量，降低真菌數(shù)量，以T4處理效果最好。推測可以添加清水苜蓿土壤浸提液替代輪作，改善馬鈴薯連作障礙，增加馬鈴薯種植面積，為馬鈴薯種植提供更適宜的土壤環(huán)境，有效降低連作障礙造成的危害。