劉 芳，袁宗勝，曾志浩，林鴻艷，周麗麗，潘 輝*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.閩江學(xué)院 海洋研究院，福建 福州 350108）

根際是植物進(jìn)行正常生長發(fā)育，與植物根系緊密相關(guān)，并與微生物群系共同構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)區(qū)系，植物通過根際與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)與能量交換，根際微生物所形成的微生物環(huán)境對植物生長起到極其重要的作用［1－2］。植物根系和微生物之間的作用是相互的，根際微生物能夠通過促進(jìn)植物對營養(yǎng)的吸收以及直接的作用促進(jìn)植物生長發(fā)育，根際微生物群落的結(jié)構(gòu)組成和功能多樣性受土壤類型、植物基因型、根系分泌物及植物生長周期等因素的影響［3－4］。多位學(xué)者已對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、土壤微生物的作用，以及土壤微生物、植物群落及土壤特征之間的關(guān)系等進(jìn)行了研究［5-8］。研究表明，根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響植物的生長發(fā)育，同樣，植物類型的多樣性也會(huì)影響根際微生物群落的結(jié)構(gòu)［9-11］。

相思類樹種是常綠喬木，屬含羞草科（Mimosaceae）金合歡屬（Acacia Wild）。研究表明，相思類樹種生長迅速、萌生能力強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)，耐貧瘠、鹽堿和干旱，是沿海地區(qū)沙質(zhì)土壤更新造林的理想樹種［12］。許多林學(xué)專家及林業(yè)工作者已開展了相思樹的引種、栽培技術(shù)及經(jīng)營管理等方面的研究［13-14］。開展相思樹根際與內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)差異性以及關(guān)鍵微生物功能的研究，對于充分發(fā)揮相思樹種的改良土壤、維持地力、保持水土等生態(tài)功能具有重要的意義。

本文利用Illumina NovaSeq高通量測序技術(shù)，對福建省漳浦中西國有林場的不同相思樹種（以同一生境的桉樹為對照）的根際和非根際土壤細(xì)菌群落的多樣性特征進(jìn)行了分析，以期為相思樹內(nèi)生功能菌株的挖掘和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采樣地設(shè)在中國福建省漳浦中西國有林場，該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，地理坐標(biāo)為117°56′E、24°28′N，年平均氣溫21.8 ℃，年降水量1600 mm。在2019年11月，分別采集厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思、馬占相思等樹種的根際土壤及非根際土壤樣本。

土壤樣本采集：隨機(jī)選取健壯植株，在距樹干1 m左右的位置用鐵鏟挖取50~60 cm深的樹根，將樹根取出，并選取黏在根上粒徑小于1cm的土壤作為根際土壤樣本，選取離植株根部30 cm以外的土壤作為非根際土壤樣本。采集樣本后立即將其放入無菌樣本袋中，在24 h內(nèi)置于-20 ℃保存。本研究共采集樣本30個(gè)，每組3個(gè)樣本，樣本編號(hào)分別為厚莢相思根際土壤（HJ.D）和非根際土壤（HJ.E）；卷莢相思的根際土壤（JJ.D）和非根際土壤（JJ.E）；黑木相思的根際土壤（HM.D）和非根際土壤（HM.E）；直干相思的根際土壤（ZZ.D）和非根際土壤（ZZ.E）；馬占相思的根際土壤（MZ.D）和非根際土壤（MZ.E）。

1.2 樣本基因組DNA的提取及高通量測序

采用試劑盒TIANGEN Plant Genomic DNA kit（50）DP305-02并按照其說明書的步驟提取樣本基因組DNA。采用瓊脂糖電泳檢測基因組DNA的濃度和純度。將檢測合格的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，形成測序文庫［15］，并將質(zhì)檢合格的文庫在Illumina NovaSeq PE250測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序（由北京諾禾致源科技股份有限公司完成）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對測序得到的雙端Reads （PE Reads）進(jìn)行拼接、過濾，除去嵌合體序列，最終得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。在97%相似度水平下對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，獲得OTU（分類操作單元）。采用RDP Naive Bayesian Classifier分類算法進(jìn)行注釋。使用BioVenn在線軟件進(jìn)行Venn圖繪制；使用Qiime軟件計(jì)算觀測物種數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)等，分析不同相思樹種根內(nèi)生細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特征及差異［16-18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及OTU分析

經(jīng)測序分析，30個(gè)相思樹樣本序列長度在61029~90690條，總有效數(shù)據(jù)為2314745條。根據(jù)相似度在97%以上的序列聚類為1個(gè)OTU的原則進(jìn)行有效OTUs統(tǒng)計(jì)，從圖1的稀釋曲線可以看出，當(dāng)樣本測序深度達(dá)15000條時(shí)，稀釋曲線都趨于平緩，表明本次測序深度足以可靠地描述與樣本相關(guān)的細(xì)菌群落。

圖1 相似度為97%水平下的稀釋曲線

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本共有和特有的OTU數(shù)目，能比較直觀地展現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。圖2為不同相思樹種根際和非根際細(xì)菌OTUs的Venn圖。從不同樣本來源來看，不同相思樹種根際土壤樣本細(xì)菌的OTU數(shù)目表現(xiàn)為黑木相思＞直干相思＞馬占相思＞卷莢相思＞厚莢相思；不同相思樹種非根際土壤樣本細(xì)菌的OTU數(shù)目表現(xiàn)為厚莢相思＞直干相思＞黑木相思＞馬占相思＞卷莢相思。不同相思樹種同一來源土壤樣本細(xì)菌的OTU數(shù)目未呈現(xiàn)出完全一致的變化趨勢，但總體上表現(xiàn)為根際樣本＞非根際樣本。

圖2 不同相思樹種根際、非根際共有的細(xì)菌OTUs數(shù)量

5種不同相思樹種根際土壤樣本有683個(gè)共有OTUs，厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思及馬占相思獨(dú)有的OTUs數(shù)分別為115、91、212、166及180個(gè)。5種不同相思樹種非根際土壤樣本有651個(gè)共有OTUs，厚莢相思、卷莢相思、黑木相思、直干相思及馬占相思獨(dú)有的OTUs數(shù)分別為128、81、151、145及168個(gè)。

2.2 細(xì)菌多樣性分析

Alpha多樣性分析可以反映樣本細(xì)菌群落的多樣性和物種豐度， ACE和Chao1指數(shù)能反映物種的豐富度，香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)能反映物種的多樣性。ACE和Chao1指數(shù)數(shù)值越大，說明根內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量越多；香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)數(shù)值越大，說明根內(nèi)生細(xì)菌的多樣性越高。由表1可知：不同相思樹種根際土壤細(xì)菌數(shù)量的排序?yàn)楹谀鞠嗨迹抉R占相思＞直干相思＞卷莢相思＞厚莢相思；不同相思樹種根際土壤細(xì)菌多樣性的排序?yàn)楹谀鞠嗨迹揪砬v相思＞直干相思＞馬占相思＞厚莢相思；不同相思樹種非根際土壤細(xì)菌數(shù)量的排序?yàn)楹袂v相思＞黑木相思＞直干相思＞馬占相思＞卷莢相思；不同相思樹種非根際土壤細(xì)菌多樣性的排序?yàn)楹袂v相思＞直干相思＞黑木相思＞馬占相思＞卷莢相思。由此可知，在不同相思樹種的根際土壤樣本中，黑木相思根際土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性最高，同一相思樹種根際土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性的變化規(guī)律相同。在不同相思樹種的非根際土壤樣本中，厚莢相思非根際土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性最高，同一相思樹種非根際土壤樣本細(xì)菌的豐富度和多樣性的變化規(guī)律不同。相同相思樹種根際土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性均高于非根際土壤細(xì)菌的。

表1 不同土壤樣品的測序統(tǒng)計(jì)結(jié)果與Alpha多樣性指數(shù)

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

比較了不同相思樹種根際和非根際細(xì)菌群落在綱水平上的相對豐度，結(jié)果如圖3所示，各樣本中占據(jù)主導(dǎo)地位的細(xì)菌群落均為Acidobacterlia和Alphaproteobacteria，其次為Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。其中，Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria在同一相思樹種根際土壤樣本中所占豐度均高于非根際土壤樣本，Acidobacterlia在同一相思樹種非根際土壤樣本中所占豐度均高于根際土壤樣本。

圖3 不同相思樹種土壤細(xì)菌群落在綱水平上的相對豐度

從圖4可以看出，不同相思樹種土壤樣本在目水平上的優(yōu)勢菌群存在較大差異。通過比較不同樹種根內(nèi)生細(xì)菌群落豐度比例可知，在不同相思樹種的根際土壤和非根際土壤樣本中，Acidobacteriales占主導(dǎo)地位，其次為Rhizobiales、unidentified_Gammaproteobacteria、unidentified_Alphaproteobacteria和Frankiales。在相同相思樹種的根際土壤樣本中Acidobacteriales、Rhizobiales、unidentified_Gammaproteobacteria和Frankiales的群落豐度均高于非根際土壤樣本中的。Xanthomonadales在卷莢相思、黑木相思和直干相思根際土壤樣本中的群落豐度均高于厚莢相思、馬占相思及不同相思樹種非根際土壤樣本中的。不同相思樹種根際和非根際土壤細(xì)菌群落在目水平上的相對豐度存在差異。

如圖5所示，10組土壤樣本的細(xì)菌群落豐度居前10的科主要包括Xanthobacteraceae、Beijerinckiaceae、Enterobacteriaceae、Pseudonocardiaceae、Burkholderiaceae、unidentified_Gammaproteobacteria、Pseudomonadaceae、unidentified_Acidobacteriales、Caulobacteraceae、Acidothermaceae。通過比較不同相思樹種根內(nèi)生細(xì)菌在科水平上的群落豐度比例可知， Xanthobacteraceae、Acidothermaceae、unidentified_Acidobacteriales在不同相思樹種的根際土壤及非根際土壤樣本中均占優(yōu)勢。同一相思樹種根際土壤樣本的細(xì)菌豐度均高于非根際土壤樣本的；不同相思樹種根內(nèi)生細(xì)菌群落在科水平上的相對豐度存在差異。

圖5 不同相思樹種土壤細(xì)菌群落在科水平上的相對豐度

3 結(jié)論與討論

由于不同樹種的根部具有不同的吸收營養(yǎng)和分泌物質(zhì)的能力，同時(shí)植物的根狀體沉積和根分泌物能促進(jìn)根際土壤和根平面的化學(xué)吸引和定殖，所以形成了獨(dú)特、高度豐富和多樣的根際微生物群落［19-25］。筆者的研究表明：不同相思樹種在根際細(xì)菌群落的差異性。

已有研究表明，土壤根系富集的微生物在植物的生長發(fā)育過程中扮演著非常重要的角色，包括增強(qiáng)植物的抗逆性、促進(jìn)對營養(yǎng)的吸收，以及響應(yīng)植物的周期性［26］。Smalla等對馬鈴薯等作物根際微生物群落結(jié)構(gòu)的研究表明，根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響植物的生長發(fā)育，同樣，植物類型的多樣性也會(huì)影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)［5］。

植物與微生物的互作是近年來微生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)，通過系統(tǒng)了解植物和微生物的功能和作用機(jī)制，研究植物在不同生長階段與微生物之間的相互作用，對提高植物的生產(chǎn)力，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，開發(fā)有益的微生物進(jìn)行可持續(xù)的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)具有重要的實(shí)踐意義［27］。