龔偉偉，趙懿琛,*，羅顯麟，楊玲玲，趙德剛

(1.貴州大學(xué) 茶學(xué)院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025; 2.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025; 3.貴州大學(xué) 生命與科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025; 4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家DUS中心貴陽分中心，貴州 貴陽 550006)

花煙草()是茄科，煙草屬有限的多年生草本植物，其植株緊湊，連續(xù)開花，常被用作綠化植物。NaD1(defensin 1)蛋白是一類最先在花煙草中發(fā)現(xiàn)的植物防御素，與大多數(shù)防御素不同，它是作為前體產(chǎn)生的，除了具有典型的分泌信號肽和47～49個氨基酸的中央防御素結(jié)構(gòu)域外，還含有27～33個氨基酸的C-末端結(jié)構(gòu)域，其表達主要是花特異的，并且在花發(fā)育的早期階段最為活躍，防止花煙草生殖組織免受病原菌的侵害。研究發(fā)現(xiàn)，茄科類植物中的栽培煙草的花防御素FST和番茄的TPP3也具有類似的C-末端結(jié)構(gòu)域，可引導(dǎo)蛋白至液泡中沉積，然后在分泌途徑的運輸過程中或之后被移除，而矮牽牛的花防御素PPT和番茄的TGAS118缺乏此結(jié)構(gòu)域。成熟的NaD1蛋白具有47個氨基酸殘基，在極端的pH和溫度下也保持穩(wěn)定，因為其富含半胱氨酸，且含有由3個反向平行的β-折疊和1個α-螺旋組成的αβ基序(CSαβ基序)。NaD1蛋白屬于陽離子抗菌肽(CAPs)家族的一員，研究發(fā)現(xiàn)，其可通過二聚作用和依賴細胞壁途徑滲透菌絲，進入細胞質(zhì)并誘導(dǎo)ROS和NO產(chǎn)生，從而對尖孢鐮刀菌()、黃萎病菌()、白色念珠菌()和新型隱球菌()等真菌產(chǎn)生殺傷作用；也可特異地與細胞質(zhì)膜的PIP2結(jié)合形成一個拱形的低聚復(fù)合物，通過非凋亡的膜溶解過程誘導(dǎo)人上皮宮頸癌(HeLa)、白血病T細胞(Jurkat)、惡性黑色素瘤(MM170)等哺乳動物腫瘤細胞死亡，并且不會對人體細胞產(chǎn)生傷害，有望開發(fā)為抗癌藥物。

啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。真核生物啟動子分為核心啟動子區(qū)和上游序列區(qū)兩個區(qū)域，核心啟動區(qū)含有轉(zhuǎn)錄起始位點和TATA-box 等順式作用元件；上游序列區(qū)含有不同的調(diào)控表達元件，對基因轉(zhuǎn)錄的效率、特異性和活性起關(guān)鍵作用，確?；蜣D(zhuǎn)錄的有效性和精確性。啟動子是基因的重要元件，對于調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達非常關(guān)鍵，也是DNA重組技術(shù)中構(gòu)建表達載體的重要組成部分。熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)、基因組DNA步移、反向PCR等是常見的幾種啟動子克隆方法。如今，越來越多的啟動子分析數(shù)據(jù)庫和軟件為我們研究啟動子功能提供了便利，通過在線軟件預(yù)測啟動子順式作用元件，組織化學(xué)染色、5′端缺失分析、熒光分析、酵母單雜交和染色質(zhì)免疫共沉淀等是研究啟動子功能的常用方法。

目前對于1的研究主要涉及蛋白的功能和作用機制，而對其基因表達和啟動子功能的研究卻鮮有報道。本研究對1基因在花煙草不同組織部分、不同發(fā)育階段葉片以及光脅迫處理后的表達水平進行了分析；對花煙草1基因的上游調(diào)控序列進行了克隆，得到其啟動子基本元件的完整序列，對其進行生物信息學(xué)分析；通過構(gòu)建連接缺失啟動子片段啟動GUS基因表達的植物表達載體，遺傳轉(zhuǎn)化至花煙草，從而驗證啟動子的活性，以期為研究1基因的表達調(diào)控模式奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

花煙草()植株來自貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院溫室。DH5α感受態(tài)細胞、農(nóng)桿菌LBA4404細胞由實驗室保存。DNA聚合酶、Fruit-matefor RNA purification、RNAiso Plus、DL2000 Marker、Genome Walking Kit購自TaKaRa公司；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit、SYBR Select Master Mix購自Applied Biosystems公司。

1.2 NaD1基因的表達模式分析

提取花煙草根、嫩莖、嫩葉、花及伸根期、旺長期、成熟期發(fā)育階段的花煙草葉片的總RNA，分別在3株植株取樣，用ABI反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以N-actin-F/R引物為對照(引物序列見表1)，利用Real-time PCR技術(shù)對1基因進行表達量分析。PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex酶5.0 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddHO 3.0 μL，終體系為10.0 μL。反應(yīng)程序為50 ℃孵育2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，添加熔解曲線。導(dǎo)出數(shù)據(jù)后，利用絕對定量法對1基因的相對表達量進行統(tǒng)計分析。

1.3 NaD1基因啟動子的克隆

本實驗參照魏勝華等的CTAB法對花煙草DNA進行提取。根據(jù)NCBI上公布的1基因的DNA序列設(shè)計引物Na-NaD1-D-F和Na-NaD1-D-R(GeneID:109219036)，擴增得到1基因的DNA序列。根據(jù)克隆得到的1基因的DNA序列，按照Genome Walking Kit說明書設(shè)計3條特異性引物，分別為Na-sp1、Na-sp2和Na-sp3，引物序列見表1。引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。根據(jù)楊玲玲論文中的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，通過熱不對稱交錯PCR克隆1基因上游片段。將PCR產(chǎn)物連接至pMDTM19-T Vector上，轉(zhuǎn)化至DH5α進行擴增，經(jīng)藍白斑篩選、PCR和d Ⅲ及Ⅰ雙酶切鑒定后，送交北京華大基因科技有限公司進行測序。

表1 引物序列

1.4 NaD1基因啟動子序列的鑒定和分析

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計特異性引物Na-p-644-F：5′-TCAGGTTATTTACTTTTTGGGG-3′和Na-p-644-R：5′-TGAAGCACAAGGAGCGAG-3′(下劃線分別代表Ⅰ和RⅠ酶切位點)，引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。根據(jù)Platinum?DNA Polymerase High Fidelity Kit，擴增1基因的上游啟動子序列。PCR反應(yīng)體系為：Platinum酶1.0 μL，10×High Fidelity PCR Buffer 2.5 μL，50 mmol·LMgSO1.0 μL，10 mmol·LdNTP mix 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，花煙草基因組DNA 1.0 μL，ddHO 18.0 μL，終體系為25.0 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，25個循環(huán)；68 ℃延伸10 min，12 ℃保存。

將擴增產(chǎn)物膠回收并連接至pTMD-19T載體上，送交北京六合華大基因科技有限公司進行測序。使用Blast、DNAMAN軟件將兩次測序得到的啟動子序列進行比對，然后對序列進行Plant CARE在線分析啟動子元件，確定其含有的啟動子元件。

1.5 NaD1基因?qū)庠捻憫?yīng)

根據(jù)Lay等的描述，1基因的表達在花發(fā)育早期最為活躍。以花始開期的花煙草花為材料，對其進行光照處理0、12、24、48和72 h，暗處理0、12、24、48和72 h，采取不同時間段的花利用Trizol法提取RNA，根據(jù)High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以實驗室前期篩選出的NaD1-F-60、NaD1-R-177引物(序列見表1)對1基因的表達量進行Real-Time PCR分析。反應(yīng)體系和程序如1.2節(jié)。

1.6 植物表達載體構(gòu)建

根據(jù)得到的啟動子序列，委托上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成pNaD1-644和pNaD1-310啟動子片段，pNaD1-310包含啟動子基本元件TATA-box、CAAT-box及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。將兩段片段分別連接至植物表達載體pCAMBIA1391z的GUS報告基因前，用于驅(qū)動其表達。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α菌株進行擴增，利用堿裂解法提取質(zhì)粒進行Ⅰ、RⅠ雙酶切驗證，用瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

采用凍融法將兩種植物表達載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法分別遺傳轉(zhuǎn)化至花煙草中，在篩選培養(yǎng)基中添加的激素有1.0 mg·L的6-BA和0.1 mg·L的NAA，抗生素為20 mg·L的潮霉素(Hyg)。通過篩選得到了抗性幼苗。

1.8 GUS組織化學(xué)染色

取抗性幼苗的葉片浸泡于GUS染色液中，37 ℃染色12 h，GUS染色液包括0.1 g X-gluc，2 mL 0.5 mol·LEDTA-Na，39 mL 0.2 mol·LNaHPO，61 mL 0.2 mol·LNaHPO，100 μL 1% Triton X-100，450 μL β-巰基乙醇，ddHO 定容至100 mL。用75%乙醇脫色至浸泡液中沒有綠色后拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaD1基因的表達模式分析

對1基因在花煙草不同組織器官及不同生長發(fā)育階段的表達量進行熒光定量分析(圖1-A)。結(jié)果表明，1基因在花始開期花煙草植株不同組織器官中的表達量差異明顯，其在花中的表達量顯著高于根、嫩莖、嫩葉中的表達量，約是根的2 000倍，嫩莖的80倍，嫩葉的10倍；在葉中的表達量也達到了根中表達量的近128倍和莖中表達量的近5倍。說明1基因的表達具有組織特異性，在花發(fā)育期間，1基因主要在花蕾中表達。1基因在不同發(fā)育階段的葉片中的表達也存在差異，如圖1-B所示，葉片中的表達量隨著植物的生長發(fā)育階段先增加后下降，在煙草旺長期其表達量達到最大。推測NaD1蛋白可能與保護生殖組織免受一系列潛在病原體的侵害有關(guān)。

不同數(shù)據(jù)間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 NaD1基因啟動子的克隆及分析

克隆得到一條大小為644 bp的1基因上游序列，經(jīng)過與以花煙草基因組DNA為模板擴增的上游序列進行比對，并通過鑒定發(fā)現(xiàn)成功擴增1基因啟動子序列。利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測了1基因上游644 bp序列的順式作用元件，結(jié)果如圖2和表2所示。1基因啟動子元件包含基礎(chǔ)啟動子區(qū)域TATA-box和CAAT-box，還包括MBS和TC-rich repeats等與植物逆境脅迫相關(guān)元件；Box Ⅰ和Ⅰ-box等光響應(yīng)元件；5′UTR Py-rich stretch等高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件。推測該啟動子可能具有逆境脅迫的誘導(dǎo)表達特性和光周期誘導(dǎo)表達特異性，為了驗證這一推測，對1基因進行了光脅迫響應(yīng)分析。

表2 NaD1基因5′端調(diào)控區(qū)順式作用元件

圖2 NaD1基因5′端調(diào)控區(qū)順式作用元件

2.3 NaD1基因?qū)饷{迫響應(yīng)分析

在不同光處理的條件下測定了1基因在花煙草花中的表達量，結(jié)果表明(圖3)：光照條件對1基因在花煙草花中的表達量有顯著影響，隨著光處理時間的增長而顯著增加，隨著暗處理時間增長而顯著減少，與PlantCARE預(yù)測結(jié)果相符，說明在光脅迫條件下，1基因的表達受上游啟動子元件的調(diào)控。

圖3 不同光照處理(A)和黑暗處理(B)下NaD1基因在花煙草花中的表達量

2.4 NaD1基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性驗證

將構(gòu)建得到的兩個植物表達載體pCAMBIA1391z-pNaD1-644∶∶GUS和pCAMBIA1391z-pNaD1-310∶∶GUS進行雙酶切驗證，電泳結(jié)果顯示得到大小在650 bp和300 bp左右的條帶(圖4-A)，與預(yù)期得到的644 bp和310 bp條帶大小相符，說明所構(gòu)建的載體為陽性。將兩個植物表達載體遺傳轉(zhuǎn)化花煙草，對抗性幼苗葉片進行GUS染色分析顯示都為陽性(圖4-B)，說明啟動子核心元件TAAT-box、CAAT-box位于片段pNaD1-310中，即-310～-1 bp。

A，重組質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖：1，DL2000 Marker；2，pNaD1-644；3，pNaD1-310；4，15 000 Marker；B，抗性幼苗葉片GUS組織化學(xué)染色：1，野生型；2，pCAMBIA1391z-pNaD1-310∶∶GUS；3，pCAMBIA1391z-pNaD1-644∶∶GUS。

3 討論

NaD1分別與煙草的FST和番茄的TPP3具有98%和63%的氨基酸序列同源性，研究表明，二者在發(fā)育早期的花芽中表達量最高，隨著花的成熟而大幅降低。本研究基于qRT-PCR技術(shù)對1基因在花煙草根、莖、葉和花中的表達量進行了分析，結(jié)果表明花中1基因的表達量顯著高于根、莖和葉中的表達量，與前期研究相符。Lay等還檢測了1基因在花煙草花的不同部位的表達量，發(fā)現(xiàn)在花藥、雌蕊(柱頭和花柱)、子房和花瓣中含量較高，而在花藥和花柱的絨氈層、花粉母細胞、傳遞組織或維管束中未檢測到轉(zhuǎn)錄本。對1基因在花煙草不同發(fā)育階段的葉片進行表達量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葉片中的表達量隨著生長發(fā)育呈先上升后下降的趨勢，在旺長期和成熟期1基因的表達量顯著高于伸根期。根據(jù)以上研究推測NaD1蛋白主要作為一種保護花蕾免受侵害的植物防御素，開花期前主要在葉片中起到一定的保護作用，而為了了解該基因詳細的調(diào)控模式，需更深入地對1基因啟動子整體結(jié)構(gòu)以及在真菌或昆蟲侵染下的表達調(diào)控進行探索分析。

啟動子中含有重要的順式作用元件，研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能有助于了解該基因的表達調(diào)控模式，可在遺傳轉(zhuǎn)化調(diào)控外源基因表達中起到重要作用。朱鶴等通過PCR克隆了半滑舌鰨結(jié)蛋白基因不同長度的啟動子片段，并對其進行啟動活性分析。結(jié)果表明，半滑舌鰨基因 ATG上游長度為667 bp的片段是其核心啟動子；周家紅等構(gòu)建了含有2基因5′端不同區(qū)域的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，鑒定了具有基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的最小啟動子區(qū)域-58/+60。本研究通過熱不對稱交錯PCR成功克隆得到了大小為644 bp的1基因上游序列，利用PlantCARE在線軟件對其啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其含有TATA-box和CAAT-box基礎(chǔ)啟動子區(qū)域，光、乙烯和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，還含有高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件5′UTR Py-rich stretch等。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，對花期花煙草進行光脅迫處理，發(fā)現(xiàn)對1基因的表達量確實存在顯著影響，與啟動子元件的分析結(jié)果相對應(yīng)，但在暗處理后1基因表達量顯著降低，表明除光因素外還有其他調(diào)控因子在光照條件下對1基因表達的上調(diào)產(chǎn)生了作用。通過啟動子序列的分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有花特異性響應(yīng)元件，但1基因時空表達分析的結(jié)果表明，1基因在花煙草花中特異性表達，葉片中也具有一定的表達量，推測主要與保護花組織免受病原菌的侵害有關(guān)。

通過構(gòu)建兩個植物表達載體pCAMBIA1391z-pNaD1-644∶∶GUS和pCAMBIA1391z-pNaD1-310∶∶GUS，將其遺傳轉(zhuǎn)化至花煙草并進行GUS染色后發(fā)現(xiàn)結(jié)果均為陽性，說明啟動子核心元件位于1基因上游-310～-1 bp中。以上研究結(jié)果為研究1基因的表達調(diào)控模式和更高效地利用NaD1蛋白奠定了基礎(chǔ)。