朱金霞 劉光偉 楊培偉

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 (河南 鄭州， 450000) 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝膽科

原發(fā)性肝癌分為肝細(xì)胞癌(HCC)、膽管細(xì)胞癌(ICC)以及混合癌。2020年全球肝癌流行病學(xué)顯示：肝癌占全球癌癥新發(fā)4.69%，死亡率占8.34%[1]。HCC的治療采用手術(shù)、介入、放化療及分子靶向免疫等手段。近年來以程序性死亡蛋白1(PD-1)/ PD-L1為代表的免疫檢查點抑制劑治療HCC在臨床中顯示出前所未有的療效，逐漸改變著HCC的治療格局，為肝癌患者提供了新的抗癌策略[2]。

PD-1是一種重要的免疫抑制分子，結(jié)合其配體PD-L1后，在腫瘤免疫逃逸、抑制免疫應(yīng)答、中樞及外周免疫耐受、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。研究表明，在HCC治療上，PD-1/PD-L1抑制劑使諸多患者受益、生存期得到有效延長。影響PD-1/PD-L1表達(dá)的因素眾多，本文總結(jié)了WNT-β-catenin、JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB等信號通路及microRNA、lncRNA、circ-RNA調(diào)控PD-1/PD-L1的表達(dá)從而影響肝癌進(jìn)展，指出干預(yù)其上游調(diào)節(jié)因子：利用既能調(diào)控PD-1 / PD-L1表達(dá)又能調(diào)控細(xì)胞增殖的分子提高HCC臨床療效是未來治療的一大策略。

1 PD-1/PD-L1概述

PD-1在T細(xì)胞，單核細(xì)胞，B細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞上表達(dá)。PD-1/PD-L1通過T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)：PD-L1在腫瘤細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)上表達(dá)，T細(xì)胞的PD-1結(jié)合PD-L1后導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙、乃至衰竭。腫瘤中過表達(dá)PD-L1可使自身逃脫細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+)介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷[3]。一種在活化T細(xì)胞和APC上表達(dá)的蛋白質(zhì)-B7-1(CD80)，和腫瘤細(xì)胞的PD-L1相互作用，導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞活化減少[4]。CD8+T細(xì)胞衰竭后，腫瘤細(xì)胞的活性增強(qiáng)且侵略性高，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素2(IL-2)和干擾素γ(IFN-γ)等多種促炎細(xì)胞因子被分泌，為腫瘤的發(fā)生營造出高炎性環(huán)境。T細(xì)胞的另一種亞型：Treg CD4+，通過維持其表面上PD-1表達(dá)而產(chǎn)生高度免疫抑制的腫瘤環(huán)境。Treg細(xì)胞的PD-1蛋白促進(jìn)了原始CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而抑制了免疫應(yīng)答，具體來說是通過抑制mTOR-Akt信號傳導(dǎo)的哺乳動物靶標(biāo)而增加了CD4+T細(xì)胞的Treg表達(dá)和免疫抑制功能[5]。以上可見，PD-1表達(dá)不僅減弱了效應(yīng)性T細(xì)胞的免疫促進(jìn)作用，還增強(qiáng)了免疫抑制性Treg細(xì)胞的抑制作用。

抗腫瘤免疫周期的步驟包括：釋放腫瘤抗原，腫瘤抗原呈遞，引發(fā)和激活，T細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)運，T細(xì)胞浸潤，通過T細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞，以及殺死癌細(xì)胞。PD-1/PD-L1，主要通過損害細(xì)胞溶解性T細(xì)胞的活性而影響免疫力[6]。臨床常用的單克隆抗體(mAb)免疫療法療效顯著，具體機(jī)制如圖1。抗原呈遞細(xì)胞(APC)結(jié)合從癌細(xì)胞釋放并呈遞抗原(Ag)以激活T細(xì)胞，T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體(TCR)與MHC呈遞的抗原肽復(fù)合物結(jié)合提供第一活化信號(TCR激活信號傳導(dǎo)途徑以與CD86/CD28軸的共同刺激信號一起引起T細(xì)胞活化。CTLA-4也與CD86結(jié)合，但致使T細(xì)胞失活)。PD-1在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，并通過結(jié)合APC或腫瘤細(xì)胞上的PD-L1抑制免疫反應(yīng)。因此，特異性阻斷單克隆抗體(mAb)介導(dǎo)的PD-1/PD-L1 途徑可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。

2 信號通路調(diào)控PD-1/PD-L1表達(dá)影響肝癌進(jìn)展

2.1 Wnt-β-catenin Wnt-β-catenin信號通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面作用重大，促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤進(jìn)展及耐藥。諸多證據(jù)表明異常的Wnt信號致使腫瘤自身的免疫監(jiān)測系統(tǒng)紊亂，促進(jìn)免疫逃逸及多種免疫療法的耐藥性。研究表明：β-catenin激活可促進(jìn)HCC的免疫逃逸和PD-1治療的耐藥性。小鼠自身MYC(致癌基因)、 p53-/-(抑癌基因)抗原表達(dá)的HCC通過上調(diào)β-catenin途徑逃脫了免疫系統(tǒng)。進(jìn)一步證明了MYC過表達(dá)和β-catenin激活的情況下，免疫監(jiān)視不起作用。β-catenin激活導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞(DC)和抗原特異性T細(xì)胞的募集缺陷，并因此導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答受損。趨化因子(CC基序)配體5的重新表達(dá)，這種趨化因子在鼠和人腫瘤中均受β-catenin激活的驅(qū)動而被下調(diào)，恢復(fù)了免疫監(jiān)視。最后證明腫瘤抗原的表達(dá)是PD-1抑制劑治療發(fā)揮作用的必要條件，對于β-catenin激活的HCC模型均未對PD-1抑制劑發(fā)生反應(yīng)，證明了β-catenin激活增強(qiáng)了實驗?zāi)Ｐ椭忻庖忒煼ǖ哪退幮訹8]?？偟膩碚f，HCC中Wnt-β-catenin的激活，抑制了免疫應(yīng)答，免疫抑制劑耐藥性增加。

2.2 JAK-STAT JAK-STAT信號通路在細(xì)胞增殖、分化及免疫炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用，對于HCC，JAK / STAT信號傳導(dǎo)被異常激活，其下游靶基因控制腫瘤生長，血管生成，免疫監(jiān)視，侵襲和轉(zhuǎn)移的功能失調(diào)[9]。據(jù)報道，JAK/STAT途徑可在腫瘤中誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，對免疫治療意義非凡。JAK2抑制劑AG490可抑制PD-L1在蛋白質(zhì)和mRNA水平上的表達(dá)[10]。在HCC治療中，長期使用吲哚美辛通過JAK/STAT3和TRIF/NF-κB途徑促進(jìn)PD-1和PD-L2的表達(dá)，從而抑制HCC中的TNF-α和干擾素(IFN-γ)導(dǎo)致疾病預(yù)后不良[11]。另外，成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)2激活JAK/STAT3信號通路的同時致使體外PD-L1表達(dá)增多，腫瘤體積變大。而JAK抑制劑下調(diào)JAK/STAT3后腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)被阻斷[12]。以上均證實JAK / STAT途徑激活上調(diào)PD-L1表達(dá)，而抑制該通路相應(yīng)表達(dá)減少，免疫監(jiān)視功能恢復(fù)。

2.3 PI3K- AKT 磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路能控制腫瘤細(xì)胞生存、增殖、及轉(zhuǎn)移，阻斷免疫抑制途徑、增強(qiáng)固有免疫而提高免疫監(jiān)視控制腫瘤進(jìn)展[13]。首先發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt通路調(diào)節(jié)腫瘤PD-L1的表達(dá)是在BRAF抑制劑中加入PI3K抑制劑導(dǎo)致PD-L1表達(dá)降低[14]。PI3K-AKT抑制因子：PTEN缺失誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞PD-L1細(xì)胞表達(dá)增加導(dǎo)致T細(xì)胞增殖減少和凋亡增加，而使用AKT抑制劑MK-2206或mTOR抑制PI3K途徑會導(dǎo)致PD-L1表達(dá)降低[15]。雖然AKT抑制劑能降低PD-L1表達(dá)，但其下游效應(yīng)子mTOR/核糖體蛋白S6卻不介導(dǎo)AKT誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)[14]。聯(lián)用PI3Kβ和PD-L1抑制劑可顯著增加自發(fā)性腫瘤模型和移植瘤模型中的CD4+T和CD8+T細(xì)胞浸潤，顯著抑制了腫瘤生長、提高模型存活率。同時下調(diào)PTEN可能導(dǎo)致PI3K/AKT的激活并促進(jìn)體外PD-L1的表達(dá)，但體內(nèi)PD-L1表達(dá)呈動態(tài)變化，受多種因素調(diào)節(jié)如IFN-γ等[16]。反過來，PD-1/PD-L1阻斷通過PI3K/Akt/mTOR信號通路挽救了腫瘤中耗盡的CD8+T細(xì)胞。PD-1/PD-L1不僅可作為預(yù)測性生物標(biāo)志物，還可以作為一種有效的治療靶點[17]。以上可看出PI3K- AKT-mTOR通路與PD-1/PD-L1互相作用共同影響腫瘤進(jìn)展。

2.4 NF-κB 核因子κB(NF-κB)是一類具有多向調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，此途徑激活細(xì)胞增殖加快、凋亡被抑制、炎癥因子表達(dá)增加，且能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。PD-L1的表達(dá)能被NF-κB或Toll樣受體(TLR)誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制劑與CTLA-4檢查點抑制療法相結(jié)合，可減少肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等細(xì)胞系的生長，提示NF-κB抑制作用可能起雙重作用：靶向腫瘤細(xì)胞的增殖和存活以及免疫檢查點抑制劑[18]。PD-1抑制劑聯(lián)用基于李斯特菌的HCC疫苗時，腫瘤細(xì)胞局部T細(xì)胞重新活化而恢復(fù)免疫監(jiān)視功能。具體機(jī)制是激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)中的NF-κB途徑，同時募集p62激活自噬途徑，使TAM從M2極化轉(zhuǎn)到M1，這種變化會恢復(fù)T細(xì)胞活性而發(fā)揮PD-1抑制劑的免疫阻斷作用[19]。NF-κB能調(diào)節(jié)TLR誘導(dǎo)的PD-1表達(dá)，抑制NF-κB后，脂多糖對初級巨噬細(xì)胞表面PD-1的誘導(dǎo)被完全阻斷[20]。研究表明PD-1單克隆抗體主要通過CD28共受體發(fā)揮作用，該受體通過NF-κB通路恢復(fù)信號傳導(dǎo)并恢復(fù)T細(xì)胞增殖和活化[21]。以上可知：NF-κB已被證明可調(diào)節(jié)PD-L1。但是，有關(guān)機(jī)制的細(xì)節(jié)還沒有得到很好的證明。

其他信號通路如刺猬(Hh)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在腫瘤增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移方面亦發(fā)揮作用。缺氧誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)并激活Hh信號傳導(dǎo),抑制Hh信號可下調(diào)缺氧條件下腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá),并能增強(qiáng)活化淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用。據(jù)此認(rèn)為Hh信號抑制劑可作為PD-L1抑制劑有效的分子靶向藥物[22]。相反MAPK激活可介導(dǎo)化療藥物相關(guān)的免疫逃逸：紫杉醇通過MAPK途徑上調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)[23]。順鉑通過MAPK / Erk 信號通路誘導(dǎo)肝癌H22細(xì)胞PD-L1過表達(dá)[24]。以上證據(jù)說明：MAPK激活阻礙細(xì)胞死亡，同時上調(diào)PD-L1抑制免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性降低。

3 非編碼RNA調(diào)控PD-1/PD-L1表達(dá)影響肝癌進(jìn)展

3.1 MicroRNA調(diào)控PD-1/PD-L1表達(dá)影響肝癌進(jìn)展 MicroRNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，通過直接結(jié)合信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)(直接作用)或靶向其他參與調(diào)控基因表達(dá)的基因(間接作用)來調(diào)控基因的表達(dá)。近年來證據(jù)表明，miRNA在調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)方面作用巨大[25]。

大多數(shù)miRNA通過直接結(jié)合3'UTR調(diào)節(jié)PD-1/PD-L1表達(dá)：①直接抑制PD-1蛋白表達(dá)：miR-374b可以與PD-1相互作用，并且能影響細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞的腫瘤靶向能力，最終通過體內(nèi)和體外實驗證明：miR-374b通過下調(diào)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞上的PD-1表達(dá)來抑制肝癌的進(jìn)展[26]。miR-570結(jié)合PD-1mRNA的3'UTR直接抑制肝癌HepG2細(xì)胞PD-1的表達(dá)[27]。②抑制PD-L1的轉(zhuǎn)錄和翻譯:最先被發(fā)現(xiàn)的PD-L1調(diào)節(jié)子是miR-513，結(jié)合3'UTR在轉(zhuǎn)錄水平上抑制PD-L1表達(dá)。miR-513的強(qiáng)制表達(dá)抑制IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)[28]。③直接降低肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平：miR-200家族是一類與腫瘤生存進(jìn)展有關(guān)的microRNA，有5種類型：miR-200a/bc、miR-429及miR-141。研究人肝癌組織標(biāo)本時得出miR-200家族與PD-L1負(fù)相關(guān)；細(xì)胞實驗證明肝癌miR-200直接靶向PD-L1產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)，且肝癌細(xì)胞的增殖被明顯抑制[29]。miR-200c能阻斷PD-L1誘導(dǎo)的T細(xì)胞衰竭，并逆轉(zhuǎn)抗病毒CD8+T細(xì)胞衰竭[30]。表明miR-200家族可能在肝癌患者免疫檢查點抑制劑治療中起作用，對于HCC臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。

miRNAs還可以通過上下游途徑間接對PD-1/PD-L1發(fā)揮調(diào)控作用。miR-23a-3p(來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的HCC的外泌體)，通過PTEN / AKT通路上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)[31]。

以上是不同種類的miRNA作為抑癌基因下調(diào)PD-1/PD-L1，作為促癌基因的miRNA可上調(diào)其表達(dá)。miR-802已被證實在HCC患者的腫瘤組織中上調(diào)。miR-802通過轉(zhuǎn)錄后抑制DNA損傷反應(yīng)1((REDD1))參與T細(xì)胞衰竭，miR-802上調(diào)了PD-1的表達(dá)[32]，反之，PD-1/PD-L1影響microRNA的表達(dá)。研究中發(fā)現(xiàn)PD-1敲除小鼠，抗原引發(fā)的PD-1敲除細(xì)胞在T細(xì)胞受體(TCR)識別后上調(diào)miR-21的表達(dá)(11倍以上)，證實了PD-1是miR-21的負(fù)調(diào)節(jié)劑[33]。

3.2 lncRNA調(diào)控PD-1/PD-L1表達(dá)影響肝癌進(jìn)展 長鏈非編碼RNA(lncRNA)：一類長度大于200 nt的非編碼RNA，已成為多種疾病(包括腫瘤)基因表達(dá)的重要調(diào)控子。各種HCC相關(guān)的lncRNA已顯示出異常表達(dá)，并通過與DNA，RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合或編碼小肽而參與癌性表型(例如持續(xù)增殖，逃避凋亡，加速血管形成和侵襲能力的獲得)。諸多研究證明：lncRNA表觀遺傳地調(diào)控PD-1/PD-L1表達(dá)。

lncRNA可能通過調(diào)控PD-L1的表達(dá)來協(xié)調(diào)HCC中的免疫抑制。研究所得：lncRNA PCED1B-AS1通過海綿化hsa-mir-194-5p增強(qiáng)HCC中PD-L1和PD-L2的表達(dá)，以及PCED1B-AS1誘導(dǎo)的PD-L1介導(dǎo)的共培養(yǎng)T細(xì)胞免疫抑制。此外，肝癌細(xì)胞釋放含有外泌體的 PCED1B-AS1，它能調(diào)節(jié)自身PD-L1表達(dá)，同時抑制效應(yīng)性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌免疫抑制。最后，體內(nèi)和體外實驗均證明lncRNA PCED1B-AS1促進(jìn)了腫瘤的侵襲行為[34]。LncRNA MIAT(心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本)可能是一種致癌基因，能促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖及侵襲，MIAT敲除后HCC增殖活性降低。MIAT不僅與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞如CD4+T、細(xì)胞CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)，而且與免疫抑制分子如PD-1、PD-L1、CTLA4表達(dá)呈正相關(guān)[35]。肝細(xì)胞癌中長鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(LncRNA MALAT-1)敲低會導(dǎo)致PD-L1轉(zhuǎn)錄因子的下調(diào)，另外敲除長鏈非編碼核糖核酸-X(XIST)后，PD-L1顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為有助于闡明腫瘤抑制物miR-194-5p增強(qiáng)PD-L1表達(dá)，PD-L1可以被XIST和MALAT-1介導(dǎo)。然而，盡管miR-155-5p過表達(dá)時MALAT-1下調(diào)，但PD-L1表達(dá)高度豐富，因此MALAT-1在肝癌中PD-L1轉(zhuǎn)錄物升高中的作用仍存在疑問[36]。

3.3 circRNA調(diào)控PD-1/PD-L1表達(dá)影響肝癌進(jìn)展 環(huán)狀RNA(circRNA)是一類功能性非編碼RNA，通過介導(dǎo)RNA的可變性剪接(AS)，轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)節(jié)以及充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA來調(diào)節(jié)生物過程。許多circRNA在腫瘤的形成、進(jìn)展、復(fù)發(fā)和耐藥性方面意義重大，近年來，CircRNA介導(dǎo)的PD-1表達(dá)對肝癌免疫狀態(tài)的影響倍受關(guān)注。

circMET是一種癌基因，可通過Snail(鋅指轉(zhuǎn)錄因子)/DPP4(二肽基肽4)/CXCL10(CXC趨化因子配體10)軸驅(qū)動HCC的免疫抑制和抗PD-1治療耐藥性。而且，DPP4抑制劑西他列汀可顯著改善circMET和Snail含量高的荷瘤小鼠的PD-1抗腫瘤免疫作用[37]。環(huán)狀RNA環(huán)指域1(circUHRF1)主要由HCC細(xì)胞分泌，并通過誘導(dǎo)HCC中的NK細(xì)胞功能障礙而促進(jìn)免疫抑制。CircUHRF1可能驅(qū)動PD-1抑制劑免疫治療的耐藥性，這無疑為HCC患者的治療提供潛在的治療策略[38]。以上為circ-RNA作為促癌基因?qū)D-1/PD-L1的影響研究，某種抑癌基因的circ-RNA對肝癌免疫狀態(tài)的影響需要進(jìn)一步挖掘。

4 小結(jié)

本文綜述了PD-1/PD-L1在HCC進(jìn)展中發(fā)揮舉足輕重的作用，探討了WNT-β-catenin、JAK/STAT、PI3K/AKT、NF-κB等信號通路以及microRNA、lncRNA、circ-RNA如何影響PD-1/PD-L1表達(dá)而影響HCC進(jìn)展。PD-1/PD-L1免疫抑制劑治療是肝癌診治的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，對其上游調(diào)節(jié)劑的識別可以拓寬我們對開發(fā)新型抗腫瘤藥物用于癌癥免疫治療的理解。為了進(jìn)一步提高免疫治療的精準(zhǔn)性，尋找那些既能控制PD-1/PD-L1表達(dá)又能控制細(xì)胞增殖的分子來提高HCC的臨床療效，需要我們對于影響其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳因子及某些信號蛋白進(jìn)行深入探索，做到多方面、多途徑綜合治療，提高HCC患者生存率。