馮苗苗

上海中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心 (上海 浦東， 201203)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在全球的患病率達(dá)25%以上[1]，與肥胖、糖尿病、高脂血癥、代謝綜合征密切相關(guān)[2-5]，是代謝綜合征(MS)的主要組成部分，是MS在肝臟中的表現(xiàn)[6]。NAFLD的進(jìn)展形式，尤其是炎癥和纖維化與動脈粥樣硬化等心血管疾病密切相關(guān)[7-9]。

NAFLD發(fā)病機(jī)制多與肝臟內(nèi)部脂質(zhì)聚積、氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝異常等因素有關(guān)[10]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腸道黏膜通透性降低，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)及肝臟代謝功能異常所產(chǎn)生的內(nèi)源性毒素是NAFLD的主要病因[11]。多種代謝危險因素也會增加NAFLD的風(fēng)險[12]。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中沒有脂肪肝病名，中醫(yī)學(xué)中“肝脹” “肝癖” “痰飲” “脅痛”與NAFLD的病位以及主要癥狀相似。NAFLD雖然病在肝，但與脾、胃、腎關(guān)系密切，認(rèn)為NAFLD的病因病機(jī)以飲食不節(jié)，脾失運化；情志失調(diào)，肝郁氣滯；他病遷延，痰濕瘀結(jié)以及臟腑虛衰，脾腎內(nèi)虛為主。根據(jù)中醫(yī)治療原則，許多古代文獻(xiàn)和現(xiàn)代研究都報道了中醫(yī)藥治療NAFLD[13-16]。

肝臟是機(jī)體代謝的樞紐，三大代謝糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸都在肝臟進(jìn)行，肝臟承擔(dān)了大部分的合成、分解、轉(zhuǎn)化和排泄等代謝過程，從代謝角度對肝臟疾病進(jìn)行系統(tǒng)研究非常重要。代謝組學(xué)屬于系統(tǒng)生物學(xué)和組學(xué)，是中醫(yī)藥研究的重要工具，是尋找功能性小分子以評估中藥作用的一種新方法[17-19]。本文基于近年代謝組學(xué)在中醫(yī)藥治療NAFLD中的應(yīng)用做一綜述，為中醫(yī)藥治療NAFLD提供更多依據(jù)。

1 代謝組學(xué)在疾病診斷中的應(yīng)用

代謝組學(xué)已成為許多疾病生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)的工具，代謝組學(xué)技術(shù)通過分析內(nèi)源性代謝物的組成和變化，解釋疾病的發(fā)病機(jī)制，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與代謝性疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。Li等運用非靶向代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)六種代謝物：棕櫚酸、亞油酸、4-吡哆酸、磷脂酰甘油(20∶3/2∶0) 、肉堿(14∶1)和β石膽酸與冠心病有很強的相關(guān)性[20]。Li等人運用非靶向代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)五種代謝物(1-萘酚、2-萘酚、甲基衣康酸酯、NAcetyl-D-氨基葡萄糖 6-磷酸和 L-肉堿)有助于將冠心病患者與健康對照分開，這五種代謝物中的兩種代謝物被鑒定為用于冠心病診斷的潛在血漿生物標(biāo)志物[21]。Luo等研究發(fā)現(xiàn)苯丙氨酰色氨酸和甘膽酸鹽在區(qū)分肝癌和肝硬化具有比甲胎蛋白更好的診斷性能[22]。Li J等運用代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)酪氨酸和谷氨酰胺—亮氨酸可作為早期結(jié)直腸癌的臨床診斷生物標(biāo)志物[23]。一項芬蘭的研究[24]發(fā)現(xiàn)代謝物：肌酸、1-棕櫚酰甘油酯(16∶1)、脲酸鹽、2-聚羥基丁酸酯/2-乳酸乙酯、黃嘌呤、黃尿酸、3-(4-羥基苯基)乳酸、1-油酸甘油酯(18∶1)、1-肉豆蔻酰甘油(14∶0)、2-甲基甘氨酸(水楊酸鹽)與糖尿病的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。

韓國的一項隊列研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)整其他風(fēng)險因素后肥胖人群中的代謝物精氨、烷基酰磷脂酰膽堿(C34：3，C36：3，C42：1)、羥基鞘磷脂(C22：2，C14：1)、鞘磷脂(C16：0)，這五種物質(zhì)中除了羥基鞘磷脂(C14：1)和鞘磷脂(C16：0)與瘦型糖尿病發(fā)病風(fēng)險明顯相關(guān)[25]。

Sun等[26]對T2DM生物標(biāo)志物進(jìn)行Meta分析，識別出與T2DM相關(guān)的幾種代謝物，包括氨基酸、脂類、?；鈮A和碳水化合物[27]。Guo等[28]結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)研究表明黃芪-薯蕷藥通過調(diào)節(jié)單胺氧化酶 B(MAOB) 、乙酰輔酶A羧化酶1(ACACA) 、碳酸酐酶2(CA2) 和過氧化氫酶(CAT) 具有降血糖作用。張志軍等[29]應(yīng)用代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)與T2DM相關(guān)的代謝物包括乙酸、乳酸、?；撬岬龋贸鎏谴x紊亂、氧化應(yīng)激、氨基酸及脂類代謝異常、維生素缺乏在T2DM及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

Satish C Kalhan[30]等對NASH患者的空腹?fàn)顟B(tài)血漿進(jìn)行了代謝組研究，發(fā)現(xiàn)NASH患者中循環(huán)支鏈氨基酸、苯丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸水平高于健康人。Lake AD等進(jìn)一步證實了NASH中循環(huán)支鏈氨基酸是增加的，研究發(fā)現(xiàn)在脂肪變性向脂肪性肝炎轉(zhuǎn)變過程中支鏈氨基酸、酪氨酸和苯丙氨酸水平明顯增加[31]。齊素文等運用代謝組學(xué)方法鑒定出焦谷氨酸可作為NASH的生物診斷標(biāo)志物[32]，來自于上海曙光醫(yī)院的小樣本尿液代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NASH患者中焦谷氨酸的含量高于NAFLD患者[33]。樓燕紅[34]運用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，選取了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及非酒精性脂肪肝(NAFL)患者各30例，發(fā)現(xiàn)兩者血液中共有30種差異代謝物，最終選出Leu、Ala、Asp、Glu、Orn 5種潛在代謝標(biāo)志物，具有良好的早期診斷價值。劉曉琳等[35]通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)硬脂酰肉毒堿在NAFLD的不同表型中都穩(wěn)定升高，為臨床提供一個診斷NAFLD的敏感生物標(biāo)記物。Li等[36]采用膽堿和蛋氨酸缺乏飼料，誘導(dǎo)NAFLD模型，取血清樣本分析，選擇血糖、谷氨酸/谷氨酰胺、牛磺酸、乳酸作為脂肪肝的生物標(biāo)志物。

2 代謝組學(xué)與中醫(yī)證候研究

如何實現(xiàn)中醫(yī)證候的客觀化和規(guī)范化，已成為中醫(yī)藥推廣應(yīng)用中的一個重要問題。代謝組學(xué)所體現(xiàn)的整體性和動態(tài)性，與中醫(yī)的整體觀念和證候理論相一致。在證候發(fā)生的過程中，機(jī)體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的種類、濃度和相對比例均發(fā)生變化，所以小分子代謝產(chǎn)物的變化可以通過證候變化體現(xiàn)出來。而這些代謝成分可以分泌到血液和尿液中，通過檢測不同證候的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步探索證候的本質(zhì)。通過代謝組學(xué)技術(shù)，來確定“中醫(yī)證候相關(guān)代謝譜”，這已成為探索中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)的有效途徑。

近年來有不少醫(yī)家進(jìn)行了代謝組學(xué)與疾病證候的相關(guān)研究，董姝[37]研究發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛患者尿代謝組學(xué)里的核酸、糖、氨基酸、脂肪和維生素等代謝物的含量與正常人有差異。此外，核酸和維生素代謝過程中次黃嘌呤和乳清酸含量的變化最為顯著。楊宇峰等[38]研究發(fā)現(xiàn)，氣滯濕阻證代謝綜合征的發(fā)生與糖類、脂類以及蛋白質(zhì)的代謝紊亂有關(guān)，這些內(nèi)源性代謝物可作為代謝綜合征中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)。馬欣等[39]發(fā)現(xiàn)NAFLD患者中，濕熱內(nèi)蘊和肝郁脾虛兩種證型的患者在血清代謝組學(xué)研究PLS-DA評分圖上表現(xiàn)出顯著的代謝差異，并且發(fā)現(xiàn)糖類、脂類、氨基酸類、胺類化合物類等11種明顯的差異代謝物。以此總結(jié)出，NAFLD的不同證候有其特定的生物學(xué)基礎(chǔ)。Dai等[40]運用代謝組學(xué)方法研究濕熱型NAFLD和慢性乙型肝炎兩種疾病患者的血液和尿液代謝物的異同發(fā)現(xiàn)兩種疾病間發(fā)病的分子機(jī)制存在共性；并且發(fā)現(xiàn)濕熱型與非濕熱型NAFLD患者的代謝物譜有差異，可區(qū)分不同證型NAFLD。研究提示，濕熱型NAFLD和慢性乙型肝炎患者的血清及尿的代謝物譜中硫胺、氮、氰基氨基酸和丁酸甲酯等物質(zhì)的代謝受到抑制，代謝物水平均下調(diào)。通過該項研究不僅揭示了兩種疾病的相似性，且與“異病同治”吻合。提示可通過監(jiān)測具有相同證候的兩種或兩種以上不同疾病的相同代謝物質(zhì)，找到潛在的證候標(biāo)志物。黎曉[41]運用代謝組學(xué)方法分析了濕熱蘊結(jié)型、肝郁脾虛型、瘀血阻絡(luò)型慢性乙型肝炎患者血清代謝譜，篩出184個代謝物及88個臨床指標(biāo)，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)ALT、總膽紅素、SM(33∶1)在濕熱蘊結(jié)型、肝郁脾虛型慢性乙型肝炎中存在差異。從分子生物學(xué)篩選出可用于慢性乙型肝炎中醫(yī)辨證分型的代謝物，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的多元統(tǒng)計方法篩選出鑒別慢性乙型肝炎3組中醫(yī)辨證分型的差異代謝物，為慢性乙型肝炎的中醫(yī)辨證分型提供思路。NAFLD[42]典型濕熱內(nèi)蘊證和肝郁脾虛證在代謝層面存在顯著的差異，濕熱內(nèi)蘊證與肝郁脾虛證間差異代謝物主要涉及糖類代謝物、脂類代謝物、氨基酸代謝物、組胺、維生素代謝物共5類通路；郭孜等[43]基于GC/MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法，測定乙型肝炎肝硬化不同證候(濕熱內(nèi)蘊證、肝腎陰虛證、脾虛濕盛證、血瘀證)患者及健康者的尿液代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組間差異明顯，各組的共同差異性尿代謝物為甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、檸檬酸、琥珀酸等與能量代謝和氨基酸代謝等通路密切相關(guān)的代謝物。其中在濕熱內(nèi)蘊證與肝腎陰虛證之間存在支鏈氨基酸的差異，濕熱內(nèi)蘊證患者與健康者相比，亮氨酸和纈氨酸呈升高趨勢，而肝腎陰虛證患者無明顯升高。研究表明，乙型肝炎肝硬化患者不同證候間可能具有不同的代謝模式，而亮氨酸和纈氨酸可能作為臨床上用來區(qū)分濕熱內(nèi)蘊證和肝腎陰虛證的潛在指標(biāo)之一。范昕建[44]等采用 GC/MS技術(shù)對慢性乙型肝炎的肝郁脾虛證、脾胃濕熱證患者及健康人的血清進(jìn)行代謝組學(xué)測試分析，研究發(fā)現(xiàn)區(qū)分兩種證型的關(guān)鍵代謝物為甾體代謝相關(guān)氨基酸，如tyrosine和Phenylalanine，以及糖酵解相關(guān)代謝物Pyruvate、Lactate、脂類等。與脾胃濕熱型證相比較，肝郁脾虛證患者甾體相關(guān)的代謝體現(xiàn)出甾體代謝通路下調(diào)、糖酵解通路下調(diào)，而脂類代謝上調(diào)的特征。

證候辨別可通過對比NAFLD各個證候血液及尿液內(nèi)的小分子代謝物質(zhì)，經(jīng)過模式識別分析，觀察各個證候之間的代謝產(chǎn)物的不同，包括種類及濃度，作為區(qū)分中醫(yī)證候的依據(jù)。通過研究不同證候間代謝產(chǎn)物，可以理清各個證候間的關(guān)系，可作為NAFLD既病防變的代謝依據(jù)。

3 代謝組學(xué)應(yīng)用于中藥治療NAFLD

NAFLD代謝組學(xué)的研究，除了用于疾病的早期診斷、早期治療、中醫(yī)證候研究外，還可以研究中藥及復(fù)方提取物治療NAFLD。目前，從代謝組學(xué)角度研究單味藥或復(fù)方藥治療NAFLD并不多，對有效成分的研究更少。代謝組學(xué)技術(shù)是探索藥物治療疾病機(jī)制的重要手段。中藥往往因其多效和多靶點的作用模式，對其與人體的具體作用機(jī)制難以闡明。臨床代謝組學(xué)可通過比較在藥物治療前后患者體內(nèi)生物標(biāo)志物的變化，從而評估藥物的治療效果。中藥因其多靶點且不良反應(yīng)相對較小的特點，與西藥治療相比具有一定的優(yōu)勢[45]。

因此，運用代謝組學(xué)方法評估單味中藥或方劑的治療效果可為其作用機(jī)制的研究提供新思路。Liu X等[46]應(yīng)用代謝組學(xué)對抑郁癥患者和對照組的血漿樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)逍遙散可顯著逆轉(zhuǎn)抑郁癥生物標(biāo)志物的水平。隨后研究者確定了逍遙散發(fā)揮抗抑郁作用的四條代謝通路，明確了逍遙散治療抑郁癥的干預(yù)機(jī)制。

Dong Y等[47]為明確中藥桑黃的保肝機(jī)制，運用血清UPLC-Q/TOF-MS代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)桑黃主要通過影響FXR/RXR激活途徑參與調(diào)節(jié)包括不飽和脂肪酸生物合成在內(nèi)的5個肝損傷病理過程，從而闡明桑黃的肝保護(hù)作用和潛在靶標(biāo)。謝慧臣等[48]應(yīng)用代謝組學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)延齡草能明顯降低NAFLD模型大鼠尿液中的蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸等6種代謝物的含量，升高丁酸、棕櫚酸、花生四烯酸和十六碳烯酸的含量，提示延齡草提取物干預(yù)NAFLD的作用機(jī)制可能是調(diào)節(jié)肝細(xì)胞能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，并由此導(dǎo)致的肝臟代謝物酶譜的變化。劉泰驛等的研究結(jié)果表明苦蕎蛋白緩解脂肪肝的的作用機(jī)理與亞油酸代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝、糖代謝6條代謝通路相關(guān)[49]。張艷等研究發(fā)現(xiàn)銀耳多糖[50]改善NAFLD主要涉及的代謝通路有酮體的合成和代謝、乙醛和二羧酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、TCA 循環(huán)和丁酸代謝。有研究[51]用 GC-MS 發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草可以通過調(diào)節(jié)碳水化合物代謝、脂代謝以及氨基酸代謝等代謝通路對肝損傷進(jìn)行干預(yù)與調(diào)節(jié)。茵陳蒿湯[52]可改善NAFLD涉及到最強的3個代謝通路分別為甘油磷脂代謝、嘌呤代謝和谷胱甘肽代謝。NASH、NAFL和NAFL+T2DM都出現(xiàn)了脂質(zhì)和脂肪酸的代謝紊亂，硬脂酰肉毒堿在NAFLD的不同表型中都穩(wěn)定升高，可以為臨床提供一個更敏感的NAFLD診斷標(biāo)記物[53]。蘇趙威等[54]用GC-MS法研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸芍藥散加味可能是通過調(diào)控代謝紊亂的機(jī)制對NAFLD起到治療作用。Chao J等[55]釆用代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)沒食子酸的肝保護(hù)作用部分是通過逆轉(zhuǎn)高脂飲食導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝(糖酵解和糖異生)、氨基酸代謝和膽堿代謝等的紊亂而發(fā)生的。Gou XJ等[56]采用GC-MS方法研究祛瘀化濁方對高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝具有顯著的保護(hù)作用，這可能歸因于調(diào)節(jié)P-丙氨酸、丙氨酸、丙酮酸、甘氨酸代謝、天冬氨酸和谷氨酸代謝、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及改善三羧酸循環(huán)的功能障礙。劉霞飛等[57]采用UPLC-MS法探討正柴胡飲的肝損傷保護(hù)作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)正柴胡飲可調(diào)節(jié)由對乙酰氨基酚引起的內(nèi)源性代謝物的變化從而對其所致的藥源性肝損傷具有保護(hù)作用，代謝組學(xué)方法能夠靈敏、準(zhǔn)確地預(yù)測肝損傷的發(fā)生、發(fā)展，為臨床合理用藥及闡明藥物保護(hù)作用機(jī)制提供了依據(jù)。Yang H等[58]采用代謝組學(xué)方法研究表明逆轉(zhuǎn)脂肪酸代謝途徑是甘草次酸保護(hù)對乙酰氨基酚肝毒性的重要機(jī)制。Gao D等人[59]采用UPLC-MS的方法研究土茯苓主要通過調(diào)節(jié)精氨酸和脯氨酸代謝、膽汁酸生物合成和鞘脂代謝三種代謝途徑發(fā)揮保肝作用。Song YN等[60]基于GC-MS方法研究絞股藍(lán)總皂苷可能通過調(diào)節(jié)糖酵解以及抑制脂質(zhì)過氧化從而保護(hù)肝纖維化。Hongyang Z等[61]釆用UPLC-TOF-MS法研究茵陳蒿湯的抗纖維化作用可能是由于抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化所致。研究[62]參苓白術(shù)散可能是通過干預(yù)肝臟脂代謝、糖代謝和氨基酸代謝途徑改善肝臟脂質(zhì)沉積狀態(tài)，從而為臨床治療NAFLD提供了較好指導(dǎo)意義。

4 展望

綜上研究，代謝組學(xué)正處于快速發(fā)展階段，日益成為研究熱點。代謝組學(xué)技術(shù)主要用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。肝臟疾病的代謝組學(xué)研究是學(xué)術(shù)界的熱點之一，隨著肝臟疾病的代謝組學(xué)研究進(jìn)展，我們可以更多的發(fā)現(xiàn)對肝臟疾病具有診斷意義的特異性標(biāo)志物。中藥通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、腸道微生物代謝和能量代謝，發(fā)揮對脂肪肝的干預(yù)作用。利用代謝組學(xué)技術(shù)可識別脂肪肝的早期生物標(biāo)志物，探索其發(fā)病機(jī)制，對脂肪肝的診斷及治療具有一定的參考意義。近來，代謝物變化與腸道菌群的研究已成為代謝組學(xué)的一個新方向，后續(xù)研究可將代謝組學(xué)與其它學(xué)科結(jié)合，深入探索脂肪肝的發(fā)病機(jī)制。中醫(yī)是國粹，應(yīng)發(fā)揚光大。系統(tǒng)生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，為多學(xué)科、多視角認(rèn)識中醫(yī)藥治療疾病機(jī)制提供技術(shù)條件。代謝組學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)的結(jié)合可以加快中醫(yī)藥研究的進(jìn)程，并將成為中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的一項重要技術(shù)。未來，代謝組學(xué)有望成為發(fā)現(xiàn)中藥活性成分和闡明其機(jī)制的工具。通過代謝組學(xué)對中藥治療疾病機(jī)理研究，對臨床應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。