焦國(guó)慶，李明秋，吳 瑩，王如興，胡亞玲，紀(jì) 麗，LU Tong

1無(wú)錫市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，2南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院心臟外科，江蘇 無(wú)錫 214023；3Mayo Clinic細(xì)胞電生理研究室，美國(guó) 明尼蘇達(dá)州羅切斯特 55905

糖尿病嚴(yán)重危害人類健康，往往合并心、腦、腎、視網(wǎng)膜等臟器和組織的并發(fā)癥，其中以冠狀動(dòng)脈病變尤為嚴(yán)重，可導(dǎo)致心肌梗死、惡性心律失常和心臟猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥，已成為我國(guó)急性心肌梗死的最主要危險(xiǎn)因素之一［1］。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BK通道）廣泛分布于冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上，由4個(gè)α亞基和4個(gè)β亞基組成，其中α亞基形成BK通道的孔區(qū)，β亞基為輔助亞基，對(duì)BK 通道動(dòng)力學(xué)起重要調(diào)節(jié)作用。在血管平滑肌細(xì)胞上，主要為β1 亞基，參與血管張力調(diào)節(jié)，對(duì)冠狀動(dòng)脈血管舒張收縮功能起重要調(diào)節(jié)作用［2-3］。高血糖可上調(diào)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的水平，SOD 抑制過(guò)氧化氫酶表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）顯著增加，糖尿病患者體內(nèi)ROS 增高是糖尿病患者的普遍特征。ROS 是BK 通道的強(qiáng)力抑制劑，使BK通道的生理功能障礙，本課題組以前的研究證實(shí)，在糖尿病合并冠心病患者的冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中BK?β1降低，BK通道功能障礙［4］。最近的研究表明，細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）可能參與BK 通道的調(diào)節(jié)，并可能與E3泛素連接酶引起的BK?β1 的分解代謝加快，BK?β1降低有關(guān)［5-6］。

DNA 依賴的蛋白激酶催化亞單位（DNA?Pkcs）屬于磷脂酰肌醇?3?激酶（PI3K）超家族，與蛋白激酶B（Akt）的473 絲氨酸（S473）的磷酸化（p?Akt）有關(guān)［7］。以前的研究表明，ROS 能激活細(xì)胞內(nèi)DNA?Pkcs 和PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞凋亡［8-9］。本研究探討糖尿病中PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路是否參與冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中BK?β1的調(diào)節(jié)。

1 材料和方法

1.1 材料

人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human coronary ar?tery smooth muscle cell，HCASMC，中科院上海細(xì)胞研究所），HCASMC 培養(yǎng)基SMBM（Lonza Walkers?ville 公司，美國(guó)），ROS 檢測(cè)試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、PI3K 抑制劑Wortmannin（上海碧云天公司），ROS 抑制劑GKT137831（SELLECK 公司，美國(guó)）。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（Sigma公司，美國(guó)）?？笲K?a抗體（Alomona公司，以色列），抗BK?β 1 抗體（Abcam 公司，美國(guó)），DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）（Santa Cruz 公司，美國(guó)）。SPF 級(jí)Spraque Dawley 8～12周齡的雄性大鼠30只（江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所動(dòng)物中心），體質(zhì)量（200±30）g。本研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和喂養(yǎng)遵循ARVO聲明。

1.2 方法

1.2.1 HCASMC的處理

HCASMC 培養(yǎng)于SMBM 培養(yǎng)基，正常糖濃度培養(yǎng)基及高糖濃度培養(yǎng)基葡萄糖濃度分別為5 mmon/L及15 mmon/L。PI3K抑制劑Wortmannin處理組以不含血清的SMBM培養(yǎng)基加入Wortmannin（100 nmon/L）預(yù)處理細(xì)胞30 min，再以高糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h（n=3），對(duì)照組以終濃度0.1%（w/w）的二甲基亞砜（DMSO）的無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞30 min，再以高糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h（n=3）。ROS抑制劑GKT137831處理組以GKT137831（20 μmon/L）加入高糖濃度培養(yǎng)的HCASMC 作用48 h（n=3），對(duì)照組以終濃度0.1%（w/w）的二甲基亞砜（DMSO）作用于高糖濃度培養(yǎng)的人平滑肌細(xì)胞（n=3）。用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞3 次，加入RIPA 裂解液，在冰上充分裂解，離心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2 糖尿病大鼠動(dòng)物模型的建立及處理

20 只大鼠采用STZ 60 mg/kg 腹腔內(nèi)注射，2 周后測(cè)定大鼠血糖濃度，如血糖濃度低于300 mg/dL，則用等劑量STZ 再次腹腔內(nèi)注射，持續(xù)8 周血糖濃度高于300 mg/dL 診斷為糖尿病。10 只大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水作為正常對(duì)照組（Nor，n=10）。20只糖尿病大鼠中，10 只以GKT137831［40 mg/（kg·d）］灌胃2周（DM+GKT，n=10），10只糖尿病大鼠灌胃相同數(shù)量的飲用水2 周（DM，n=10），處死大鼠。分離正常大鼠、糖尿病大鼠及經(jīng)GKT137831灌胃的糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈，冠狀動(dòng)脈分離方法在課題組相關(guān)文獻(xiàn)中已有詳述［6］。簡(jiǎn)言之，處死的大鼠酒精消毒后，切開(kāi)大鼠胸腔，將大鼠心臟連同出入心臟的大血管切下，將切下的心血管組織浸入冰冷的緩沖液中（NaCl 145 mmol/L、KCl 4.0 mmol/L、CaCl20.05 mmol/L、MgCl21.0 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，pH7.20），在外科手術(shù)顯微鏡下使用顯微手術(shù)器械，自大鼠主動(dòng)脈根部冠狀動(dòng)脈起始部，沿左側(cè)及右側(cè)冠狀動(dòng)脈走行途徑，細(xì)微分離右冠狀動(dòng)脈及左冠狀動(dòng)脈。冠狀動(dòng)脈血管組織用液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。將?dòng)脈組織勻漿化，收集總蛋白。

1.2.3 HCASMC及糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈中ROS檢測(cè)

用細(xì)胞滲透熒光探針DCFHDA檢測(cè)人HCASMC及糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈中的ROS 及GKT137831 對(duì)ROS的影響。HCASMC 在5 mmon/L糖濃度（NG組，n=3）、15 mmon/L糖濃度（HG組，n=3）、15 mmon/L糖濃度+GKT137831（HG+GKT組，n=3）孵育48 h后，用PBS洗滌2次，然后加入DCFHDA 10 μL和90 μL無(wú)血清SMBM 培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)30 min，孵育后用PBS洗滌2 次，熒光顯微鏡480～525 nm檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度?？焖俦鶅龅拇笫蠊跔顒?dòng)脈血管環(huán)被切割成30 μm厚的切片，并放置在玻璃玻片上（DM，n=3；DM+GKT，n=3）。DCFH?DA（25 μmon/L）應(yīng)用于組織切片，37 ℃避光孵育30 min，熒光顯微鏡480～525 nm 檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度，將使用Scion Image軟件對(duì)DCF信號(hào)進(jìn)行進(jìn)一步的密度分析。

1.2.4 采用蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)HCASMC及大鼠冠狀動(dòng)脈BK?a亞基、BK?β1亞基、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）表達(dá)

等量蛋白分別行8%～12%丙烯酰胺凝膠電泳，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃封閉過(guò)夜，洗膜，HRP標(biāo)記二抗室溫封閉2 h。洗膜后再用GAPDH抗血清封閉，ECL試劑盒發(fā)光，吸光度分析法定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用t檢驗(yàn)對(duì)正常組和糖尿病組BK?a、BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）蛋白表達(dá)進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同糖濃度下HCASMC中BK?α、BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt的表達(dá)

與5 mmol/L 葡萄糖濃度下的HCASMC 比較，15 mmol/L葡萄糖濃度下HCASMC中BK?α表達(dá)無(wú)明顯變化，BK?β1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），DNA?Pkcs、Akt、p?Akt的表達(dá)增高（P＜0.05，圖1）。

圖1 Western blot檢測(cè)不同葡萄糖濃度下HCASMC中BK?α、BK?β1、DNA?PKcs、Akt、p?Akt（S473）的表達(dá)Figure 1 Expression of BK?α，BK?β1，DNA?PKcs，Akt and p?Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells in different glucose concentrations by Western blot

2.2 Wortmannin 處 理HCASMC 后BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt的表達(dá)

HCASMC 以Wortmannin（100 nmol/L）預(yù) 處理30 min后，在15 mmol/L葡萄糖濃度的SMBM中培養(yǎng)48 h 并和對(duì)照組相比較，Wortmannin 處理組，DNA?Pkcs、Akt 的表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），p?Akt 蛋白表達(dá)量明顯降低，BK?β1 的表達(dá)量明顯增高（P＜0.05，圖2）。

圖2 Western blot檢測(cè)Wortmannin作用于HCASMC后BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）的表達(dá)Figure 2 Expression of BK?β1，DNA?Pkcs，Akt and p?Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells treated with Wortmannin by Western blot

2.3 GKT137831作用于15mmol/L糖濃度下的HCASMC48 h后BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt的表達(dá)

與15mmol/L糖濃度下的HCASMC比較，15mmol/L糖濃度下HCASMC經(jīng)GKT137831處理48 h后，DNA?Pkcs、Akt、p?Akt蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），BK?β1表達(dá)量增高（P＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)GKT137831作用HCASMC 48 h后BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt的表達(dá)Figure 3 Expression of BK?β1，DNA?Pkcs，Akt and p?Akt（S473）of human coronary artery smooth mus?cle cells after treated with ROS inhibitor GKT137831 for 48 h by Western blot

2.4 GKT137831 對(duì)HCASMC及大鼠冠狀動(dòng)脈中ROS的影響

DCFH?DA 進(jìn)入細(xì)胞，容易被細(xì)胞內(nèi)酯水解將ES 轉(zhuǎn)化為非熒光形式的DCFH，在多種ROS 存在下迅速轉(zhuǎn)化為熒光DCF。15 mmol/L 葡萄糖濃度下的HCASMC 中ROS 明顯高于5 mmol/L 葡萄糖濃度（P＜0.05）。經(jīng)GKT137831處理48 h后，和15 mmol/L葡萄糖濃度組相比，GKT137831 處理后的HCASMC中ROS 含量降低約40%（P＜0.05）。STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠經(jīng)GKT137831 灌胃2 周后，冠狀動(dòng)脈中ROS 含量較未經(jīng)GKT137831 處理組降低40%（P＜0.05，圖4）。

圖4 GKT137831 對(duì)HCASMC 及糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈ROS的影響Figure 4 ROS Expression of human coronary artery smooth muscle cells and coronary artery from STZ induced diabetic rats treated with GKT137831

2.5 大鼠冠狀動(dòng)脈BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt的表達(dá)

和正常大鼠相比較，STZ 糖尿病模型大鼠冠狀動(dòng)脈DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）表達(dá)量分別增加約50%、30%、30%（P＜0.05），BK?β1 表達(dá)量降低約45%（P＜0.05）；和糖尿病大鼠相比較，GKT137831喂飼2周后的糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）、BK?β1表達(dá)量明顯增高接近于正常大鼠水平（P＜0.05，圖5）。

圖5 Western blot 檢測(cè)GKT137831 對(duì)糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈的BK?β1、DNA?Pkcs、Akt、p?Akt（S473）的影響Figure 5 Expression of BK?β1，DNA?Pkcs，Akt and p?Akt（S473）of coronary artery from STZ induced di?abetic rats treated with GKT137831 by West?ern blot

3 討論

BK通道是大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的一種，廣泛存在于人體的組織細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中，BK通道調(diào)節(jié)著血管張力，與血管的血流有關(guān)。BK通道電流約占冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞總鉀離子電流的65%，是冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上最主要的鉀通道，在糖尿病等疾病狀態(tài)下，冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK 通道開(kāi)放減少，電流密度降低，蛋白表達(dá)減弱，BK通道功能障礙，可能是冠狀動(dòng)脈功能受損的最主要原因［10］，因此，積極尋求糖尿病狀態(tài)下BK 通道蛋白表達(dá)減少及功能障礙的原因，對(duì)糖尿病狀態(tài)下冠狀動(dòng)脈疾病的防治，具有重大臨床意義。

高糖狀態(tài)可上調(diào)SOD 的水平，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加。超氧陰離子自由基和NO反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化亞硝基（OONO-）可抑制大鼠大腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞膜上的BK通道［11］。本課題組以前的研究證實(shí)，高糖（22 mmol/L）狀態(tài)下，轉(zhuǎn)染表達(dá)鈣激活鉀離子通道（hSlo）的HEK293 細(xì)胞及HCASMC 中，BK 通道電流密度下降，通道激活和失活動(dòng)力學(xué)減慢。ROS 是BK 通道的強(qiáng)力抑制劑，使BK 通道的生理性激活功能喪失，并且這種抑制效能與敲除BK 通道的β1 亞基相同［4］。本研究中為進(jìn)一步探討ROS 是否為高糖狀態(tài)下HCASMC 中BK?β1 表達(dá)降低的觸發(fā)因素，測(cè)定了高糖濃度下HCASMC和糖尿病大鼠模型冠狀動(dòng)脈中ROS 水平，證實(shí)高糖濃度下HCASMC 和糖尿病大鼠模型冠狀動(dòng)脈中ROS 表達(dá)量增高。將ROS 抑制劑GKT137831 作用于高糖培養(yǎng)的HCASMC 發(fā)現(xiàn)，HCASMC 中BK?β1 表達(dá)增高，提示高糖狀態(tài)下的ROS可能參與了HCASMC中BK?β1蛋白調(diào)節(jié)。

大量研究證據(jù)表明，氧化應(yīng)激時(shí)PI3K/Akt 信號(hào)通路被激活并通過(guò)核因子E2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2）激活下游抗氧化基因的表達(dá)［12-13］。為了探討高糖是否通過(guò)PI3K/Akt 通路影響B(tài)K?β1 的表達(dá)，在高糖培養(yǎng)的HCASMC 中發(fā)現(xiàn)，BK?β1 表達(dá)明顯減少的同時(shí)伴有DNA?Pkcs、Akt 及p?Akt 的表達(dá)增高。經(jīng)GKT137831 作用后的HCASMC 中DNA?Pkcs、Akt、p?Akt表達(dá)量降低，以PI3K抑制劑Wortmannin（100 nmol/L）預(yù)處理細(xì)胞后，高糖狀態(tài)下的HCASMC DNA?Pkcs、Akt未見(jiàn)明顯變化，p?Akt的表達(dá)明顯降低，BK?β1表達(dá)明顯增加。提示高糖狀態(tài)下，ROS可能通過(guò)PI3K/AKT通路參與BK?β1的調(diào)節(jié)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證糖尿病中ROS 對(duì)冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK?β1 的調(diào)節(jié)作用，在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ROS、DNA?Pkcs、Akt 及p?Akt 表達(dá)增高，BK?β1的表達(dá)量降低。GKT137831灌胃2周后的糖尿病大鼠中冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ROS 表達(dá)量降低，DNA?PKcs、Akt、p?Akt、BK?β1 蛋白表達(dá)量接近于正常大鼠水平，進(jìn)一步驗(yàn)證在STZ 誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，ROS通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)BK?β1亞基的代謝。

糖尿病中調(diào)節(jié)BK 通道功能和代謝的因素較多，已有的研究結(jié)果證實(shí)，二十二碳六烯酸調(diào)節(jié)BK通道的電流和冠狀動(dòng)脈血管張力［14］。Nrf2、MuF1通過(guò)泛素化降解途徑影響B(tài)K?β1的分解代謝［6］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病中ROS 可能通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路部分參與冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK?β1 的調(diào)節(jié)。本研究初步探討了糖尿病中ROS 對(duì)BK?β1 調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，局限于ROS對(duì)BK?β1蛋白表達(dá)量的研究，ROS 對(duì)冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BK 通道電流的影響以及對(duì)冠狀動(dòng)脈血管張力的影響尚有待進(jìn)一步研究。