葛素梅，強 賢*，程羽青，歐陽俊，劉孟璐

1南京醫(yī)科大學附屬常州市婦幼保健院病理科，江蘇 常州 213003；2南京醫(yī)科大學附屬常州市第二人民醫(yī)院病理科，江蘇常州 213003

子宮內膜癌是子宮內膜發(fā)生的常見的惡性上皮性腫瘤，發(fā)病率在我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤居第2位，其病死率是婦科惡性腫瘤的第3位，嚴重威脅女性身體健康［1-2］。流行病學研究表明［3］，子宮內膜癌的發(fā)生與胰島素抵抗/代謝綜合征、非甾體激素、炎癥等因素有顯著相關性。炎癥微環(huán)境是子宮內膜癌重要的局部特征之一。近年來研究表明，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展受到腫瘤微環(huán)境的影響，腫瘤微環(huán)境中主要浸潤的炎癥細胞為腫瘤相關巨噬細胞（tu?mor associated macrophage，TAM），其功能和表型受腫瘤微環(huán)境的影響，可分為經典活化型（M1）和替代活化型（M2型）兩類。M1巨噬細胞被認為能夠通過分泌高水平的促炎細胞因子殺滅病原體和腫瘤細胞，相反，M2 巨噬細胞可以抑制免疫反應和促進腫瘤的發(fā)展［4］。TAM是子宮內膜癌間質中一類非常重要的細胞群。目前中文文獻中尚無研究探討TAM與子宮內膜癌的臨床病理特征和預后之間的關系，本研究檢測TAM 標志物CD163、CD68 蛋白在子宮內膜癌和正常增生期子宮內膜中的表達水平，并分析其表達與子宮內膜癌臨床病理特征及生存期的關系，為進一步明確子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展與TAM的關系提供研究基礎。

1 對象和方法

1.1 對象

收集南京醫(yī)科大學附屬常州市婦幼保健院病理科2010 年1 月—2015 年12 月手術切除的子宮內膜癌標本46 例作為觀察組，所有患者術前均未行放、化療及激素治療，均有完整的臨床病理資料，包括患者年齡、病理組織學分級、浸潤宮體肌層深度，病理學類型、區(qū)域淋巴結有無轉移、FIGO分期、術后生存時間等。46 例子宮內膜癌患者年齡36～75 歲，中位年齡53歲，其中Ⅰ型子宮內膜樣腺癌36例，Ⅱ型癌包括漿液性癌和透明細胞癌共10例。FIGO分期：Ⅰ期共32例，Ⅱ～Ⅳ期14例；組織學分級：G1/G2級30例，G3級16例；浸潤肌層深度＜1/2有21例，≥1/2有25例；有淋巴結轉移9例，無淋巴結轉移37例。所有切片均經2 名高年資病理醫(yī)師閱片，子宮內膜癌的組織學分類及分級參照WHO（2014）女性生殖器官腫瘤分類，臨床分期參照FIGO（2009）分期。以同期就診的25 例非腫瘤內膜組織作為對照組。隨訪時間從手術后至2020年12月。

1.2 方法

免疫組化染色采用SP法，所有標本均經10%中性福爾馬林及時固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，枸櫞酸（pH 6.0）熱抗原修復，一抗稀釋（1∶1 000），4 ℃過夜，二抗室溫30 min。以PBS 代替一抗作為陰性對照，陽性對照選取相應的組織標本。CD163抗體（克隆號10D6）和CD68 抗體（克隆號PG?M1）均購自北京中杉金橋有限公司，LEICA BOND?MAX平臺。

閱片和計數(shù)由2位高年資病理醫(yī)師進行雙盲法觀察分析，CD68 陽性表達位于細胞質，CD163 陽性表達位于細胞質及細胞膜，以棕黃色或黃褐色顆粒狀染色為陽性表達。組織切片后，判讀腫瘤內部和腫瘤浸潤前沿的TAM，先在低倍鏡（×100）下找到TAM 密集區(qū)域，然后轉至高倍鏡（×400）下觀察，隨機選取5 個視野計數(shù)TAM。以TAM 計數(shù)的中位數(shù)為分界點，分為高表達組和低表達組［5］。其中CD163+巨噬細胞數(shù)＞57 個/400 倍鏡為高表達。CD68+巨噬細胞數(shù)＞86 個/400 倍鏡為高表達。同時將CD163/CD68 比值以其中位數(shù)（0.635）為界，分為高比值組和低比值組。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，CD163、CD68蛋白在子宮內膜癌和正常子宮內膜間表達差異采用t檢驗，子宮內膜癌各組間表達差異及其與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，生存分析用Kaplan?Meier 法，Log?rank 檢驗比較生存差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TAM 在子宮內膜癌和正常增生期子宮內膜中的表達

巨噬細胞浸潤數(shù)量方面，非腫瘤子宮內膜組織中CD163計數(shù)為15～30個（中位值20），CD68計數(shù)為20～35 個（中位值25），子宮內膜癌組織CD163 計數(shù)為35～115 個（中位值57），CD68 計數(shù)為58～131 個（中位值86）。兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.000 1，P＜0.05）。巨噬細胞浸潤部位方面，增生期子宮內膜中的巨噬細胞僅僅見于子宮內膜間質，子宮內膜癌中的巨噬細胞不僅出現(xiàn)在間質，而且在子宮內膜癌腺腔內和癌巢浸潤前沿都有大量的巨噬細胞浸潤（圖1A～F）。

圖1 CD163、CD68在增生期子宮內膜和子宮內膜癌中的表達（×100）Figure 1 Expressions of CD163 and CD68 in proliferative endometrium and endometrial cancer（×100）

2.2 TAM與子宮內膜癌臨床病理參數(shù)的關系

CD163 的表達與患者年齡、病理類型和肌層浸潤深度無關（P＞0.05），CD68的表達與患者年齡、病理學分級、病理類型、淋巴結轉移無關（P＞0.05）。CD163的表達與病理學分級、有無淋巴結轉移和FI?GO分期顯著相關（P＜0.05），CD68的表達與宮體肌層浸潤和FIGO 分期顯著相關（P＜0.05），CD163/CD68 比值與患者年齡、病理學分級、淋巴結轉移和FIGO分期顯著相關（P＜0.05，圖2，表1）。

表1 CD163，CD68表達和CD163/CD68比值與子宮內膜癌臨床病理參數(shù)的關系Table 1 The correlation of expressions of CD163 and CD68 and ratio of CD163/CD68 with clinico pathological features of erdometrial cancer［n（%）］

圖2 CD163、CD68在不同病理分級子宮內膜癌中的表達（×100）Figure 2 Expressions of CD163 and CD68 in endometrial cancer with different pathological grades（×100）

2.3 生存分析

截至2020 年12 月，46 例子宮內膜癌患者均獲得隨訪，其中42例存活，因子宮內膜癌死亡4例，隨訪時間2～138 個月，中位隨訪時間74 個月，生存分析結果顯示，CD163、CD68的表達及CD163/CD68的比值、年齡、病理學分級、分期、浸潤深度、病理類型與患者的生存率無明顯相關性（P＞0.05），淋巴結轉移與預后相關（OR=14.34，95% CI，P=0.021），其中無淋巴結轉移患者5 年生存率97%，有淋巴結轉移患者5年生存率67%。

3 討論

TAM是腫瘤微環(huán)境的重要組成，目前發(fā)現(xiàn)TAM與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有聯(lián)系，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結直腸癌、前列腺癌、甲狀腺癌等［6-8］，TAM 具有促進腫瘤的侵襲轉移和血管形成等作用。巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞，在維持穩(wěn)態(tài)和宿主防御病原體方面起重要作用，巨噬細胞分為經典激活的M1型和替代激活的M2型，一般認為，在腫瘤早期，M1 型巨噬細胞可促進Th1 細胞免疫應答，產生促炎因子，發(fā)揮抗腫瘤效應；隨著腫瘤進展，腫瘤細胞或間質細胞發(fā)出的微環(huán)境信號可使M1型巨噬細胞極化為M2型巨噬細胞。臨床病理工作中通常使用CD68 和CD163 作為總TAM 和M2 的標志。近年研究表明［9］，TAM 在腫瘤血管生成、侵襲、轉移、免疫抑制及化療抵抗等方面發(fā)揮重要作用，是腫瘤微環(huán)境的重要調控者。TAM可通過多條信號通路促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是腫瘤預后不良的重要因素。特定腫瘤的臨床病理特征與CD68、CD163 數(shù)量有關還是與CD68/CD163 比值有關在不同瘤種中有所不同［10］：如食管癌中CD68 與腫瘤分級、分期相關，在卵巢癌中腫瘤臨床病理特征與CD68數(shù)量無關，而和CD163表達水平、CD68/CD163比值有關，在胃癌中只與CD163/CD68 比值有關。中國人群中子宮內膜癌與這些TAM 標志物的關系尚未明了。本實驗以子宮內膜癌為研究對象，分析CD163、CD68的表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系。

CD68 是由單核細胞以及循環(huán)和組織的巨噬細胞高表達的高度糖基化的跨膜糖蛋白對免疫的調控，可作為總的巨噬細胞標志物，主要通過誘導T細胞、巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞分泌TGF?β，從而減少TNF、IL?8等促炎因子的分泌以及免疫細胞的激活，因此CD68+TAM 具有促進腫瘤發(fā)展的作用［11］。CD163 既是人體中血紅蛋白?觸蛋白復合物清除劑的高親和力受體，是公認的M2 型巨噬細胞的高度特異性標志物。CD163+TAM 在腫瘤微環(huán)境中可通過分泌IL?10 等抗炎細胞因子，抑制T 淋巴細胞增殖，在腫瘤微環(huán)境中，CD163+TAM 促進腫瘤細胞增殖、免疫抑制以及侵襲轉移［12］，Sugemura 等［13］發(fā)現(xiàn)CD68+TAM 和CD163+TAM 的浸潤與食管癌腫瘤浸潤深度，淋巴和脈管侵犯顯著相關。Dun 等［14］研究表明，與良性子宮內膜相比，子宮內膜癌組織的腺腔和間質中都可見高密度表達的CD68+巨噬細胞，特別是晚期子宮內膜癌組織中可見CD163+的M2型巨噬細胞聚集。高密度表達CD68+巨噬細胞及M2型TAM 常常與子宮肌層浸潤風險、微血管密度、血管生成、淋巴管血管間隙浸潤、淋巴結轉移的高風險相關，并且與較高的FIGO 分期、較高的組織學分級相關，這些病例常常高表達Ki?67 與P53，預后及生存率較差。本研究探討了TAM 與子宮內膜癌臨床病理參數(shù)的關系，結果顯示，CD68+TAM的數(shù)量與子宮內膜癌的病理分級、FIGO 分期有相關性，CD163+巨噬細胞的數(shù)量與子宮內膜癌的病理分級有相關性，病理分級較高的子宮內膜癌和深肌層浸潤的子宮內膜癌，比病理分級低和淺肌層浸潤的子宮內膜癌間質中具有更多的M2 型TAM，且CD163/CD68比值與更多的臨床病理特征有關系，其中包括年齡、病理學分級、淋巴結轉移和FIGO 分期均有關系，CD163/CD68 比值可反映巨噬細胞向M2 極化趨勢，表明M2 型腫瘤相關巨噬細胞的浸潤及由此引起的腫瘤炎癥微環(huán)境的惡化可能在子宮內膜癌的發(fā)展過程中具有重要作用。

普遍認為影響子宮內膜癌預后的因素包括組織學亞型、肌層浸潤深度、淋巴結轉移、宮頸受累、腹膜轉移和患者年齡等。TAM 促進腫瘤組織血管的形成，促進腫瘤細胞的侵襲與轉移，TAM 參與子宮內膜癌的生長、血管和淋巴管生成、免疫抑制等方面，促進子宮內膜癌的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤微環(huán)境中CD68與CD163陽性的巨噬細胞與患者的預后仍然有爭議，研究表明腫瘤浸潤CD68+的密度與胃癌患者的總生存率呈負相關［15］，TAM數(shù)已被確定為一些癌癥的獨立預后因素，如乳腺癌和結直腸癌，本研究生存分析發(fā)現(xiàn)，子宮內膜癌中CD163 與CD68的表達與患者的生存率無顯著的相關性，可能與子宮內膜癌預后較好有關。子宮內膜癌分為激素依賴型（Ⅰ型）和非激素依賴型（Ⅱ型），Ⅰ型主要與高雌激素狀態(tài)有關，主要為子宮內膜樣腺癌，低級別，預后良好，Ⅱ型主要為漿液性或透明細胞癌，預后明顯較差，通常為高級別，常常需要輔助化療和放療。Kelly等［16］研究表明，Ⅱ型子宮內膜癌間質中有高密度的腫瘤相關巨噬細胞，Ⅱ型癌癥的TAM密度幾乎是Ⅰ型癌癥的2倍，這種差異可能是由于M1巨噬細胞在Ⅱ型癌間質中占優(yōu)勢。本研究結果顯示，CD163、CD68 的表達在Ⅰ型癌和Ⅱ型癌沒有差異（P＞0.05），本研究與上述結果不一致原因可能是標本選擇的差異，造成Ⅰ型癌和Ⅱ型癌比例不同，需要進一步增加子宮內膜Ⅱ型癌病例數(shù)的研究，也提示M1型TAM與子宮內膜癌的關系需要進一步研究。

綜上所述，TAM在在子宮內膜癌組織中表達升高，且與腫瘤的FIGO 分期、病理分級、淋巴結轉移相關，提示TAM可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、淋巴結轉移方面發(fā)揮重要作用。TAM作為潛在治療靶點，主要治療策略包括：抑制M2巨噬細胞激活，阻止單核細胞向腫瘤中募集，激活單核細胞吞噬活性，調節(jié)M1型和M2型TAM比例，降低M2型TAM的比例，抑制TAM 的免疫信號通路等。相信今后以TAM 為靶點的治療有望成為一種有價值的子宮內膜癌輔助治療策略。