韓 晟，周錦仁，邵 青，戴新征，古 鑒

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院肝移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤。除了手術(shù)切除和肝移植外，針對(duì)HCC的抗腫瘤藥物治療效果有限，患者預(yù)后較差［1］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，在腫瘤中可觀察到明顯升高的Treg 浸潤(rùn)，這類(lèi)細(xì)胞可通過(guò)多種途徑抑制效應(yīng)性細(xì)胞激活，誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸［2-4］。近年來(lái)文獻(xiàn)表明，腫瘤代謝產(chǎn)物乳酸在調(diào)控腫瘤內(nèi)Treg 功能方面具有核心作用［5］，而單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（monocarboxylate transporter，MCT1）是腫瘤環(huán)境中最重要的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體［6］。本研究以南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝切除術(shù)的HCC 患者作為研究對(duì)象，探討MCT1 表達(dá)水平在HCC預(yù)后評(píng)估中的作用和可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

為探討MCT1 在HCC 預(yù)后評(píng)估中的作用，團(tuán)隊(duì)收集了2018 年于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝部分切除術(shù)的43 例HCC 患者的肝癌組織與癌旁組織標(biāo)本。為分析HCC 患者免疫細(xì)胞對(duì)乳酸的反應(yīng)活性以及MCT1 表達(dá)水平對(duì)Tregs 分化和功能的影響，收集了2021年于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝部分切除術(shù)的10 例患者的肝癌組織與癌旁組織標(biāo)本以及外周血標(biāo)本，所有患者均有完整病歷臨床資料并簽署知情同意書(shū)，所有程序均符合南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)研究倫理委員會(huì)的倫理標(biāo)準(zhǔn)（SYXK2018?0020）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床綜合檢查，符合HCC 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②手術(shù)前有明顯的炎癥感染；③截至目前有完整的隨訪(fǎng)資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①免疫系統(tǒng)疾病或感染性疾??；②合并其他腫瘤；③手術(shù)治療前曾接受其他抗腫瘤治療（介入、藥物、放療等）。

1.2 方法

1.2.1 RT?PCR

根據(jù)說(shuō)明書(shū)，利用RNA提取試劑盒提取組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置25 μL 反應(yīng)體系，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，上、下游引物各1 μL，Taq 酶0.2 μL，2×Buffer 12.5 μL，ddH2O 8.3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火并延伸1 min，循環(huán)40 次；72 ℃總延伸5 min。

相關(guān)引物序列設(shè)計(jì)如下：MCT1，F(xiàn)orward Prim?er：5′?CAATGCCACCAGCAGTTG?3′，Reverse Prim?er：5′?GCAAGCCCAAGACCTCCAAT?3′；Foxp3，F(xiàn)or?ward Primer：5′?GTGGCCCGGATGTGAGAAG?3′，Re?verse Primer：5′?GGAGCCCTTGTCGGATGATG?3′；CTLA4，F(xiàn)orward Primer：5′ ? CATGATGGGGAAT?GAGTTGACC?3′，Reverse Primer：5′?TCAGTCCTTG?GATAGTGAGGTTC?3′；IL?10，F(xiàn)orward Primer：5′?ATAAAAGGGGGACACCGGGC?3′，Reverse Primer：5′?CTCATAACCCATGGCTTGGC?3′。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

運(yùn)用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液從肝素抗凝靜脈血中提取PBMC，加入抗CD4、CD8、CD25、CD127 等流式抗體，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血細(xì)胞分型差異。PBMC 在進(jìn)行表面染色后，PBS 洗滌2 次，加入固定劑固定，破膜劑打孔后，離心棄上清液后進(jìn)行胞內(nèi)Foxp3染色。4 ℃孵育30 mins后PBS洗滌并上機(jī)檢測(cè)。流式圖像和數(shù)據(jù)采用Flowjo software處理。

1.2.3 乳酸處理和Treg誘導(dǎo)效率檢測(cè)

運(yùn)用磁珠分選儀（美天旎公司，德國(guó)）分選CD4+CD45RA+T 細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)所得細(xì)胞純度（＞97%），隨后在CD4+CD45RA+T細(xì)胞中加入抗CD3/CD28 擴(kuò)增磁珠（1 磁珠∶3 細(xì)胞），TGF?β（20 ng/mL）和IL?2（100 U/mL）培養(yǎng)7 d，運(yùn)用流式檢測(cè)技術(shù)分析Treg誘導(dǎo)的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)于計(jì)數(shù)資料的組間比較使用χ2檢驗(yàn)，數(shù)值變量資料的組間比較使用t檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan?Meier法進(jìn)行分析并進(jìn)行Log?rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者外周T細(xì)胞MCT1高表達(dá)導(dǎo)致Treg分化傾向

為研究MCT1 基因的表達(dá)差異與患者T 細(xì)胞分化以及Treg功能的關(guān)系，收集了因HCC行肝切除患者的腫瘤與癌旁標(biāo)本以及外周血，并統(tǒng)計(jì)和整理了相應(yīng)的臨床信息。通過(guò)qPCR檢測(cè)比較腫瘤與癌旁表達(dá)MCT1的mRNA比率，隨后通過(guò)MCT1表達(dá)的高低將患者人為進(jìn)行排序，分為MCT1 高表達(dá)組和MCT1低表達(dá)組（圖1A）。運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各患者的外周血分型，結(jié)果顯示無(wú)論是CD4+T、CD8+T細(xì)胞抑或是CD4+CD25+CD127-Treg 細(xì)胞，均無(wú)明顯差異（圖1B、C）。實(shí)際上，腫瘤微環(huán)境與外周血存在明顯差異，而近年研究顯示，糖酵解的發(fā)生和乳酸沉積是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分［7-9］。因此，通過(guò)對(duì)na?ve T 細(xì)胞進(jìn)行乳酸處理來(lái)模擬腫瘤微環(huán)境。運(yùn)用10 nmol/L 乳酸處理各組CD4+CD45RA+na?ve T 細(xì)胞后，觀察到添加乳酸明顯升高M(jìn)CT1 高表達(dá)組的Foxp3表達(dá)，提示MCT1基因高表達(dá)患者的T細(xì)胞更易向Treg 轉(zhuǎn)化（圖1D）。為了研究MCT1 在其中發(fā)揮作用的可能機(jī)制，檢測(cè)了兩組中MCT1 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MCT1 基因高表達(dá)患者的MCT1蛋白表達(dá)水平在乳酸作用環(huán)境下明顯升高（圖1E），而在MCT1 基因低表達(dá)患者組差異不明顯。最后，在MCT1基因高表達(dá)患者的Treg誘導(dǎo)環(huán)境中加入乳酸和MCT1 抑制劑，結(jié)果顯示，雖然乳酸可以提高Treg 的分化，但是MCT1 抑制劑處理可逆轉(zhuǎn)乳酸對(duì)Foxp3表達(dá)的促進(jìn)作用（圖1F）。

圖1 HCC患者外周T細(xì)胞MCT1高表達(dá)導(dǎo)致Treg分化傾向Figure 1 High expression of MCT1 in peripheral T cells of HCC patients leads to Treg differentiation tendency

2.2 MCT1 高表達(dá)的HCC 中免疫細(xì)胞增殖頻率降低而免疫抑制因子的表達(dá)上調(diào)

接下來(lái)進(jìn)一步分析HCC 患者的腫瘤組織切片。分析結(jié)果顯示，MCT1 高表達(dá)HCC 組織中浸潤(rùn)著較低頻率增殖的免疫細(xì)胞，而MCT1 低表達(dá)的HCC 組織中浸潤(rùn)著大量活性免疫細(xì)胞，提示較好預(yù)后（圖2A）。除此以外，qRT?PCR 檢測(cè)顯示高表達(dá)MCT1 的HCC 內(nèi)免疫抑制因子如Foxp3、CTLA4、IL?10 的表達(dá)顯著上調(diào)，提示MCT1 的高表達(dá)促進(jìn)HCC 免疫微環(huán)境內(nèi)免疫抑制因子的轉(zhuǎn)錄從而抑制免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致HCC 疾病進(jìn)展和預(yù)后加重。

圖2 MCT1高表達(dá)的HCC中免疫細(xì)胞增殖頻率降低而免疫抑制因子的表達(dá)上調(diào)Figure 2 In HCC with high MCT1 expression，the frequency of immune cell proliferation is reduced while the expression of immunosuppressive factors is up?regulated

2.3 MCT1是HCC預(yù)后不良的標(biāo)志物

由于腫瘤微環(huán)境中乳酸通過(guò)MCT1進(jìn)入免疫細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與功能的作用［10-11］，本研究評(píng)估了乳酸與MCT1 在評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)HCC 預(yù)后中的作用。使用表1方案，分析了2018年接受HCC切除手術(shù)的43例患者的腫瘤組織標(biāo)本，分別將患者分為高乳酸組和低乳酸組或高M(jìn)CT1 高表達(dá)和MCT1 低表達(dá)組（表1）。入組43例患者中，MCT1高表達(dá)患者的甲胎蛋白（AFP）明顯高于MCT1 低表達(dá)組，但是其他指標(biāo)，如腫瘤大小、微血管癌栓發(fā)生率等無(wú)明顯差異。本研究分析了不同分組的總生存期（overall survival，OS）和無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）。結(jié)果顯示，與乳酸水平較高的患者相比，乳酸水平較低的患者的OS 率略低。但總體而言，OS和DFS 分析無(wú)明顯差異（圖3A）。正如預(yù)期的那樣，與較低MCT1組相比，具有較高M(jìn)CT1 的患者在OS和DFS率方面顯示了不良的預(yù)后結(jié)果（圖3B）。

圖3 MCT1 是HCC預(yù)后不良的標(biāo)志物Figure 3 MCT1 is a poor prognostic marker of HCC

表1 HCC中MCT1表達(dá)與臨床指標(biāo)的相馮性Table 1 The correlation between MCT1 expression in HCC and clinical indicators

3 討論

HCC是一種起源于肝細(xì)胞的致命惡性腫瘤，是目前世界上第二大癌癥相關(guān)死亡原因［12］。全球每年報(bào)告850 000例HCC新發(fā)病例和745 500例死亡，而中國(guó)發(fā)生466 000 例HCC 新發(fā)病例和422 000 例死亡。由于HCC被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已嚴(yán)重進(jìn)展，只有10%～15% 的患者具備手術(shù)切除的指征。目前，原發(fā)性HCC 的治療方法多種多樣；除了根治性手術(shù)切除外，還包括新型多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物、聯(lián)合化療、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞、射頻消融、無(wú)水酒精注射等［13］。

Treg在抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)過(guò)程中起核心作用［14-15］，Treg 升高既可抑制具備殺傷毒性的CD8 T細(xì)胞的功能，而且能夠抑制NK等殺傷細(xì)胞的腫瘤殺傷作用［16-17］。最近研究表明，腫瘤代謝物乳酸在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中至關(guān)重要［18］，目前報(bào)道的作用主要集中在乳酸調(diào)節(jié)Treg和巨噬細(xì)胞上［19-20］。乳酸可以調(diào)節(jié)TME中Treg的細(xì)胞數(shù)量、抑制功能和代謝方式［21-23］；而乳酸作用于細(xì)胞的機(jī)制主要依賴(lài)MCT1作為載體的轉(zhuǎn)運(yùn)作用［6，24］。MCT1是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在細(xì)胞膜上具有功能活性，在包括乳腺癌、肝癌等多種人類(lèi)癌癥中普遍高表達(dá)，可以增加腫瘤細(xì)胞的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)［25-27］。在HCC 中，MCT1 的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)作用受到WNT?β?catenin 信號(hào)調(diào)控［25］?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，本研究以探究MCT1 依賴(lài)其調(diào)控乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)的能力影響HCC 進(jìn)展和預(yù)后的具體作用及相應(yīng)機(jī)制為目的。

本研究結(jié)果表明，在非乳酸環(huán)境下（外周血），T細(xì)胞以及Treg細(xì)胞的分化和表型沒(méi)有差異；但是乳酸處理下，MCT?1高表達(dá)組的Treg獲得明顯提升，該結(jié)果提示MCT?1高表達(dá)組通過(guò)增加MCT1可以在腫瘤微環(huán)境下提高對(duì)乳酸的攝取，進(jìn)而提高Treg的分化以及下游的免疫逃逸。運(yùn)用MCT 抑制劑處理可以廢除乳酸對(duì)Treg的提升作用，進(jìn)一步證實(shí)這種調(diào)節(jié)Treg 的作用依賴(lài)MCT1 通路的激活。在圖2 中，在組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)MCT1低表達(dá)組較高表達(dá)組存在更多的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，已有報(bào)道，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可以促進(jìn)更多的抗腫瘤T 細(xì)胞在腫瘤內(nèi)增殖，是免疫細(xì)胞激活和抗腫瘤效果較好的標(biāo)志，預(yù)示著較好的預(yù)后［2，28］；本文猜想，MCT1 高表達(dá)的肝臟中存在大量Treg等免疫抑制細(xì)胞，他們可以抑制周邊的免疫細(xì)胞激活和增殖，進(jìn)而阻斷抗腫瘤免疫反應(yīng)。通過(guò)qRT?PCR 檢測(cè)也觀測(cè)到了MCT 浸潤(rùn)的HCC 肝臟中浸潤(rùn)大量的免疫抑制因子以及Treg 相關(guān)因子如Foxp3、CTLA4、IL?10 的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了上述想法。最后，由于本課題組前期研究的患者均為2021年入院手術(shù)患者，為了評(píng)估MCT1 對(duì)HCC 患者遠(yuǎn)期預(yù)后的影響，分析了2018年行肝癌切除的患者組織樣本43 例，并進(jìn)一步檢測(cè)了乳酸和MCT1 的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCT1 高表達(dá)組而不是乳酸高表達(dá)組與預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果表明，即便乳酸在HCC 中堆積高表達(dá)，如果不能通過(guò)MCT1 作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入免疫細(xì)胞，則不能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)腫瘤逃逸。

綜上所述，本研究通過(guò)細(xì)胞結(jié)合組織標(biāo)本并依據(jù)臨床數(shù)據(jù)從多方面探討了HCC中MCT1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)，研究證實(shí)乳酸調(diào)控依賴(lài)MCT1 通路促進(jìn)Tregs，并支持MCT1表達(dá)作為HCC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，提示MCT1 高表達(dá)的HCC 患者具有較差的生存預(yù)后。