王啟航，陸瑞敏，陳萌，張冬梅

（1．北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們壓力增大、飲食不規(guī)律等問題日益增多，結(jié)合暖期多虛寒的疾病譜特征[1]，致當(dāng)代脾胃疾病多發(fā)。而脾氣的健運(yùn)與否也很大程度決定了人體健康與否。在越來越重視“治未病”的今天，展開脾胃生理功能、脾虛發(fā)生機(jī)制的研究，無疑有著重要的時(shí)代意義。中醫(yī)造模實(shí)驗(yàn)是一種現(xiàn)代形式的“比類取象”，它使整個(gè)生物科學(xué)成為了中醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)[2]，研究脾虛動(dòng)物模型是研究脾胃理論的理想切入點(diǎn)。有關(guān)脾虛模型的復(fù)制方法逐漸多樣化、復(fù)雜化[3]，但是缺少模型間的橫向?qū)Ρ燃皩?dǎo)致脾虛的病因探討。有鑒于此，筆者復(fù)制了苦寒瀉下、飲食失節(jié)、勞倦過度、利血平注射4種經(jīng)典脾虛模型，并從宏觀、免疫、消化、血液、線粒體功能角度進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)以比較模型損傷程度及適用性，希冀為脾虛的發(fā)生機(jī)制提供研究價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性昆明小鼠100只，體質(zhì)量18～22 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)SYXK2019-0010。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 藥物與試劑 番瀉葉配方顆粒150 g，北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院；利血平粉末（RH45599-1）購于北京百諾威生物科技有限公司；冰乙酸（20180911）購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；血清D-木糖檢測(cè)試劑盒（20180504）購于南京建成生物工程研究所；Trizol（A8404-1）購于 Invitrogen公司；SYBR Premix EX TaqII Kit（AK2901）、Prime Script TMR Treagent Kit（AK2003）購于 TaKaRa公司；DEPCH2O（20190811）、磷酸鹽緩沖液（20190522）、PCR 引物（20190818）、TIA Namp Genomic DNA Kit（201900526）、DNaseI（20190928）、Promega（M610A）購于北京晶萊生物有限公司。

1.3 儀器設(shè)備 DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）、MB10Kpw型電子天平（上海?？惦娮觾x器廠）、BC-2300型血液分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、精密電子天平（JA2003 SHP07003，上海恒平科學(xué)儀器有限公司）、TU-1800S型紫外分光光度計(jì)、Scanspeed1730R型低溫離心機(jī)（Labogene公司）、Rotor-Gene 3000 Realtime PCR儀（Orbett Research公司）、EDTA抗凝血管（博士德生物工程有限公司）。

1.4 模型制備 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按如下分組，見表1。

表1 各組小鼠造模方法Tab.1 Modeling methods of mice in each group

記錄各組小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量。造模持續(xù)10 d后，隨機(jī)取10只小鼠做相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，10只小鼠自然恢復(fù)10 d，觀察各組宏觀指標(biāo)的穩(wěn)定性。

1.5 宏觀指標(biāo)評(píng)價(jià) 記錄各組小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量變化，觀察小鼠是否出現(xiàn)懶動(dòng)、拱背、扎堆、瞇眼、毛色枯黃、毛色稀少、耳尾色白、腹面被毛憔悴、抓取無力掙扎、受驚動(dòng)時(shí)無神、軟便、便溏、泄瀉、受激排便率增高等癥狀，出現(xiàn)某一癥狀記1分，對(duì)各組小鼠得分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較宏觀體征得分[5]。

1.6 宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 分別記錄脾虛模型造模結(jié)束后和自然恢復(fù)10 d后各組小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量變化。然后，采用綁尾迫使小鼠強(qiáng)制游泳至力竭，游泳水溫為22℃，小鼠游泳以連續(xù)“冒泡”5次為力竭標(biāo)志，記錄游泳時(shí)長。

1.7 理化指標(biāo)檢測(cè) 造模結(jié)束后，小鼠摘眼球取血，血液分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）。4℃靜置2 h后，以5 000 r/min，4℃離心5 min，離心半徑18 cm，取上清，比色法測(cè)定血清D-木糖水平，操作按試劑盒說明進(jìn)行。碘-淀粉酶比色法測(cè)定小鼠血清淀粉酶活性。記錄胸腺、脾臟質(zhì)量，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.8 mtDNA拷貝數(shù)及線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin mRNA的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取1 mm3大小的新鮮肝組織若干塊，按TIA Namp Genomic DNA Kit說明書提取總DNA。根據(jù)SYBR Premix EX TaqII Kit說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃×60 s，（95 ℃×15 s，60 ℃×60 s）×40 個(gè)循環(huán)，以 β-actin 為內(nèi)參照，所得 CT 值按照 2-ΔΔCt的方法進(jìn)行均一化處理后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)。引物序列如下，見表2。

表2 ND1 及 β-actin 引物序列（3′-5′）Tab.2 ND1 and β-actin primer sequences(3′-5′)

取適量組織，按Total RNA Extraction Kit說明書提取總RNA，DNaseI去基因組并用紫外分光光度儀檢測(cè)純度與完整性。根據(jù)Prime Script TMR Treagent Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA-20℃保存。按照mRNA/lncRNA qPCR Kit說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃×60 s，（95 ℃×10 s，58℃×30 s）×39 個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參照，將所得CT值按照2-ΔΔCt的方法進(jìn)行均一化處理再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin mRNA水平。引物序列如下，見表3。

表3 Pink1、Parkin 及內(nèi)參引物序列（3′-5′）Tab.3 Pink1，Parkin，and the internal reference primer sequences(3′-5′)

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 24．0軟件處理。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)正態(tài)且方差齊多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，非正態(tài)或方差不齊組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠宏觀指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組相比，各組宏觀體征均有顯著變化（P＜0．05）。其中，利血平組宏觀體征得分最高，飲食失節(jié)組最低。與空白對(duì)照組相比，各造模組小鼠造模后體質(zhì)量與進(jìn)食量平均值均有所下降（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以利血平組差異明顯。綜上利血平組小鼠脾虛癥狀表現(xiàn)、進(jìn)食量與體質(zhì)量變化最為顯著，飲食不節(jié)法因造模方法沖突故不參與統(tǒng)計(jì)。見表4。

表4 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)比較（±s）Tab.4 Comparison of macroscopic indicators in spleen deficiency mice（±s）

表4 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)比較（±s）Tab.4 Comparison of macroscopic indicators in spleen deficiency mice（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

造模結(jié)束后體質(zhì)量（g）空白對(duì)照組 10 - 15．9 31．5±2．6苦寒瀉下組 10 12．30±0．3** 11．2 26．3±2．6*利血平組 10 13．40±0．2** 5．1 23．4±2．2**飲食失節(jié)組 10 8．80±0．2* - 27．8±2．5*勞倦過度組 10 11．20±0．3** 14．8 28．2±2．9*組別 動(dòng)物數(shù) 宏觀體征得分造模結(jié)束后進(jìn)食量（g）

2.2 各組小鼠宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性比較 自然恢復(fù)10 d后，與空白對(duì)照組相比，苦寒瀉下組、利血平組、飲食失節(jié)組體質(zhì)量仍未達(dá)到正常水平（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，勞倦過度組體質(zhì)量水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；各模型組小鼠進(jìn)食量恢復(fù)并超出空白對(duì)照組水平，進(jìn)食量發(fā)生“報(bào)復(fù)式”增長。其中，利血平組增長最多，苦寒瀉下組增長最少；造模結(jié)束后，苦寒瀉下組、飲食失節(jié)組、勞倦過度組小鼠游泳至力竭的時(shí)長均降低（P＜0．05），以利血平組與苦寒瀉下組差異顯著（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自然恢復(fù)10 d后，苦寒瀉下組與飲食失節(jié)組小鼠仍有低于對(duì)照組的趨勢(shì)（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上苦寒瀉下組與飲食失節(jié)組小鼠癥狀更穩(wěn)定，飲食不節(jié)組與勞倦過度組因造模方法沖突故不參與統(tǒng)計(jì)。見表5。

表5 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性比較（±s）Tab.5 Comparison of macroscopic index stability in spleen deficiency mice（±s）

表5 脾虛小鼠宏觀指標(biāo)穩(wěn)定性比較（±s）Tab.5 Comparison of macroscopic index stability in spleen deficiency mice（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0．05，**P<0．01。

自然恢復(fù)10 d后游泳時(shí)長（min）空白對(duì)照組 10 30．6±2．4 35．7±2．4 16．4 17．3 9．2±2．4 11．3±4．3苦寒瀉下組 10 24．6±3．6* 30．6±2．4* 10．3 17．9 4．1±1．3** 7．9±3．4*利血平組 10 22．7±2．2** 29．9±3．2* 5．3 18．7 14．5±3．1** 11．5±4．6飲食失節(jié)組 10 25．2±3．0* 29．6±3．5* - - 6．1±2．8* 8．9±3．6*勞倦過度組 10 26．9±2．1* 34．3±2．6 16．2 18．6 - -組別 動(dòng)物數(shù)造模結(jié)束后體質(zhì)量（g）自然恢復(fù)10 d后體質(zhì)量（g）造模結(jié)束后進(jìn)食量（g）自然恢復(fù)10 d后進(jìn)食量（g）游泳至力竭時(shí)長（min）

2.3 各組小鼠理化指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組相比，各模型組小鼠血清D-木糖水平低于正常組（P＜0．05），說明各組造模成功；勞倦過度組胸腺指數(shù)下降最顯著（P＜0．05），其次是利血平組（P＜0．05），苦寒瀉下組變化最?。≒＜0．05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；利血平組脾臟指數(shù)下降最顯著（P＜0．05），苦寒瀉下組次之（P＜0．05），飲食失節(jié)組有所上升（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清淀粉酶活性均有所降低，變化以利血平組最為顯著（P＜0．01）；利血平組 RBC 下降最為明顯（P＜0．01），其次為苦寒瀉下組（P＜0．01），勞倦過度組有所上升（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；利血平組 WBC 下降最明顯（P＜0．05），其次為苦寒瀉下組（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；利血平組HGB下降最為顯著（P＜0．05），其次為苦寒瀉下組（P＜0．05），勞倦過度組有所上升（P＜0．01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上，利血平組小鼠理化指標(biāo)變化明顯，其次為苦寒瀉下組。見表6。

表6 脾虛小鼠理化指標(biāo)比較（±s）Tab.6 Comparison of physical and chemical indexes of spleen deficiency mice（±s）

表6 脾虛小鼠理化指標(biāo)比較（±s）Tab.6 Comparison of physical and chemical indexes of spleen deficiency mice（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

外周血指標(biāo)RBC（×1012/L） WBC（×109/L） HGB（g/L）空白對(duì)照組 10 5．14±0．12 2．98±0．27 4．96±0．19 718．94±15．49 7．37±0．59 6．42±0．93 139．47±13．74苦寒瀉下組 10 2．84±0．22** 2．72±0．34* 4．39±0．57* 633．28±17．58* 6．23±1．08* 5．73±1．29* 128．16±10．42*利血平組 10 2．12±0．26** 2．63±0．47* 4．17±0．62* 603．19±19．73** 5．93±1．16** 5．13±1．67* 120．95±11．73*飲食失節(jié)組 10 3．79±0．19* 2．80±0．41 5．87±0．51** 622．17±20．15** 6．43±0．93 6．23±0．85 126．45±14．94勞倦過度組 10 3．93±0．16* 2．54±0．33* 4．82±0．83 667．87±17．94 8．94±0．97* 5．43±1．36 148．74±12．69**組別 動(dòng)物數(shù) 血清D-木糖水平（Inmol/L）胸腺指數(shù)（mg/g）脾臟指數(shù)（mg/g）血清淀粉酶（U/100 mL）

2.4 各組小鼠mtDNA拷貝數(shù)、Pink1、Parkin mRNA表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較，飲食失節(jié)組mtDNA 拷貝數(shù)下降最為顯著（P＜0．01），其次苦寒瀉下組（P＜0．05），勞倦過度組下降較少（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；苦寒瀉下組Pink1mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低最為顯著（P＜0．01），其次飲食失節(jié)組（P＜0．05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；利血平組Parkin mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升（P＜0．05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。綜上，飲食失節(jié)與苦寒瀉下組小鼠線粒體功能改變明顯。見表7。

表7 脾虛小鼠mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)比較（±s）Tab.7 Comparative copy number comparison of mtDNA in spleen deficient mice（±s）

表7 脾虛小鼠mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)比較（±s）Tab.7 Comparative copy number comparison of mtDNA in spleen deficient mice（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

組別 動(dòng)物數(shù)mtDNA相對(duì)拷貝數(shù) Pink1 mRNA Parkin mRNA空白對(duì)照組 10 1．140±0．120 1．024±0．068 1．049±0．156苦寒瀉下組 10 0．840±0．220* 0．612±0．083**1．028±0．172利血平組 10 1．120±0．260 0．973±0．126 1．319±0．165*飲食失節(jié)組 10 0．790±0．190** 0．893±0．097*1．057±0．176勞倦過度組 10 0．930±0．160* 0．997±0．164 1．059±0．247

3 討論

中醫(yī)在臨床診斷中常常是司外揣內(nèi)的，常以乏力懶言，語聲低微，四肢沉重，形體消瘦，食欲不振，便溏或泄瀉等表現(xiàn)作為衡量患者是否是脾虛證的重要參考，并以癥狀的突出與否來判斷脾虛的輕重及亞型，故在中醫(yī)的實(shí)驗(yàn)研究中，宏觀指標(biāo)也是動(dòng)物模型評(píng)價(jià)的重要組成部分[6]。4種造模法都能成功復(fù)制脾虛癥狀，但是各個(gè)模型的癥狀輕重存在差異，利血平模型組癥狀重且覆蓋全面，但自然恢復(fù)快，模型穩(wěn)定性差；苦寒瀉下組癥狀表現(xiàn)方面次之，但模型穩(wěn)定性好；飲食不節(jié)模型組癥狀覆蓋同樣較為全面，癥狀穩(wěn)定但較為輕淺，可造模至20 d，勞倦過度模型組的脾虛癥狀輕淺且覆蓋不全面。

脾胃為氣血生化之源，脾的運(yùn)化作用于血液質(zhì)量息息相關(guān)[7]，故脾虛證動(dòng)物模型會(huì)出現(xiàn)血液質(zhì)量改變。近年來對(duì)脾虛模型評(píng)價(jià)的血液指標(biāo)主要包括：WBC、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞比容、RBC平均血紅蛋白量等。脾主運(yùn)化，脾虛證的主要表現(xiàn)之一為消化系統(tǒng)的功能低下，其中較為公認(rèn)的是D-木糖代謝水平，該指標(biāo)可以衡量模型的吸收功能[8]。此外，血清淀粉酶也與消化功能關(guān)系密切?！八募酒⑼皇苄啊保饨∵\(yùn)與否很大程度上決定了人體是否健康，脾與人體免疫功能密切相關(guān)[9]，脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)的降低不僅直接表明脾家損傷模型小鼠的免疫功能降低，也間接說明了其淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)目的減少。實(shí)驗(yàn)表明，各模型組小鼠血清D-木糖水平和血清淀粉酶活性均下降，說明造模成功，脾虛小鼠存在消化功能低下的表現(xiàn)，以利血平與飲食失節(jié)組小鼠消化系統(tǒng)功能障礙突出。利血平組與苦寒瀉下組小鼠外周血的RBC、WBC、HGB顯著下降，說明利血平造模法和苦寒瀉下造模法對(duì)小鼠的血液質(zhì)量影響廣泛，而勞倦過度造模法對(duì)小鼠血液質(zhì)量的影響較小。利血平組和苦寒瀉下組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均下降非常顯著，說明利血平造模法和苦寒瀉下造模法對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有顯著影響。飲食失節(jié)組小鼠脾臟指數(shù)上升，可能是脾家損傷小鼠表現(xiàn)出的病理性的脾腫大。勞倦過度組小鼠則只有胸腺指顯著下降，說明其細(xì)胞免疫功能降低。飲食失節(jié)造模法和勞倦過度造模法只對(duì)動(dòng)物的部分免疫功能有影響。

脾主運(yùn)化為生命活動(dòng)提供能量，中醫(yī)脾的狀態(tài)影響生命活動(dòng)狀態(tài)。而線粒體為細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量，這與脾的功能在某種程度上是相似的。有學(xué)者[10]認(rèn)為脾主運(yùn)化就是營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體內(nèi)進(jìn)行的一系列氧化代謝所代表的“內(nèi)運(yùn)化”過程。線粒體功能與mtDNA的數(shù)量密切相關(guān)，mtDNA下降超過閾值則發(fā)生線粒體功能障礙，介導(dǎo)線粒體自噬或誘發(fā)細(xì)胞凋亡[11]。Pink1、Parkin是介導(dǎo)并啟動(dòng)線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除利血平組外，其他3種模型小鼠的mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)下降，說明模型小鼠存在線粒體功能異常，以飲食失節(jié)組小鼠線粒體損傷程度最重。在線粒體損傷的進(jìn)程中，mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)會(huì)先升高再降低，利血平組小鼠的mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)變化不顯著，可能是由于其線粒體損傷程度較輕，處于mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)變化的中間階段。除勞倦過度組和利血平組外，其他兩種模型小鼠的Pink1 mRNA水平下降，表明脾虛損傷小鼠存在線粒體自噬功能的抑制，損傷的線粒體無法被及時(shí)清除，線粒體疾病和細(xì)胞凋亡發(fā)生的概率增加。與對(duì)照組相比，除利血平組外，其他3種模型小鼠的Parkin mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)脾虛損傷主要影響Pink1 mRNA水平，因?yàn)镻ink1位于Parkin的上游，推測(cè)隨著脾虛損傷加重，模型小鼠的Parkin mRNA水平也將受到影響。與對(duì)照組相比，利血平組Parkin mRNA水平上升，可能是因?yàn)槔浇M小鼠存在線粒體損傷，但是線粒體自噬功能未受到影響，Parkin mRNA過表達(dá)以清除損傷線粒體，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

綜上，4種造模方法都可以在不同程度上造成脾虛損傷。脾虛的形成可能是飲食失節(jié)、過食寒涼、勞倦過度等多種復(fù)合因素導(dǎo)致的胃腸道消化吸收異常，進(jìn)而影響到人體循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，甚至線粒體異常，但是這些聯(lián)系的具體機(jī)制尚未闡明，有待于進(jìn)一步的研究。