李 凱，葉爾登，阿布都賽米·阿布都熱衣木，葉爾番，王 俊，李水學

(新疆維吾爾自治區(qū)兒童醫(yī)院泌尿外科,烏魯木齊 830000)

先天性腎盂輸尿管連接部狹窄（ureteropelvic junction obstruction，UPJO）是指尿液自腎臟分泌產生流入輸尿管時產生的部分性狹窄，可通過產前超聲發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率為0.2%[1]。隨著產前超聲的進步，UPJO 的產前檢出率得以提高。目前認為，UPJO 主要是由于患者胚胎發(fā)育時期腎盂輸尿管連接部狹窄引起尿液引流不暢導致大量的尿液潴留，進一步使腎盞擴張和腎盂內壓力增高，最終壓迫腎實質造成腎實質變薄和腎功能損傷[2]。盡管過去幾十年來對UPJO 從胚胎學、解剖學、形態(tài)學以及病理學等方面進行了大量研究，特別是其病因研究取得了一定進展，但其確切病因及治療原則與方法仍存在爭議[3]。

在輸尿管組織內存有多種類型的神經網絡，而這些神經組織可能與腎盂輸尿管的蠕動功能存在密切關[4]，UPJO 的腎盂輸尿管連接部Cajal間質細胞（in?terstitial cells of Cajal，ICC）明顯減少，可能為本病發(fā)病原因[5-6]。ICC 與神經傳導支配有關，它是慢波電位的起搏者和基本電節(jié)律的傳播者。輸尿管中的ICC研究表明，與胃腸道蠕動受ICC 控制一樣，輸尿管蠕動也與ICC 有關，并發(fā)現(xiàn)ICC 也分布于輸尿管的全長[7]。ICC 與平滑肌細胞之間、神經細胞之間可形成網絡連接，此種網絡結構的特點在其控制平滑肌的蠕動和介導神經信息傳導的功能中有重要作用[8]。在對UPJO 病因的進一步研究中發(fā)現(xiàn)，ICC 參與神經信號傳導并調控輸尿管肌層蠕動，其密度降低可能與UPJO 可導致尿液引流受阻有關[9]。自噬是細胞內一種重要的生物學過程，細胞內自噬的平衡對細胞正常生理功能的維持至關重要[10]。ICC 在UPJO 減少的機制和原因目前仍不清楚。本研究以ICC 在UPJO表型變化切入點，分析其參與輸尿管蠕動及自噬的機制，得出ICC 自噬在UPJO 中的發(fā)病作用及關系，為其今后的防治提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象隨機選擇新疆維吾爾自治區(qū)兒童醫(yī)院2020年1月－2021年1月初診為UPJO且入院行腎盂輸尿管成形術患者20 名，術中收取并保存腎盂輸尿管連接部組織標本，建立UPJO 標本庫。同期選擇年齡性別匹配，因腎臟腫瘤行腎切除腎盂輸尿管連接部組織的患者15例（排除腎盂輸尿管連接部狹窄，腫瘤患者組織學證實無侵犯）。建立UPJO 及對照組患者數據資料庫，記錄所有患者的臨床病歷資料，包括病理結果、影像學結果、化驗檢查結果等。研究得到新疆醫(yī)科大學醫(yī)院倫理委員會的批準，并獲得了所有參與者的書面知情同意。

1.2 納入和排除標準納入標準：最終術中證實為UPJO 組為腎盂輸尿管連接部狹窄，病理結果證實對照組腫瘤未侵犯腎盂輸尿管連接部；年齡在18 歲以下患者且配合治療，患者及家屬知情同意入組本臨床研究；無其他明顯基礎疾病影響患者生存健康狀況；無其它并發(fā)泌尿系畸形患者；患者為有效臨床隨訪者。排除標準：病理結果證實腫瘤侵犯腎盂輸尿管連接部；臨床失聯(lián)、失訪者；患者及其家長無法配合臨床檢查及治療者；家長拒絕入組研究者；同時存在其他部位腫瘤或嚴重疾病者；患者住院臨床資料缺失者。

1.3 取材及免疫組織化學手術沿縱行方向切取患者的腎盂輸尿管連接部組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm 厚的切片。然后，切片在二甲苯中脫蠟，用梯度乙醇重新水化，室溫干燥48 h 后置入4℃冰箱內保存，用酪氨酸激酶受體（tyrosine ki?nase receptor，c-kit）免疫組化染色，染色步驟均按試劑盒說明操作。抗體按1:100 稀釋。c-kit 免疫組化染色UPJO 30 例，對照組20 例，細胞胞漿內可見棕色顆粒狀物質者即為c-kit陽性細胞。

1.4 Masson染色石蠟切片脫蠟水化后，用Harris’s蘇木素染核10 min，水洗1 min，入Masson復合染色液染色10~20 min。以0.2% 醋酸水溶液速洗1~2 s。5.1%磷鉬酸處理5~8 min，不用水洗1%亮綠SF 染色2~4 min。快速用新鮮95%無水酒精分化兼脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 實時熒光定量核酸擴增檢測（qPCR）自噬相關基因變化使用TRIZOL 試劑從組織中提取總RNA，并使用光密度（260 nm和280 nm）測量RNA純度和濃度。然后，根據說明書，通過RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 將RNA 逆轉錄為cDNA。在ABI 7500 序列檢測系統(tǒng)中使用QuantiNova SYBR Green PCR 進行反應。所使用的的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0 軟件設計、合成，以管家基因AC?TIN 為內參，引物序列見表1。反應條件為：95℃初始熱活化5 min 后，95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸40 個循環(huán)。采用2-△△CT法分析目的基因在不同組間的表達差異。

表1 引物序列信息

1.6 免疫印跡法（Western blot）檢測在含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中裂解組織，BCA 試劑盒測定蛋白質濃度。取等量的總蛋白質在SDS-PAGE 上分離并轉移到PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與以下一抗在4℃下孵育過夜：P62 (1:1 000)、LC3I(1:1 000)、LC3II(1:500) 和β-actin(1:2 000)。用PBS 洗滌3 次，將膜與適當的二抗一起孵育。使用Image J 對蛋白質進行定量，并使用β-actin 進行標準化。

1.7 組織免疫熒光檢測切片用檸檬酸緩沖液處理并加入山羊血清以阻斷非特異性背景染色。將切片與包括LC3B(1:100)和c-kit(1:50)在內的一抗在4°C下孵育1 h。之后，切片用PBS 洗滌3 次并與二抗FITC（山羊抗小鼠，1:200）和TRITC (山羊抗兔，1:100)在37°C 下在黑暗中孵育90 min。切片再次用PBS 洗 滌，加 入600 μL 的Hoechst33258 染 液，室溫避光孵育10 min。洗滌完畢將玻片滴加抗熒光猝滅液封片，置于熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

2 結果

2.1 UPJO 患者ICC 數量及形態(tài)學觀察c-kit 染色結果表明，與對照組相比，ICC 在UPJO 連接部明顯減少（圖1A、1B）。Masson 染色顯示，與對照組相比，UPJO 連接部肌纖維明顯減少，膠原纖維增多（圖1C、1D）。對ICC核肌纖維數量進行統(tǒng)計，匯總分析顯示，與對照組相比，UPJO 患者的UPJ 處的ICC 和肌纖維密度均顯著降低，而膠原纖維的密度則顯著增加（P<0.01）。

圖1 UPJO患者ICC數量及形態(tài)學觀察

2.2 UPJO 患者中c-kit 和自噬相關蛋白LC3 的表達與對照組相比，UPJO 組c-kit 表達下降，c-kit 陽性的細胞中LC3表達升高（圖2）。

圖2 UPJO患者中c-kit和自噬相關蛋白LC3的表達

2.3 UPJO 患者ICC 和自噬小體變化在對照組中，ICC 呈紡錘形，細胞核較大，細胞質較少（圖3A）。自噬小體很少（圖3B）。然而，UPJO 患者中觀察到ICC超微結構的改變，以及細胞器變性或減少，甚至是空泡化(圖3C)。同時在UPJO 患者中觀察到ICC 自噬泡形成，ICC與周圍細胞之間的縫隙連接較少（圖3D）。

圖3 電鏡觀察UPJO患者中ICC和自噬小體變化（×20 000）

2.4 UPJO 患者中自噬相關基因變化qPCR 檢測自噬相關基因P62和LC3結果表明，與對照組相比，UP?JO組P62基因表達顯著降低（P<0.05），LC3基因表達升高（P<0.05），見圖4。

圖4 P62和LC3基因在UPJO患者中表達情況

2.5 UPJO 患者中自噬相關蛋白表達變化Western blot 法檢測組織中自噬相關蛋白P62 和LC3II/LC3I 的表達水平變化的結果顯示，與對照組相比，UPJO 組P62 蛋 白表達降 低，LC3II/LC3I 表達升高。見圖5。

圖5 P62、LC3I和LC3II蛋白在UPJO患者中表達

3 討論

UPJO 發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)在主要認為是由于胚胎發(fā)育時輸尿管近端發(fā)育異常引起[11]。胚胎第12周時，輸尿管口及中腎等完成了演變，形成最后位置。如果此時腎盂輸尿管連接部再通過程出現(xiàn)異常，如管化不完全，則會出現(xiàn)梗阻，可能是先天性腎盂輸尿管連接部狹窄引起腎積水的重要原因[12]。輸尿管ICC 中進行的研究證實，與胃腸道蠕動受ICC 控制一樣，輸尿管蠕動也與ICC 有關，且ICC 也分布于輸尿管的全長。本研究結果證實了ICC 在UPJO 連接部明顯減少，輸尿管固有層的病理生理變化是導致UPJO 的直接原因。Senol 等[13]發(fā)現(xiàn)UPJO 患者固有層的肌纖維減少，膠原纖維增多，考慮可能為梗阻原因，與本研究結果一致。輸尿管在胚胎發(fā)育期間由于近端缺血造成發(fā)育不良也會導致UPJO 發(fā)生[14]。UPJ 部ICC 密度降低與UPJO 發(fā)病有關，病理學檢查結果也證實正常兒童輸尿管連接處ICC 與內層縱行肌纖維平行，并與神經元關系密切，這提示ICC 參與神經信號傳導并調控輸尿管肌層蠕動[15]。

細胞內自噬的平衡對細胞正常生理功能的維持至關重要。一旦自噬的平衡遭到破壞就會引發(fā)多種疾病，如糖尿病、癌癥、神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生[16]。細胞正常生理狀態(tài)下自噬的活性比較低，一旦自噬被誘導后，參與自噬起始的相關蛋白會在一個特殊的部位組裝，形成自噬小體的前體[17]。具有明顯家族史的UPJO 患者可表現(xiàn)出常染色體顯性或隱性遺傳，符合單基因遺傳病的特征，可能與單個基因的突變有關[18]。通過UPJO 家系研究發(fā)現(xiàn)TBX18 基因突變與UPJO 發(fā)病關系密切[19]。自噬主要幫助機體適應代謝應激,在細胞減少和程序性細胞死亡的開始時變得過度。作為一種獨特的膜運輸形式，自噬過程中自噬體吞噬細胞器和細胞溶質大分子，并將其輸送到溶酶體進行降解[20]。LC3 是哺乳動物細胞中醇母ATG8基因的同源物,能靶向定位于自噬體膜,參與自噬的形成,LC3 分為I 型和于型,I 型常規(guī)表達、游離存在于胞質中。當自體吞噬發(fā)生時,I 型LC3 經泛素樣加工修飾過程與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合,形成II型LC3,II 型LC3 蛋白結合并始終位于胞內自噬體的膜上,其含量與自唯泡數量成正比。自噬通過LC3 鏈接胞漿內的P62 將散亂蛋白DVL2 募集到自噬體內進行降解[21]。本研究觀察到ICC 自噬泡形成，ICC 與周圍細胞之間的縫隙連接較少，同時發(fā)現(xiàn)P62蛋白表達降低，LC3II/LC3I 表達升高。本研究證明了ICC 自噬及縫隙連接蛋白的異常表達參與UPJO 疾病的進程，為UPJO患兒中ICC減少的機制研究奠定了基礎。