梁 靜，范 娜，王 瑤，劉 雯，居 敏，葉海燕

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院1 檢驗(yàn)科,2 輸血科,烏魯木齊 830002；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科,烏魯木齊 830011；4 新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院輸血科,新疆喀什 844000）

血小板輸注無(wú)效（platelet transfusion refractori?ness，PTR）發(fā)生率高達(dá)30%~70%[1-2]，是治療出血性疾病過(guò)程中常見(jiàn)的難治性臨床問(wèn)題[3-4]。非免疫因素引起的PTR 去除病因、對(duì)癥處理后可以明顯改善血小板的輸注療效，而免疫性PTR 機(jī)制復(fù)雜，是發(fā)生難治性PTR 的重要原因[5]。目前認(rèn)為血小板特異性抗原（human platelet antigens，HPA）基因多態(tài)性及抗體陽(yáng)性率與免疫性PTR 的產(chǎn)生密切相關(guān)，HPA 抗體引起的PTR 占免疫因素的10%~20%[6-8]，常見(jiàn)報(bào)道中多以單位點(diǎn)HPA 對(duì)PTR 的產(chǎn)生進(jìn)行分析，如中國(guó)人群中HPA-3、HPA-15 系統(tǒng)不配合率最高，歐美國(guó)家多由HPA-1a、HPA-5b、HPA-2b 抗體引起PTR 多見(jiàn)[9]。但單位點(diǎn)對(duì)復(fù)雜疾病的影響（主效應(yīng)）非常微弱，不能全面揭示兩者的關(guān)聯(lián)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，各種疾病中基因交互作用被相繼報(bào)道，但有關(guān)引起免疫性PTR 的HPA 基因間交互作用的研究尚缺乏[10]。本研究擬建立免疫性PTR 的HPA 基因交互作用預(yù)測(cè)模型，深入認(rèn)識(shí)免疫性PTR 的發(fā)病機(jī)制,探索HPA 基因交互作用在免疫性PTR 風(fēng)險(xiǎn)分析中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2019 年6 月－2020 年6 月新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院及新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院免疫性PTR 患者190 例作為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn):（1）輸注前血小板≤50×109/L；（2）血小板輸注無(wú)效（血小板回收率PPR）和輸注后血小板校正增加指數(shù)（CCI），CCI 判斷血小板輸注無(wú)效的標(biāo)準(zhǔn)為血小板輸注1 h 后的CCI<7 500 或輸注后24 h后的PPR<4 500；（3）血小板輸注量小于3個(gè)治療量，輸注次數(shù)低于3次；患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）抗-HIV 陽(yáng)性；（2）DIC；（3）敗血癥；（4）脾功能亢進(jìn)；（5）活動(dòng)性出血；（6）血容量不足需液體復(fù)蘇；（7）輸注其他血液制品；（8）住院期間服用兩性霉素B、萬(wàn)古霉素和免疫球蛋白；（9）不能配合完成本研究；同期收集50 例血小板輸注有效的患者作為對(duì)照組。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器人類血小板同種抗原HPA1-17 基因分型試劑盒（天津秀鵬），ABI9902PCR 擴(kuò)增儀（Thermo 公司）；2500 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）；BG-Power600i 常規(guī)電泳儀（北京百晶公司）。

1.3 HPA 基因分型滿足質(zhì)控要求的標(biāo)本嚴(yán)格按照人類血小板同種抗原HPA1-17（PCR-SSP 法）、Cab基因分型試劑盒說(shuō)明書上操作進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用多因子降維分析方法（gener?alized multifactor dimensionality reduction,GMDR）0.7軟件對(duì)HPA 系統(tǒng)基因分型交互作用建模進(jìn)行分析。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果的訓(xùn)練平衡準(zhǔn)確度、測(cè)試平衡準(zhǔn)確度、符號(hào)檢驗(yàn)P值及交叉驗(yàn)證一致性等參數(shù)評(píng)估HPA 基因分型交互作用在輸注血小板患者中發(fā)生PTR 的風(fēng)險(xiǎn)。HPA 系統(tǒng)基因-基因交互作用模型圖每個(gè)方格代表一種基因-基因的交互組合，方格顏色的深淺與該基因-基因組合對(duì)疾病的風(fēng)險(xiǎn)性呈正相關(guān)。方格顏色越深，表示該組合發(fā)生PTR 風(fēng)險(xiǎn)越高。每個(gè)方格中，左邊條帶是組合的正向得分，右邊條帶是組合的負(fù)向得分，正向得分越高，表明該組合發(fā)生PTR風(fēng)險(xiǎn)也越高。

2 結(jié)果

2.1 HPA 基因 分型HPA1~6，15 共7 個(gè)基 因位點(diǎn)頻率分布結(jié)果顯示：僅HPA-3 位點(diǎn)等位基因頻率分布在病例組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 HPA基因位點(diǎn)不同等位基因在對(duì)照組和病例組中的分布

2.2 GMDR分析HPA基因系統(tǒng)分型交互作用模型

2.2.1 HPA不同分型交互作用模型 HPA基因分型1階-9 階交互作用模型中第3 階（HPA-3,5,15）模型測(cè)試準(zhǔn)確度最大（testing accuracy:0.625）,交叉驗(yàn)證一致性最好（CVC=8/10），該組合提供了最高驗(yàn)證樣本準(zhǔn)確度與最佳交叉驗(yàn)證一致性，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001) ，為最佳模型。模型第4 階（HPA-2,3,5,15）及第5 階（HPA-2,3,5,6,15）模型次之，P<0.05。表明第3、4、5階在對(duì)照組和病例組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），第1、2、6、7、8、9 階模型準(zhǔn)確度大，但是交叉驗(yàn)證一致性較差，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 HPA不同分型交互作用模型

2.2.2 HPA系統(tǒng)基因-基因交互作用模型圖（1）3階[HPA-3 HPA-5 HPA-15]三因子交互作用模型圖。PTR 患者攜帶HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab，該組合的方塊顏色最深，正向得分最高為5.2，該組合發(fā)生PTR 風(fēng)險(xiǎn)高，見(jiàn)圖1。（2）4 階[HPA-2 HPA-3 HPA-5 HPA-15]四因子交互作用模型圖。PTR 患者攜帶HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab、HPA-2aa 的組合方塊顏色最深，正向得分最高為5.2，該組合發(fā)生PTR風(fēng)險(xiǎn)高，見(jiàn)圖2。（3）5 階[HPA-2 HPA-3 HPA-5 HAP-6 HPA-15]五因子交互作用模型圖。PTR 患者攜帶HPA-3aa 基因型、HPA-5aa 基因型、HPA-15ab 基因型、HPA-2aa 基因型及HPA-6 aa，該組合的方塊顏色最深，正向得分最高為5.2，該組合發(fā)生PTR 風(fēng)險(xiǎn)高，見(jiàn)圖3。

圖1 HPA-3 HPA-5 HPA-15三因子交互作用模型圖

圖2 HPA-2 HPA-3 HPA-5 HPA-15四因子交互作用模型圖

圖3 HPA-2 HPA-3 HPA-5 HAP-6 HPA-15五因子交互作用模型圖

3 討論

血小板輸注是治療因血小板減少引起的出血性疾病的有效治療措施，但并不是所有患者輸入血小板后都能達(dá)到預(yù)期的治療效果，其中一個(gè)重要的原因是患者在多次輸血后機(jī)體可產(chǎn)生HPA 抗體、HLAⅠ類抗體、血小板膜糖蛋白GPⅣ（CD36）等血小板抗體，導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效（PTR）[11-12]。如何預(yù)防和避免免疫性PTR發(fā)生是目前臨床上輸注血小板治療的難題。

HPA 作為血小板糖蛋白攜帶的一類特異性抗原，具有單核苷酸多態(tài)性，因此HPA 也呈多態(tài)性分布，目前研究多支持PTR 與HPA 等位基因的多態(tài)性有關(guān)[13]，研究表明PTR 患者HPA-2、HPA-3、HPA-15呈明顯的多態(tài)性分布，HPA-3、HPA-15 的雜合度最高[14-15]。趙鳳春等[16]研究顯示HPA-3 基因多態(tài)性與PTR患者有顯著相關(guān)性，為導(dǎo)致PTR的影響因素。但目前大多關(guān)于免疫性PTR 的研究忽略了HPA 基因-基因交互作用對(duì)PTR 產(chǎn)生的影響。研究表明在復(fù)雜性疾病的病因研究中易感基因單核苷酸位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析發(fā)揮著重要作用[17-18]，并且復(fù)雜性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)由多個(gè)基因共同承擔(dān)，而基因-基因交互作用已經(jīng)被認(rèn)為是復(fù)雜性疾病基本的遺傳學(xué)模式之一[19-20]。

本研究對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行HPA1-17 基因檢測(cè)，結(jié)果顯示：病例組和對(duì)照組人群的HPA 基因型頻率數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，均未發(fā)生偏離（P>0.05），其中HPA7a-14a、16a、17a 呈單態(tài)性，未檢出相應(yīng)HPA-b 等位基因或b 基因頻率極低；研究發(fā)現(xiàn)HPA-3a 基因位點(diǎn)與發(fā)生免疫性PTR 具有關(guān)聯(lián)性，且攜帶HPA-5a 等位基因的個(gè)體可能更容易罹患PTR。進(jìn)一步通過(guò)GMDR 分析建立HPA 不同分型交互作用模型，探究HPA 基因交互作用與免疫性PTR 的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示：九階HPA基因交互作用模型中，第1階（HPA-3）、2 階（HPA-3,15）、6 階（HPA-1,2,3,5,6,15）、7 階（HPA-1,2,3,4 ,5,6,15）、8 階（HPA-1,2,3,4,5,6,15,7）、9 階（HPA-1,2,3 ,4 ,5 ,6 ,15,7,8）模型測(cè)試準(zhǔn)確度及交叉一致性顯示對(duì)免疫性PTR 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而第3 階（HPA-3,5,15）、4 階（HPA-2,3,5,15）、5階（HPA-2,3,5,6,15）存在交互作用且與PTR 發(fā)生密切相關(guān)，其中第3 階（HPA-3,5,15）模型測(cè)試準(zhǔn)確度最大0.625，為血小板輸注患者中評(píng)估免疫性PTR 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的最佳模型。第1、2、6、7、8、9 階HPA 基因交互模型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故不作繼續(xù)研究，僅對(duì)第3、4、5 階HPA 基因交互模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過(guò)HPA 基因系統(tǒng)模型圖顯示，第3階模型PTR 患者攜帶HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab，發(fā)生PTR 風(fēng)險(xiǎn)高，第5階模型在第3階模型基礎(chǔ)上攜帶HPA-2 aa或HPA-6aa 基因，對(duì)免疫性PTR 的發(fā)生有重要推進(jìn)作用，HPA-2 aa、HPA-6aa 基因可能協(xié)同增強(qiáng)了免疫性PTR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究是對(duì)免疫性PTR 患者基因-基因交互作用模型構(gòu)建及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的有益嘗試，為深入了解免疫性PTR 的發(fā)生機(jī)制及臨床預(yù)防提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。利用HPA 基因交互作用模型提前對(duì)免疫性PTR進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析及預(yù)判，篩選合適的血小板制品進(jìn)行配型，盡量避免PTR發(fā)生。