周思江， 寧 宗， 譚興領(lǐng)， 楊 霞

作為一種快速滅生性除草劑，聯(lián)吡啶類除草劑因具有高效除草、不影響植物根部及地下莖等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。但以百草枯(paraquat，PQ)為主的聯(lián)吡啶類除草劑對(duì)人畜卻有極強(qiáng)的毒性，且中毒后缺乏特效解毒劑，因此，中毒后病死率極高[1]。為減少中毒事件的發(fā)生，2016年7月國(guó)家農(nóng)業(yè)部明確規(guī)定禁止使用百草枯水劑，但同屬于聯(lián)吡啶類除草劑的敵草快(diquat，DQ)因具有百草枯相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)而迅速在我國(guó)占據(jù)市場(chǎng)，成為繼百草枯、草甘膦之后第三大滅生性除草劑，因此，中毒事件時(shí)有發(fā)生，發(fā)病率及病死率逐年升高[2-3]。百草枯和敵草快具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為減少臨床誤漏診，本課題組前期研究結(jié)果[4]發(fā)現(xiàn)，采用高效液相色譜儀檢測(cè)驗(yàn)證市場(chǎng)銷售的所謂“敵草快”實(shí)乃百草枯，臨床需警惕與敵草快中毒伴隨的百草枯中毒。因此，如何快速、有效地鑒別敵草快與百草枯中毒，在臨床迫在眉睫。

作為一種還原劑，碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原法具有操作簡(jiǎn)便、檢驗(yàn)快速等特點(diǎn)，被臨床上廣泛應(yīng)用于百草枯中毒的鑒別。敵草快與百草枯同屬于聯(lián)吡啶類除草劑，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，相關(guān)研究采用碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原法可以對(duì)尿液標(biāo)本中敵草快進(jìn)行快速判斷[5]。但部分慢性腎衰竭無(wú)尿患者及由于樣品從采集到檢測(cè)的時(shí)間或保存的方式不同可能會(huì)發(fā)生偏差，鑒于此，本研究從采用血液標(biāo)本的角度出發(fā)，首先予以高效液相色譜法檢測(cè)敵草快與百草枯種類，進(jìn)而借助于碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原法判斷是否可以快速檢測(cè)、評(píng)估、驗(yàn)證敵草快和百草枯中毒的可靠性，從而更好地服務(wù)于臨床。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 藥品與試劑 98%敵草快標(biāo)準(zhǔn)品及98%百草枯標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于麥克林公司；20%敵草快溶液(產(chǎn)自山東潤(rùn)揚(yáng)化學(xué)有限公司)及20%百草枯溶液(產(chǎn)自肇慶市真格生物科技有限公司)均由廣西化工產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)站贈(zèng)送；500 g/瓶連二亞硫酸鈉(分析純)購(gòu)于麥克林公司；500 g/瓶碳酸氫鈉(分析純)購(gòu)于天津市永大化學(xué)試劑有限公司；庚烷磺酸鈉購(gòu)于北京百靈威科技有限公司；磷酸及乙腈均購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；甲醇購(gòu)于瑞典歐普森色譜試劑公司；二氯甲烷購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.1.2 主要儀器 LC-20AB高效液相色譜儀、SPD-20A UV-VIS Detector高靈敏度紫外可見光可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、CTO-20AC Column Oven色譜柱恒溫箱、SIL-20AC Autosampler自動(dòng)進(jìn)樣器LC-20AB Solvent Delivery Unit溶液輸送泵及Ver 1.25 Workstation工作站(均購(gòu)于日本島津公司)；灌胃器；離心機(jī)；電子天平；移液槍。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 家兔購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。倫理審查編號(hào)：202011008。

1.2方法

1.2.1 高效液相色譜法 對(duì)家兔灌胃用的20%敵草快、20%百草枯溶液進(jìn)行定性及定量鑒定。

1.2.1.1 測(cè)定條件 色譜柱: ZORBAX300SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng):309 nm敵草快，258 nm百草枯；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相庚磺酸鈉3.64 g加入900 mL水，加16 mL磷酸，用8.0 mL三乙胺調(diào)pH=2加水至1000 mL，用0.45 μm濾膜過濾，超聲10 min。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 精密稱取敵草快、百草枯標(biāo)準(zhǔn)品4.0 mg，分別用超純水溶解并定量配制成質(zhì)量濃度為4000 μg/mL。用超純水逐級(jí)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL的百草枯和敵草快標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.2.1.3 樣品處理 分別將20%敵草快溶液和20%百草枯溶液用超純水稀釋10 000倍后，經(jīng)過濾后各取1 mL。

1.2.2 體外血清實(shí)驗(yàn) 稱取3 mg敵草快標(biāo)準(zhǔn)品和3 mg百草枯標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶于3 mL超純水中，使其濃度為1 mg/mL敵草快溶液A和百草枯溶液B。將敵草快溶液A和百草枯溶液B分別稀釋至濃度為4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、20 μg/mL、35 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL各10管(1 mL/管)，分別標(biāo)記為1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A及1B、2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B。取1名健康志愿者血清20 mL，在以上每管中分別加入1 mL健康志愿者血清。對(duì)照組為分別為2管1 mL健康志愿者血清加入1 mL超純水，標(biāo)記為uA及uB。向uA、1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A及uB、1B、2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B分別加0.4 g碳酸氫鈉搖勻溶解后，加0.2 g碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉搖勻，待1 min充分顯色后即對(duì)比并拍照，20 min后再次觀察顏色變化并拍照。

1.2.3 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 家兔隨機(jī)分成兩組(每組3只)1組為敵草快組，編號(hào)為a、b、c；2組為百草枯組，編號(hào)為d、e、f。分別在灌胃前從家兔耳緣動(dòng)脈取血3 mL，3000 r/min,25 ℃,15 min下離心后取血清，分別標(biāo)記為ua、ub、uc、ud、ue、uf。敵草快組家兔按預(yù)實(shí)驗(yàn)2 mL/kg量，分別給家兔a、b、c灌200 g/L敵草快溶液，按灌胃后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h及7 d分別從耳緣動(dòng)脈取血3 mL，3000 r/min, 25 ℃,15 min離心后取血清，分別標(biāo)記為1a、2a、3a、4a、5a、6a、7a，1b、2b、3b、4b、5b、6b、7b，1c、2c、3c、4c、5c、6c、7c。百草枯組家兔按2 mL/kg量分別給家兔d、e、f灌200 g/L百草枯溶液，按灌胃后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d分別從耳緣動(dòng)脈取血3 mL，3000 r/min,25 ℃,15 min下離心后取血清1 mL，分別標(biāo)記為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，1e、2e、3e、4e、5e、6e、7e，1f、2f、3f、4f、5f、6f、7f。向以上每管分別加0.4 g碳酸氫鈉搖勻溶解后，加0.2 g連二亞硫酸鈉搖勻，待1 min充分顯色后即對(duì)比并拍照，20 min后再次觀察顏色變化并拍照。

2 結(jié)果

2.1高效液相色譜法檢測(cè)敵草快及百草枯濃度 在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下,敵草快的最大吸收波長(zhǎng)為309 nm,百草枯的最大吸收波長(zhǎng)為258 nm ,分別選擇309 nm與258 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，2個(gè)峰的峰形良好，敵草訣標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.56×10-5X+0.585，r=0.9999；百草枯標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.08×10-5X-0.279，r=0.9999。20%敵草快溶液和20%百草枯溶液樣品的色譜圖分別為圖1、2。20%敵草快溶液的濃度為7.34×104μg/mL，20%百草枯溶液的濃度為3.85×104μg/mL。

圖1 高效液相色譜法檢測(cè)20%敵草快溶液稀釋10 000倍的色譜圖

圖2 高效液相色譜法檢測(cè)20%百草枯溶液稀釋10 000倍的色譜圖

2.2體外實(shí)驗(yàn) 經(jīng)碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原顯色，健康人血清中加入敵草快溶液后顯色為綠色，而加入百草枯溶液后顯色為藍(lán)色，并隨溶液濃度的增加而顏色加深。敵草快溶液顯色不穩(wěn)定，20 min后顯色變淺接近于正常對(duì)照組顏色，百草枯溶液顯色較穩(wěn)定，20 min后顏色未變，仍為藍(lán)色(見圖3、4)。

圖3 不同濃度敵草快血清經(jīng)碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原后1 min及20 min的顏色對(duì)比

2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 制備敵草快中毒動(dòng)物模型，家兔a血清經(jīng)碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原后，中毒后1 h的血清呈綠色，而中毒6 h及更長(zhǎng)時(shí)間后的血清顏色無(wú)明顯變化，顏色與正常對(duì)照組接近(見圖5)，家兔b、家兔c重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相同。另一方面，制備百草枯中毒動(dòng)物模型，百草枯中毒家兔血清經(jīng)碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原后，中毒后1 h的血清呈藍(lán)色，而中毒6 h及更長(zhǎng)時(shí)間后的血清無(wú)明顯變化，顏色與正常對(duì)照組接近(見圖6)，家兔e、家兔f重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相同。

圖4 不同濃度百草枯血清經(jīng)碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原后1 min及20 min的顏色對(duì)比

注：ub為正常對(duì)照管；1 b～7 b為不同時(shí)間點(diǎn)

注：ue為正常對(duì)照管；1 e～7 e為不同時(shí)間點(diǎn)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，百草枯進(jìn)入機(jī)體后易被肺組織吸收且可在肺內(nèi)大量聚集，由此產(chǎn)生的肺部損傷最為明顯，雖然采用先進(jìn)的生命支持手段及科學(xué)的設(shè)備可以降低百草枯中毒患者死于急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙綜合征的比例，但是仍不能阻擋百草枯中毒后急性肺損傷和肺纖維化的發(fā)生，以及降低百草枯中毒患者死于肺纖維化的比例[6]。作為百草枯的“孿生兄弟”敵草快，毒理作用與百草枯十分相似，但毒性明顯低于百草枯。雖說(shuō)目前無(wú)明確依據(jù)證實(shí)敵草快中毒后在肺內(nèi)蓄積，出現(xiàn)類似百草枯中毒的快速肺纖維化，但肺臟依舊是敵草快中毒后損傷重要的靶器官之一。此外，成份標(biāo)注為敵草快的商品中摻雜百草枯亦時(shí)有發(fā)生，由于目前敵草快及百草枯臨床毒物檢測(cè)尚未普及，臨床中毒的診斷主要根據(jù)患者提供的病史。因此，如何快速有效地判斷除草劑是敵草快還是百草枯已成為近幾年共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題，對(duì)臨床救治工作及判斷預(yù)后具有重要意義。

目前，高效液相色譜法是檢測(cè)敵草快和百草枯最常用的實(shí)驗(yàn)方法，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，但價(jià)格昂貴，標(biāo)本處理復(fù)雜，操作技術(shù)要求高[7]。而敵草快及百草枯中毒多發(fā)生在農(nóng)村，基層醫(yī)院醫(yī)療資源匱乏，因此應(yīng)用受到一定程度的限制，無(wú)法在基層醫(yī)院進(jìn)行推廣應(yīng)用。為避免后續(xù)體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)敵草快中毒伴隨的百草枯中毒現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)首先采用高效液相色譜法檢測(cè)、鑒別購(gòu)買的除草劑的種類是敵草快還是百草枯，結(jié)果得到可靠的色譜圖用于后續(xù)研究。

由于高效液相色譜法難以在基層醫(yī)院應(yīng)用，因此，急需在基層醫(yī)院開展快速、有效的毒物鑒別方法。碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原法具有操作簡(jiǎn)便、檢驗(yàn)快速等特點(diǎn)，被臨床上廣泛應(yīng)用于除草劑的鑒別，目前臨床上多采用中毒患者尿液標(biāo)本進(jìn)行快速檢測(cè)[8]。但尿液在體外容易被空氣氧化而發(fā)生顏色變化，一定程度上影響了鑒別檢測(cè)中利用顏色而進(jìn)行觀察，此外，有些患者中毒后很快就會(huì)出現(xiàn)無(wú)尿的癥狀，無(wú)法采集到尿液樣本。本研究采用碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原法，通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)對(duì)敵草快和百草枯中毒后的血清進(jìn)行鑒別檢測(cè)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原顯色，健康人血清中加入不同濃度的敵草快，1 min左右溶液顯色為綠色，并隨敵草快濃度增高顏色逐漸變深，20 min后綠色變淺，接近于正常對(duì)照組顏色。而健康人血清中加入不同濃度的百草枯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶液顯色為藍(lán)色，且隨溶液濃度的增加而顏色加深，20 min后顏色仍為藍(lán)色。為了解上述實(shí)驗(yàn)的時(shí)效性，本研究進(jìn)一步采用灌胃的方式模擬臨床敵草快及百草枯中毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中毒后1 h為碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原法鑒別敵草快及百草枯最敏感的時(shí)期，可以快速、有效地幫助醫(yī)務(wù)人員，特別是院前急救人員及基層醫(yī)務(wù)人員對(duì)除草劑敵草快及百草枯中毒進(jìn)行早期鑒別。但中毒 6 h及更長(zhǎng)時(shí)間后的血清顏色無(wú)明顯變化，與正常對(duì)照組接近，這與高效液相色譜法檢測(cè)的血藥濃度代謝情況不甚相符，可能是敵草快在體內(nèi)產(chǎn)生了代謝，降低了其濃度，也可能與本實(shí)驗(yàn)研究采用的敵草快劑量有關(guān)，其中的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)研究仍存在一定的挑戰(zhàn)，如患者同時(shí)發(fā)生敵草快和百草枯中毒的情況，該方法在鑒別上存在困難，建議應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步鑒別。

綜上所述，隨著除草劑中毒發(fā)生率的增加，醫(yī)務(wù)人員需要一種有效、便捷、快速的檢測(cè)方法以鑒定、區(qū)分中毒毒物的種類，及時(shí)評(píng)估患者的中毒情況，進(jìn)一步用于指導(dǎo)制定個(gè)體化的治療方案與措施。采用碳酸氫鈉-連二亞硫酸鈉還原法能在敵草快和百草枯急性中毒血清中的鑒別，且在中毒后1 h內(nèi)即可快速、有效地鑒別這兩種除草劑，是一種具有廣泛應(yīng)用前景和便捷的檢測(cè)方法，對(duì)基層醫(yī)院具有十分重要的意義。