李 翠， 洪麗萍

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是常見腦血管病變，致殘率高，預(yù)后差[1-2]。目前，臨床多采用磁共振成像(MRI)、CT診斷ACI，但其對ACI早期的診斷價值并不高[3]。因此，尋找可早期診斷ACI、評估ACI患者預(yù)后的標志物，對早期診治ACI、改善ACI患者預(yù)后甚是關(guān)鍵。研究認為，ACI病變過程除與動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)、炎癥有關(guān)外，還與微小RNA(microRNA，miRNA)異常表達等有關(guān)[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-200c-3p(microRNA-200c-3p，miR-200c-3p)在缺血性腦卒中呈高表達，且其具有診斷缺血性腦卒中的潛在價值[6]。而秦慧兵等[7]發(fā)現(xiàn)，老年ACI患者氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins, ox-LDL)水平較高，ox-LDL有望成為判定ACI患者病情、評估頸動脈粥樣硬化程度的輔助指標。此外，朱偉軍等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-200c可調(diào)節(jié)ox-LDL誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細胞損傷。因此，推測miR-200c可能與ACI發(fā)病過程、預(yù)后及ox-LDL相關(guān)?；诖?，本研究通過測定miR-200c在ACI患者血清中的表達水平，旨在分析其與ox-LDL、ACI患者預(yù)后的關(guān)系，及其早期診斷ACI的價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取2017年11月至2020年12月本院診治的167例ACI患者進行研究(ACI組)，男87例，女80例。并選取同期167例體檢健康者進行對照研究(對照組)，男90例，女77例。另外，收集所有ACI患者吸煙、飲酒、收縮壓、舒張壓、冠心病史、糖尿病史、高血壓史、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(national institutes of health stroke scale，NIHSS)評分、發(fā)病至治療時間等資料。

納入標準：①患者符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[9]中有關(guān)ACI的診斷標準，經(jīng)CT/MRI證實；②患者發(fā)病至入院<24 h，首次發(fā)??；③本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準，患者自愿參與。排除標準：①合并急慢性感染、腦出血、自身免疫性疾病者；②服用抗炎藥物者；③合并肝、腎、肺、心功能不全者；④近3個月內(nèi)有手術(shù)、外傷史者。本研究經(jīng)我院倫理會批準[批號：2017臨審第(003)號]。

1.2方法

1.2.1 治療方法及預(yù)后情況 入院后ACI患者進行常規(guī)心電監(jiān)護，并糾正血壓、血糖，抗凝、吸氧、抗血小板聚集、脫水等對癥治療。對ACI患者隨訪3個月，采用生活能力評分量表(modified rankin scale，MRS)評分評估其預(yù)后情況，以MRS評分≤2分為預(yù)后良好(預(yù)后良好組，122例)，以>2分為預(yù)后不良(預(yù)后不良組，45例)。

1.2.2 樣本收集 收集ACI患者入院后治療前及健康者體檢當(dāng)日空腹外周靜脈血，靜置26～30 min，分離血清(4800 r/min離心5 min)，分裝，保存于-70 ℃冰箱。

1.2.3 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)法測定血清miR-200c表達水平 冰上解凍血清樣本，以miRNeasy Serum/Plasma Kit(217184，德國Qiagen公司)抽提總RNA，且在抽提總RNA時加cel-miR-39作為內(nèi)參對照，紫外分光光度計(NanoDrop One，美國Thermo Fisher Scientific公司)測定RNA濃度、純度。之后以miScript Reverse Transcription Kit、miScript SYBR Green PCR Kit(218061、218076，德國Qiagen公司)合成cDNA并進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR儀(Rotor-Gene Q，德國Qiagen公司)程序設(shè)定：97 ℃ 7 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共40個循環(huán)。cel-miR-39的引物序列：F為5′-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3′，R為5′-CCAGTGCGT-GTCGTGGAGTC-3′；miR-200c的引物序列：F為5′-GTCTTACCCAGCAGTGT-3′，R為5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′。以2-△△Ct法分析血清miR-200c相對表達量。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測定血清ox-LDL水平 利用人ox-LDL ELISA試劑盒(JKSW70064，上海晶抗生物工程有限公司)配制ox-LDL的標準樣品溶液，并解凍血清，以酶標儀(Chromate 4300，美國Awareness公司)測定ox-LDL標準品溶液、血清在450 nm處的吸光度，繪制ox-LDL的標準品回歸曲線，結(jié)合ox-LDL的標準回歸方程，計算血清ox-LDL水平。

2 結(jié)果

2.1ACI組、對照組血清miR-200c、ox-LDL水平比較 與對照組比較，ACI組患者血清miR-200c、ox-LDL水平均升高(P<0.05)。見表1。

表1 ACI組、對照組血清miR-200c、ox-LDL水平比較

2.2ACI患者血清miR-200c水平與ox-LDL的相關(guān)性 Pearson相關(guān)法分析顯示，ACI患者血清miR-200c水平與ox-LDL呈正相關(guān)(r=0.544，P<0.05)。

2.3血清miR-200c、ox-LDL水平對ACI的早期診斷價值 ROC曲線顯示，血清miR-200c早期診斷ACI的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.867(95%CI0.826～0.907)，截斷值為1.44，約登指數(shù)為0.658，敏感度、特異度分別為77.2%、88.6%；血清ox-LDL早期診斷ACI的AUC為0.850(95%CI0.807～0.893)，截斷值為431.09 mg/L，約登指數(shù)為0.641，敏感度、特異度分別為74.3%、89.8%；兩者聯(lián)合早期診斷ACI的AUC為0.936(95%CI0.908～0.964)，約登指數(shù)為0.772，其敏感度、特異度分別為91.0%、86.2%。見圖1。

注：ACI為急性腦梗死；miR-200c為微小RNA-200c；ox-LDL為氧化型低密度脂蛋白

2.4不同預(yù)后ACI患者的一般資料及血清miR-200c、ox-LDL水平比較 與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組ACI患者年齡較大(P<0.05)，發(fā)病至治療時間較長(P<0.05)，血清miR-200c、ox-LDL水平和NIHSS評分較高(P<0.05)，男/女比例、吸煙、飲酒、收縮壓、舒張壓、冠心病史、糖尿病史、高血壓史比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同預(yù)后ACI患者的一般資料及血清miR-200c、ox-LDL水平比較

2.5Logistic回歸分析ACI患者預(yù)后的影響因素 以ACI患者是否預(yù)后不良為因變量(是=1，否=0)，以上述P<0.05的指標和密切相關(guān)臨床指標為自變量進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，年齡、NIHSS評分、miR-200c、ox-LDL、發(fā)病至治療時間是影響ACI患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 ACI患者預(yù)后影響因素的Logistic回歸分析

2.6血清miR-200c、ox-LDL水平對ACI患者預(yù)后的評估價值 ROC曲線顯示，血清miR-200c評估ACI患者預(yù)后的AUC為0.874(95%CI0.810～0.938)，截斷值為2.13，約登指數(shù)為0.649，敏感度、特異度分別為75.6%、89.3%；ox-LDL評估ACI患者預(yù)后的AUC為0.868(95%CI0.788～0.948)，截斷值為582.06 mg/L，約登指數(shù)為0.671，敏感度、特異度分別為77.8%、89.3%；兩者聯(lián)合評估ACI患者預(yù)后的AUC為0.957(95%CI0.930～0.984)，約登指數(shù)為0.776，敏感度、特異度分別為95.6%、82.0%。見圖2。

注：ACI為急性腦梗死；miR-200c為微小RNA-200c；ox-LDL為氧化型低密度脂蛋白

3 討論

ACI是因腦血管閉塞，進而引發(fā)腦缺血缺氧造成腦損傷的一種疾病，可造成神經(jīng)功能障礙，甚至引發(fā)死亡[10-11]。因此，尋找與ACI病理變化相關(guān)，且可早期診斷ACI、評估ACI患者預(yù)后的指標，對給予合適干預(yù)、改善ACI患者生存狀況有積極意義。

miRNA可調(diào)控氧化應(yīng)激、AS、炎癥反應(yīng)過程，與急性心肌梗死、ACI等密切相關(guān)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c作為miRNA成員之一，在膠質(zhì)瘤中表達失調(diào)，miR-200c可能通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程進而影響膠質(zhì)瘤病理過程，其可能是膠質(zhì)瘤的治療靶點[14]。另外，miR-200c在子癇前期中表達水平升高，其與子癇前期患者病變程度及妊娠結(jié)局相關(guān)，miR-200c可作為診斷子癇前期的潛在指標[15]。以上研究表明，miR-200c表達異常與血管異常類病變等有關(guān)。本研究中ACI患者血清miR-200c表達水平較高，且其早期診斷ACI的AUC為0.867，當(dāng)血清miR-200c相對表達量>1.44時，ACI發(fā)生風(fēng)險較大，提示miR-200c水平升高可能與ACI發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且血清miR-200c水平可早期診斷ACI。推測miR-200c可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響血管炎癥反應(yīng)，進而在ACI中發(fā)揮作用，其具體機制有待深入研究證實。另外，本研究中預(yù)后不良的ACI患者血清miR-200c水平高于預(yù)后良好者，且其預(yù)測ACI患者預(yù)后的AUC為0.874，當(dāng)血清miR-200c相對表達量>2.13時，ACI患者發(fā)生不良預(yù)后幾率較高，提示miR-200c可能與ACI患者預(yù)后密切相關(guān)，且測定血清miR-200c水平有助于臨床評估ACI患者預(yù)后情況。

ox-LDL是一種促炎蛋白，其可損傷內(nèi)皮細胞，使其分解脂質(zhì)的能力下降，導(dǎo)致多余脂質(zhì)在內(nèi)皮細胞上沉積，促使單核細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)變，之后轉(zhuǎn)變成泡沫細胞，引發(fā)AS；且ox-LDL可通過激活巨噬細胞等，促使機體產(chǎn)生大量炎性因子，激活炎癥反應(yīng)，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而影響ACI病變過程[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL在ACI患者中呈高水平，經(jīng)靜脈溶栓治療后，ox-LDL水平降低，其可能在ACI的氧化應(yīng)激過程中起作用[18]。此外，蔡文燦等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ACI患者血清ox-LDL水平較高，其有望成為評估ACI患者預(yù)后和疾病嚴重程度的輔助指標。本研究中ox-LDL在ACI患者血清中水平較高，與蔡文燦等[19]的研究一致，且預(yù)后不良的ACI患者血清ox-LDL水平高于預(yù)后良好者，提示ox-LDL與ACI病理發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，推測ox-LDL可能通過破壞血管內(nèi)皮細胞，促進脂質(zhì)沉積、泡沫細胞形成，加快AS病理發(fā)展，或ox-LDL通過促使白細胞介素-2等炎性因子生存，觸發(fā)炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而影響ACI病變進程。此外，本研究中血清ox-LDL早期診斷ACI、評估ACI患者預(yù)后的AUC分別為0.850、0.868，與蔡文燦等[19]研究ox-LDL評估ACI患者預(yù)后的價值相近，血清ox-LDL>431.09 mg/L時ACI發(fā)生幾率較高，血清ox-LDL>582.06 mg/L時ACI患者發(fā)生不良預(yù)后風(fēng)險較大，提示ox-LDL可能對早期診斷ACI、評估ACI患者預(yù)后有一定臨床價值，ox-LDL可作為早期診斷ACI、評估ACI患者預(yù)后的潛在指標。

既往研究顯示，miR-200c在ox-LDL損傷的人主動脈內(nèi)皮細胞中呈高表達[8]，故本研究探討了ACI患者血清miR-200c與ox-LDL的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-200c與ox-LDL呈正相關(guān)，提示miR-200c、ox-LDL可能共同影響ACI病理變化，但具體機制需結(jié)合基礎(chǔ)實驗加以證實。本研究顯示，血清miR-200c、ox-LDL水平及NIHSS評分升高，年齡較大，發(fā)病至治療時間延長均會增加ACI患者發(fā)生不良預(yù)后幾率，及時監(jiān)控miR-200c、ox-LDL等指標有助于及時評估ACI患者預(yù)后情況。此外，本研究中血清miR-200c、ox-LDL聯(lián)合早期診斷ACI的AUC為0.936，敏感度為91.0%，高于兩者單獨預(yù)測，同時特異度可達86.2%，而且miR-200c、ox-LDL聯(lián)合評估ACI患者預(yù)后的AUC為0.957，敏感度為95.6%，特異度為82.0%，提示miR-200c、ox-LDL聯(lián)合可提高對ACI早期診斷、ACI患者預(yù)后評估的價值，為臨床早期診斷ACI、評估ACI患者預(yù)后提供可靠參考。

綜上所述，miR-200c在ACI患者中呈高表達，與ox-LDL呈正相關(guān)，可作為早期診斷ACI、評估ACI患者預(yù)后的輔助指標，且其與ox-LDL聯(lián)合可更有效地早期診斷、評估ACI患者預(yù)后。但本研究未深入探究miR-200c在ACI中的機制，且研究樣本較少，后期需從多方面進行深入研究。