袁濤，劉文杰，辛志敏，宋蕊，王麗，李薇，王曉杰，高秀霞，王樹玉，劉英

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學科，北京 100026)

人卵巢顆粒細胞(granulosa cells，GCs)圍繞于卵母細胞周圍，其在不同階段產(chǎn)生類固醇激素和生長因子，以旁分泌的方式調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育[1]。除此之外，卵巢GCs凋亡與卵泡閉鎖密切相關(guān)[2]。隨著不孕患者日益增多，在輔助生殖治療中，提高獲取卵子的質(zhì)量成為重點和難點。對卵巢GCs進行體外培養(yǎng)，進而對其增殖、凋亡等特點進行分析，可以為臨床診療中提高卵子質(zhì)量提供新的思路。目前人們對人卵巢GCs體外培養(yǎng)的研究較少，GCs在體外能否進行連續(xù)傳代、傳代后是否保持其特性等仍不確定，有待進一步的研究探討。因此，本研究采用密度梯度離心法和紅細胞裂解法分離人卵巢GCs，并進行體外培養(yǎng)及連續(xù)傳代，觀察GCs的生長特性。

材料和方法

一、研究對象

人卵巢GCs、人卵泡液來源于首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學科行輔助生殖技術(shù)治療的不孕患者(共30例)。

納入標準：年齡20～40歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)18～30 kg/m2。排除標準：子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤；多囊卵巢綜合征(PCOS)；卵巢惡性腫瘤；卵巢功能低下或者卵巢早衰；患有慢性疾病、遺傳??；患有梅毒、乙肝、HIV等傳染性疾病。

本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，同時獲得患者的知情同意。

二、主要試劑

DMEM培養(yǎng)液和PBS緩沖液(Gibco，美國)；胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)；0.25% EDTA-胰蛋白酶(Sigma，美國)；淋巴細胞分離液(天津灝洋生物)；紅細胞裂解液(北京索萊寶科技)；卵泡刺激素受體(FSHR)抗體(Proteintech，美國)。

三、研究方法

1.卵泡液的收集及GCs原代培養(yǎng)：收集行控制性促排卵患者經(jīng)陰道穿刺取卵時的卵泡液，1 500 r/min離心5 min，上清液(即卵泡液)收集儲存在-20℃?zhèn)溆?，沉淀物即為GCs、紅細胞和白細胞的混合物。將含有少量卵泡液的沉淀物吹打混勻后，平均分成兩組，分別采用以下兩種方法從沉淀物中分離GCs：(1)密度梯度離心法：將沉淀物緩慢加于3倍體積淋巴細胞分離液液面上，3 000 r/min離心10 min，離心后吸取上層白色層(即GCs層)，PBS洗滌2次。(2)紅細胞裂解法：沉淀物上加入3倍體積紅細胞裂解液，放于37℃中裂解5 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清后加入PBS洗滌2次。

用GCs完全培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS)重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為2×105個/ml，接種于培養(yǎng)皿中。置于37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。

2.GCs的傳代和擴增：GCs密度達到80%～90%時，棄上清，PBS洗滌2次，加入0.25% EDTA-胰蛋白酶，37℃消化3 min。用等體積培養(yǎng)液終止消化后，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌兩次。棄上清后用培養(yǎng)液重懸細胞，按1∶3比例接種于培養(yǎng)皿，鏡下觀察細胞密度，隔天更換培養(yǎng)液。連續(xù)傳代培養(yǎng)至第8代。

3.原代及傳代后GCs生長曲線繪制：將兩種方法分離得到的GCs以1.5×105/孔的密度均勻接種于24孔板，每3天換液。分別于培養(yǎng)的第1、3、5、7、9、11天(D1、D3、D5、D7、D9、D11)同一時間取3孔細胞，用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化后計數(shù)，取平均值。以培養(yǎng)天數(shù)為橫軸，細胞量為縱軸描繪生長曲線。

4.GCs的鑒定：采用免疫熒光染色檢測FSHR的表達。GCs均勻接種于爬片，72 h后用PBS緩沖液洗3 min×3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液3 min×3次；0.1% Triton處理20 min，PBS緩沖液3 min×3次；3% FBS孵育30 min；FSHR兔多克隆抗體(1∶200)孵育，4℃過夜；PBS緩沖液洗3 min×3次，熒光標記的二抗(1∶200)常溫避光孵育1 h；PBS緩沖液洗3 min×3次，用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

用PBS代替一抗作為陰性對照。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。組間比較采用獨立樣本t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、兩種分離方法所獲細胞量比較

密度梯度離心法獲得的細胞數(shù)為(3.1±1.1)×106/ml，紅細胞裂解法為(5.8±1.2)×106/ml。紅細胞裂解法可獲得較密度梯度離心法更多的GCs(P<0.05)。

二、兩種分離方法所獲GCs原代培養(yǎng)生長形態(tài)比較

1.密度梯度離心法：用密度梯度離心法分離的GCs在接種后24 h顯微鏡下觀察貼壁率約達70%，細胞呈單層貼壁生長，形狀為多角形，伸出偽足相互連接，聚集成片；細胞折光性好，核大且圓，細胞質(zhì)的顆粒均勻且豐富；在培養(yǎng)的第7天，細胞出現(xiàn)短梭形改變。當細胞生長至10 d以后，顯微鏡下觀察并測量發(fā)現(xiàn)細胞和細胞核變小，細胞變?yōu)闄E圓形/圓形，折光性降低，細胞間隙增寬，部分細胞開始脫壁死亡，懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)(圖1A)。

2.紅細胞裂解法：用紅細胞裂解法分離的GCs在接種后24 h顯微鏡下觀察細胞貼壁率約達50%，形狀與密度梯度離心法分離的GCs相似，但用此方法分離的細胞多為單個細胞或少量細胞聚集，成片生長的情況較少。與密度梯度離心法相似，細胞在10 d左右發(fā)生退化(圖1B)。

A：密度梯度離心法；B：紅細胞裂解法。

三、兩種分離方法所獲GCs原代及第1代傳代(Passage 1，P1)培養(yǎng)增殖情況比較

兩種方法分離的原代GCs在第3～5天為快速增殖期，第7天細胞增殖達到頂峰，之后因接觸抑制細胞生長進入平臺期，第10天左右細胞開始衰老、退化，活細胞量下降。每個時間點密度梯度離心法處理的細胞量均顯著高于紅細胞裂解法(P<0.05)(圖2A)。

兩種方法分離的GCs第1代傳代培養(yǎng)(P1 GCs)在第1～5天為快速增殖期，第7天細胞增殖達到頂峰，之后進入平臺期。與原代細胞相似，P1 GCs也在10 d左右發(fā)生衰老和退化，細胞量減少。密度梯度離心法組P1 GCs細胞量在每個時間點均略高于紅細胞裂解法組，但差異尚無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2B)。

A：原代培養(yǎng)；B：P1培養(yǎng)。與紅細胞裂解法組相同時間點比較，*P<0.05。

四、兩種分離方法所獲GCs連續(xù)傳代情況比較

兩種方法分離的GCs均可進行連續(xù)傳代，鏡下觀察兩組細胞形態(tài)無明顯差異，均逐漸由上皮樣向成纖維樣轉(zhuǎn)變。P1 GCs呈典型的上皮樣形態(tài)，細胞緊密相連，形態(tài)不規(guī)則或呈多角形，中間有圓形核；P2 GCs仍以上皮樣形態(tài)為主，但出現(xiàn)成纖維狀的細胞，呈短梭形或三角形，胞質(zhì)向外伸出凸起；P3 GCs以成纖維狀為主，并在之后傳代的過程中(P4、P5)，細胞保持成纖維狀(圖3)。

A：密度梯度離心法；B：紅細胞裂解法；P0：原代培養(yǎng)；P1～5：傳代培養(yǎng)第1～5代。

五、GCs的免疫熒光鑒定結(jié)果

免疫熒光檢測GCs的FSHR表達情況。結(jié)果顯示FSHR在P0、P1、P6 GCs胞質(zhì)內(nèi)均陽性表達，胞質(zhì)呈紅染；胞核呈藍染(圖4)。

P0：原代GCs；P1、P6：第1、6代傳代GCs；FSHR：FSH受體；DAPI：細胞核4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色；Merge：合并；Control：陰性對照；比例尺50 μm。

討 論

GCs緊密排列在卵母細胞的周圍，通過間隙連接與卵母細胞相互作用。GCs向卵母細胞提供營養(yǎng)成分，為卵母細胞提供適宜的微生態(tài)環(huán)境[3]。同時，GCs通過間隙連接向卵母細胞傳遞信息，在卵母細胞發(fā)育及成熟過程中起重要作用[4]。另外，卵母細胞分泌的因子也可通過旁分泌和自分泌作用促進GCs增殖和分化[3]。

有文獻報道，干細胞誘導形成的GCs與卵母細胞共培養(yǎng)，會包圍在卵母細胞周圍，形成一體[5]。GCs表面有FSHR、黃體生成素(LH)受體和雌激素受體等。FSH結(jié)合GCs上的受體后，促進卵泡募集、卵母細胞生長、發(fā)育及成熟[6]。LH在排卵前達到峰值，結(jié)合GCs上的受體后，促進卵丘的膨脹以及與卵泡GCs的分離，從而誘發(fā)排卵。膽固醇可轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，孕烯醇酮是雌、孕、雄激素的前身。卵泡期，GCs分泌孕酮的能力非常有限；排卵后，卵泡內(nèi)血管增生，GCs可獲得大量膽固醇，合成大量孕激素。雌激素的生成需要卵泡膜細胞和GCs共同參與[7]。LH可促進膜細胞生成睪酮，然后經(jīng)基底膜傳遞至GCs，在FSH的促進下，經(jīng)芳香化酶催化成雌激素[4]。在體外分離培養(yǎng)的GCs，如果培養(yǎng)液內(nèi)未添加雄激素，則只能停留在孕酮生成的階段，而分泌極少量的雌激素。GCs的功能障礙可導致人類卵巢功能紊亂，如PCOS、卵巢早衰或卵巢功能不全等[8]。GCs在女性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，對其進行體外培養(yǎng)擴增可用于潛在功能研究和臨床應(yīng)用。

在取卵過程中獲得的卵泡液中除單個的和塊狀的GCs外還含有紅細胞和白細胞，選擇合理有效的方法將GCs從細胞混合物中分離出來，可為GCs相關(guān)研究提供幫助。本研究中，我們比較了采用密度梯度離心法及紅細胞裂解法兩種方法分離GCs所得的細胞量、貼壁時間、原代及傳代后細胞的生長曲線及連續(xù)傳代的情況。由于在離心法過程中，部分GCs會與紅細胞聚集成團沉在離心管底，因此用密度梯度離心法分離的細胞量小于紅細胞裂解法，此結(jié)果與之前的研究[9]一致。而在貼壁情況及原代細胞生長情況的比較中，密度梯度離心法均優(yōu)于紅細胞裂解法，可能是由于裂解液對GCs有傷害且裂解后的細胞碎片影響GCs貼壁及生長[9]。傳代后在每個時間點紅細胞裂解法分離的GCs細胞量均小于密度梯度離心法，但差異尚無統(tǒng)計學意義，考慮是因為在換液和傳代的過程中去除了細胞碎片的影響。在細胞的連續(xù)傳代中，兩種方法分離的GCs形態(tài)上未表現(xiàn)出明顯差異，均在P2出現(xiàn)成纖維狀形態(tài)的細胞，在后續(xù)的傳代過程中成纖維狀細胞逐漸成為主要的細胞群。提示雖然密度梯度離心法獲得的細胞量較少，但細胞的生長情況優(yōu)于紅細胞裂解法，可作為GCs首選的分離方法。

黃素化的GCs被認為是終末分化狀態(tài)，在排卵幾天后就不可避免地發(fā)生凋亡[10]，無法長時間在體外培養(yǎng)，導致對GCs的研究受阻。在本研究中，原代培養(yǎng)的GCs在2～5 d快速增殖，7 d左右達頂峰，10 d左右發(fā)生退化現(xiàn)象，與劉玉霞等[11]的研究結(jié)果相似。

有研究表明在培養(yǎng)基中添加白細胞抑制因子可使GCs在體外長時間培養(yǎng)，但其主要特征如FSHR和p450-芳香化酶的表達逐漸消失[12]。目前對人卵巢GCs傳代的研究很少，在周小丹等[9]的研究中，傳代后的GCs貼壁數(shù)目少、細胞狀態(tài)差，不適合體外細胞實驗。而在我們的實驗中，連續(xù)傳代的GCs貼壁率高、增殖快、細胞狀態(tài)佳，并且我們對傳代后的GCs進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)細胞傳至第6代時FSHR仍陽性表達，這可能與我們的處理方法有關(guān)系。選擇合適的處理方法對建立一個有效而穩(wěn)定的GCs培養(yǎng)模型非常重要，在分離培養(yǎng)GCs的過程中，本實驗室的經(jīng)驗總結(jié)如下：(1)取材：穿刺取卵時卵泡注意不要碰到卵泡外膜和卵巢表面血管，避免卵泡液中含有太多紅細胞以及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生；取材后要及時培養(yǎng)GCs，如不能及時處理應(yīng)及時放于4℃冰箱，并且最長不超過24 h。長時間放于4℃冰箱的細胞不貼壁，且時間越久越容易造成污染。(2)分離：與用淋巴細胞分離液梯度離心法相比，紅細胞裂解法能更好地去除紅細胞，但同時會對GCs造成傷害，裂解后的殘渣可能影響GCs貼壁；使用淋巴細胞分離液離心后，許多紅細胞與GCs聚集成團一起浮于GCs表面，較大的團則向下沉淀，故應(yīng)在加入淋巴細胞分離液之前將細胞充分吹打分離；分離時淋巴細胞分離液與細胞懸液至少達到3∶1，否則離心后細胞仍懸浮于卵泡液中，離心效果差；離心時，轉(zhuǎn)速要達到或稍低于3 000 r/min，轉(zhuǎn)速太低則GCs與紅細胞無法分離，導致二者一同沉降在離心管底，而轉(zhuǎn)速太高會損害細胞，接種時細胞碎片多，影響貼壁。(3)傳代：傳代前1日換液可使細胞在傳代時保持良好狀態(tài)；傳代時，胰酶消化時間不宜過長，應(yīng)保持在3 min左右，看到大片細胞飄起則應(yīng)及時終止消化。

GCs是女性卵巢內(nèi)唯一可表達FSHR的細胞，在胞膜和胞漿內(nèi)均表達，所以FSHR是鑒定GCs的主要標志物之一。FSHR對于卵巢中的卵泡生長和排卵至關(guān)重要。GCs中的FSHR以卵泡生長階段依賴性方式表達。FSHR在GCs中的表達隨著健康卵泡的增長而增加，而在閉鎖卵泡中則下降[10]。FSHR最初在原始或初級卵泡中檢測不到，而在后期小竇卵泡中可觀察到，且之后持續(xù)增加至排卵前階段。FSHR在GCs中的表達被精確調(diào)節(jié)以誘導正常卵泡形成[13]。只有少數(shù)選定的卵泡獲得FSHR表達后呈促性腺激素依賴性生長，而大多數(shù)卵泡保持靜止。在卵巢中，F(xiàn)SHR的表達受FSH和激活素誘導的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后機制的直接調(diào)控，卵泡抑素則通過其對激活素的影響間接調(diào)控FSHR[14]。FSH與GCs上的FSHR特異性結(jié)合，進而上調(diào)GCs的FSHR mRNA的水平，促進GCs上的FSHR的表達，增加GCs的增殖和各類激素的分泌，最終促進卵泡的生長以及卵母細胞的發(fā)育成熟[15]。FSHR的表達決定了FSH作用的靶點和程度，最終決定了GCs對激素的反應(yīng)情況。FSH信號隨時間變化，從而調(diào)節(jié)卵泡生長和卵母細胞成熟過程中細胞增殖和分化所需的轉(zhuǎn)錄及代謝活動。FSHR突變可導致卵巢早衰、卵巢過度刺激綜合征和不育癥[8]。有研究報道在不育女性中有許多自然發(fā)生的FSHR基因失活突變。FSHR的低表達可能是卵巢對促性腺激素刺激反應(yīng)差的原因，提示FSHR在卵巢反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[16]。在本研究中，原代和傳代的GCs均可表達FSHR，從某種程度上說明傳代后其功能特性并未發(fā)生較大改變，故本方法培養(yǎng)的GCs可用于其相關(guān)的體外研究。

綜上，運用合理的分離培養(yǎng)方法，人卵巢GCs不僅可在體外進行培養(yǎng)，還可成功進行連續(xù)傳代，且傳代后仍可保持GCs形態(tài)、增殖能力和功能特性。