卞廣利，徐艷梅，郝麗娟，苗會(huì)娟，王春霞，高燕霞

（1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊 050200 ； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

尼群地平為二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑［1-3］，由拜耳公司研發(fā)，于1985 年4 月在德國(guó)上市［4］，可用于高血壓、充血性心力衰竭以及冠心病等疾病的治療［5-7］。尼群地平具有起效迅速、藥效穩(wěn)定以及副作用小等優(yōu)點(diǎn)［8-9］，其制劑尼群地平片已被廣泛應(yīng)用于臨床治療。藥品中雜質(zhì)的含量對(duì)于臨床治療的療效及副作用影響較大，且原料藥物的質(zhì)量是影響制劑品質(zhì)的主要因素［10］，因此需對(duì)原料藥物中的雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，減少藥物引起的副作用，保證藥物的療效。

關(guān)于尼群地平有關(guān)物質(zhì)的控制，我國(guó)藥典目前僅對(duì)其中雜質(zhì)A 的測(cè)定方法進(jìn)行了規(guī)定［11］，尚無(wú)雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C 的測(cè)定方法，亟需完善其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的方法。筆者采用尼群地平原料藥為研究對(duì)象，通過參照國(guó)內(nèi)外藥典及相關(guān)資料［12-15］，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了簡(jiǎn)便、快捷的高效液相色譜法用于尼群地平原料藥中雜質(zhì)A、B、C 的含量測(cè)定，為尼群地平原料藥的質(zhì)量控制提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AD 型，配備二極管陣列檢測(cè)器（DAD），日本島津公司。

電子天平：XS105 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

尼群地平對(duì)照品：含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為100%，批號(hào)為100585-201705，中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。

尼群地平雜質(zhì)對(duì)照品：雜質(zhì)A、B、C 的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為98.0%、99.0%、98.4%，批號(hào)分別為35696、92.01.08.02、140607，英國(guó)LGC 公司。

四氫呋喃、乙腈：均為色譜純，德國(guó)默克公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBOX Eclipse XDB C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司]，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃-水（體積比為20∶24∶56）；洗脫方式：等度洗脫；流量：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 溶液的配制

供試品溶液：精密稱取尼群地平原料藥約20 mg 于10 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 四氫呋喃溶解，用色譜流動(dòng)相定容至標(biāo)線，搖勻，即得。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱定尼群地平、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C 對(duì)照品適量分別置于10 mL 容量瓶中，分別加入2.5 mL 四氫呋喃溶解，用流動(dòng)相稀釋定容至標(biāo)線，配制成尼群地平、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C的質(zhì)量濃度分別為1.021、1.016、1.024、0.989 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存。

雜質(zhì)定位溶液：精密量取雜質(zhì)A、B、C 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，依次用色譜流動(dòng)相定容至標(biāo)線，搖勻，配制成雜質(zhì)A、B、C 質(zhì)量濃度分別為40.64、40.96、39.56 μg/mL 的雜質(zhì)定位溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：依次精密量取尼群地平、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至標(biāo)線，配制成尼群地平、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C 的質(zhì)量濃度分別為10.21、10.16、10.24、9.89 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃避光保存。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密量取0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、10 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋定容至標(biāo)線，配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃避光保存。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度見表1。

表1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度 μg/mL

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別對(duì)尼群地平及雜質(zhì)A、B、C 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)，尼群地平及雜質(zhì)A、B、C 的最大吸收均在235 nm 附近，故選擇235 nm 進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 雜質(zhì)定位及分離度

取1.3 中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、雜質(zhì)定位溶液及供試品溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)各雜質(zhì)進(jìn)行定位。雜質(zhì)定位溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、及供試品溶液色譜圖分別見圖1、圖2 和圖3。

圖1 3 種雜質(zhì)定位溶液色譜圖

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖

圖3 供試品溶液色譜圖

樣品中尼群地平與各雜質(zhì)色譜峰互不干擾，分離度結(jié)果列于表2。由表2 可知，主峰與相鄰雜質(zhì)、各雜質(zhì)間的分離度均大于1.5，各成分分離度良好，專屬性良好，表明該法可準(zhǔn)確測(cè)定雜質(zhì)含量。

表2 尼群地平與已知雜質(zhì)的定位及分離試驗(yàn)結(jié)果

2.3 破壞試驗(yàn)

精密稱取尼群地平原料約20 mg，分別置于5只10 mL 容量瓶中，依次進(jìn)行酸、堿、氧化、高溫、光照破壞，按照1.2 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察各雜質(zhì)含量變化及分離情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，尼群地平原料藥在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及高溫條件下穩(wěn)定，在強(qiáng)氧化條件較穩(wěn)定，在光照條件下不穩(wěn)定，需避光操作。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

在1.2 色譜條件下對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以尼群地平及各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，信噪比為3 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限；信噪比為10 時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。3 種雜質(zhì)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限結(jié)果見表3。由表3 可知，3 種雜質(zhì)在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.152～0.171 ng，定量限為0.494～0.512 ng。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一批尼群地平原料，按1.3 方法平行制備6 份供試品，按照1.2 色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，6 份樣品中雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C均有檢出，各雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，表明該方法具有良好的精密度。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取9 份約20 mg 尼群地平原料藥于10 mL 容量瓶中，分別加入2.5 mL 四氫呋喃溶解，再分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.8、1.0、1.2 mL 各3 份，加入流動(dòng)相定容至標(biāo)線，搖勻。按1.2 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，雜質(zhì)A、B、C 的平均回收率分別為92.38%、92.74%、93.07%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，可有效測(cè)定尼群地平中的雜質(zhì)含量。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取1 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL 容量瓶中，加入2.5 mL 四氫呋喃溶解，使用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻，于室溫下避光儲(chǔ)存，在1.2 色譜條件下，分別于0、1、2、3、4 h 后進(jìn)行測(cè)定，考察各雜質(zhì)峰面積的變化，并計(jì)算不同時(shí)間峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表6 可知，溶液在放置4 h 后，3 種雜質(zhì)的含量無(wú)明顯變化，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%，表明混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫下避光儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。

2.8 耐受性試驗(yàn)

選取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將流量由1.0 mL/min 分別調(diào)整為0.8、1.2 mL/min，將柱溫在40 ℃的基礎(chǔ)上分別調(diào)整為35、45 ℃，選擇AgelaVenusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Thermo BDS HYPERSIL C1（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱進(jìn)行耐受性試驗(yàn)，對(duì)各雜質(zhì)之間的分離情況及含量進(jìn)行考察。結(jié)果表明，色譜參數(shù)的微調(diào)不影響尼群地平中有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定，出峰順序未發(fā)生改變。主峰與各雜質(zhì)峰分離良好，各雜質(zhì)含量無(wú)明顯變化。建立的方法耐受性良好，可有效用于尼群地平中雜質(zhì)A、B、C 的含量測(cè)定。

2.9 樣品測(cè)定

取尼群地平原料藥20 mg（批號(hào)為20000972-B33201204），按照1.3 方法制備供試品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用回歸法計(jì)算各雜質(zhì)含量，計(jì)算結(jié)果顯示，雜質(zhì)A 未檢出，雜質(zhì)B 含量為0.47%，雜質(zhì)C 含量為0.19%。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了高效液相色譜法對(duì)尼群地平中雜質(zhì)A、B、C 進(jìn)行含量測(cè)定，該方法具有較好的重復(fù)性，操作簡(jiǎn)單且迅速。該方法對(duì)尼群地平中有關(guān)物質(zhì)的控制進(jìn)行了補(bǔ)充，不僅可為尼群地平質(zhì)量控制提供參考，更可通過對(duì)原料藥的控制保證藥物臨床應(yīng)用的安全、有效，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。