廖澤榮，周瑾艷，2，花秀兵，陳瑞歡，王世超，許俊斌，2，陳玲，2，黃彥捷，2

[1.廣東省計量科學(xué)研究院，華南國家計量測試中心，廣州 510405；2.廣東省質(zhì)量監(jiān)督環(huán)境化學(xué)分析儀器檢驗站（廣州），廣州 510405]

近年來，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平不斷提高，農(nóng)產(chǎn)品特別是果蔬的產(chǎn)量逐年增加，在種植過程中為防治農(nóng)作物病蟲害往往使用大量農(nóng)藥，易導(dǎo)致果蔬中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，從而引起社會各界的廣泛關(guān)注［1］。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是自上世紀(jì)七十年代以來發(fā)展較快的一類農(nóng)藥，具有高效、廣譜、低毒和可生物降解等特性，它主要通過改變作用對象的神經(jīng)膜結(jié)構(gòu)功能，擾亂昆蟲神經(jīng)的正常生理活動，使昆蟲由興奮、痙攣到麻痹死亡［2］。氯菊酯屬于不含α-氰基的I 型擬除蟲菊酯［3］，又名二氯苯醚菊酯、百滅靈、神殺等，分子式為C21H20Cl2O3，相對分子質(zhì)量為391.30。目前市面上的主流農(nóng)藥大多含有氯菊酯［3］。目前尚無文獻報道氯菊酯在毒理學(xué)方面有嚴(yán)重的問題，但其使用量逐年遞增，仍可能對人體和環(huán)境造成潛在的危害［4］。隨著氯菊酯的檢測需求增加，以及氯菊酯相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不斷完善，建立配套的氯菊酯檢測方法可充分滿足市場檢測和質(zhì)控需求，因此準(zhǔn)確測定農(nóng)藥中的氯菊酯含量具有重要的意義。

目前，針對擬除蟲菊酯的檢測方法主要有氣相色譜法［5-8］、氣相色譜-質(zhì)譜法［9-10］、液相色譜-質(zhì)譜法［11］、光化學(xué)熒光法［12］，但是目前尚無文獻報道將分析方法與氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相結(jié)合來建立成套、便捷的農(nóng)藥中氯菊酯檢測方法。筆者結(jié)合氯菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和反相液相色譜分析法對農(nóng)藥中的氯菊酯展開研究［13-14］，分別對檢測波長、流動相及其流量、柱溫、進樣量進行優(yōu)化，建立了便捷的測量方法，其精密度、準(zhǔn)確度均可滿足食品、藥品、日化、環(huán)境保護及化工產(chǎn)品中氯菊酯研究和檢測的需要，有望用于校準(zhǔn)、分析方法評價，為統(tǒng)一相關(guān)量值發(fā)揮應(yīng)有的作用。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters e2695-2998 型，美國沃特世公司。

微孔濾膜：有機系，孔徑為0.22 μm，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

容量瓶：100 mL，A 級，天津市天科玻璃儀器制造有限公司。

可調(diào)移液器：量程為100～1 000 μL，德國艾本德有限公司。

電子天平：CPA225D 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯集團。

甲醇：色譜級，美國默克集團。

氯菊酯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為99.6%，相對擴展不確定度為0.3%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) 060549，中國計量科學(xué)研究院。

順式氯菊酯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為99.7%，擴展不確定度為0.8%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) 061097，中國計量科學(xué)研究院。

反式氯菊酯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)為99.8%，擴展不確定度為0.5%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) 061098，中國計量科學(xué)研究院。

所用儀器設(shè)備和玻璃器皿均經(jīng)過法定計量機構(gòu)檢定或校準(zhǔn)確保滿足要求。

果蔬農(nóng)藥原液樣品：市售。

1.2 樣品預(yù)處理

將市售含有氯菊酯的果蔬農(nóng)藥原液用0.22 μm有機系微孔濾膜過濾［15-16］，將濾液（空白農(nóng)藥溶液）保存至4 ℃冰箱中，待用。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：RD-C18反相色譜柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，中譜科技（福州）有限公司]；流動相：甲醇-水溶液（體積比為9∶1）；流量：0.8 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL。

1.4 溶液配制

氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取10.36 mg 氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.6%）于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容、搖勻，配制成質(zhì)量濃度約為200 μg/mL 的氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

氯菊酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液于容量瓶，用甲醇逐級稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為1、10、25、50、100、200 μg/mL 的氯菊酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

順式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取20.13 mg 順式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.7%）于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容、搖勻，配制成質(zhì)量濃度為200.70 μg/mL 的順式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

順式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取5 mL 順式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容、搖勻，配制成質(zhì)量濃度為100.35 μg/mL 的順式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

反式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取9.96 mg 反式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（99.8%）于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容、搖勻，配制成質(zhì)量濃度約為198.80 μg/mL 的反式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

反式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取5 mL 反式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容、搖勻，配制成質(zhì)量濃度為99.4 μg/mL 的反式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長

采用C18反相色譜柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，中譜科技（福州）有限公司]，首先通過對氯菊酯樣品進行3D 全波長掃描［13-14］，初步確定檢測波長在200～250 nm 之間時出峰效果較好。考察檢測波長分別為200、210、220、230、240、250 nm 時氯菊酯的出峰情況見圖1。由圖1 可知，當(dāng)檢測波長為200 nm 時，出現(xiàn)肩峰；當(dāng)檢測波長為250 nm 時，基線波動比較明顯。

圖1 不同檢測波長時氯菊酯的出峰情況

進一步考察檢測波長分別為210、220、230、240 nm 時氯菊酯的分離度（見表1）。按《中國藥典》規(guī)定，分離度應(yīng)大于1.5，考慮到波長為230 nm 時響應(yīng)值更高，因此檢測波長選擇為230 nm。

表1 不同波長下氯菊酯的分離度

2.1.2 流動相種類

對比甲醇-水溶液（體積比為9∶1）和乙腈-水溶液（體積比為9∶1）作為流動相時氯菊酯的分離度。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇-水溶液（體積比為9∶1）為流動相時，氯菊酯的分離度為1.73，符合《中國藥典》的規(guī)定，因此選擇甲醇-水溶液作為流動相。

2.1.3 流動相比例

考察不同體積比的甲醇-水溶液作為流動相時氯菊酯的分離度見表2。由表2 可知，當(dāng)流動相為甲醇時，氯菊酯的兩個異構(gòu)體色譜峰無法完全分離；當(dāng)甲醇-水溶液體積比分別為85∶15、90∶10 時，二者分離度均大于《中國藥典》中規(guī)定的1.5。

表2 不同流動相體積比下氯菊酯的分離度

當(dāng)流動相甲醇-水溶液體積比分別85∶15、90∶10 時氯菊酯的出峰情況見圖2。由圖2 可知，當(dāng)甲醇-水溶液體積比為85∶15 時，氯菊酯保留時間較長（大于15 min），因此選取甲醇-水的體積比為90∶10 作為流動相。

圖2 甲醇-水溶液不同體積比時氯菊酯的出峰情況

2.1.4 流量

比較流量在0.8～1.1 mL/min 范圍內(nèi)氯菊酯兩個峰的分離度見表3。由表3 可知，不同流量下氯菊酯兩個異構(gòu)體色譜峰的分離度均大于1.5，當(dāng)流量為0.8 mL/min 時氯菊酯兩個峰的分離度更好，且隨流量加快雜質(zhì)的檢測情況沒有明顯變化，因此選擇流量為0.8 mL/min。

表3 不同流量下氯菊酯的分離度

2.1.5 測試溫度

分別比較30、35、40 ℃3 種柱溫下氯菊酯的分離度（見表4）和出峰情況（見圖3）。由表4 可知，不同柱溫條件下氯菊酯的分離度均大于1.5。由圖3 可知，隨著柱溫的升高，氯菊酯的出峰時間變短。綜合考慮，選擇柱溫為35 ℃。

表4 不同溫度下氯菊酯的分離度

圖3 不同柱溫條件下氯菊酯的出峰情況

2.1.6 進樣體積

分別對比1、5、10、20 μL 的進樣體積下氯菊酯的出峰情況。取3 瓶相同濃度的氯菊酯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并標(biāo)記瓶號1～3，依次測試進樣體積分別為1、5、10、20 μL 的情況，每瓶按照1、2、3，2、3、1，3、2、1的順序重復(fù)測定3 次，測定結(jié)果見表5。由表5 可知，不同進樣體積下的統(tǒng)計量F值均小于均勻性檢驗臨界值F0.05(5.14)，當(dāng)進樣體積分別為10、20 μL 時，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯小于進樣1、5 μL，且進樣10 μL 的F值遠小于進樣20 μL 的F值，因此選擇進樣體積為10 μL。

表5 不同進樣體積下氯菊酯測定結(jié)果（n=3）

2.2 線性方程與檢出限

在1.3 儀器工作條件下，對氯菊酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，以氯菊酯質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，氯菊酯的質(zhì)量濃度在1～200 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=36.59×106x+34.84×103，相關(guān)系數(shù)為1.000。

在1.3 儀器工作條件下，分別測定順式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和反式氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，計算不同濃度下信號值與噪音值（取基線較為平穩(wěn)時，0.5 min 內(nèi)基線最大值與最小值的差值）的比例S/N，直至S/N 為3 時，取該濃度作為該法檢出限，計算得順式氯菊酯和反式氯菊酯的檢出限均為0.50 μg/mL。

2.3 加標(biāo)回收試驗

分別移取1 mL 經(jīng)0.22 μm 有機系濾膜過濾的農(nóng)藥濾液于3 只100 mL 容量瓶中；分別稱取2.01、10.54、53.36 mg 氯菊酯純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別轉(zhuǎn)移至上述3 只容量瓶中，用甲醇定容、搖勻，配制成3 種不同濃度的加標(biāo)工作溶液，在1.3 儀器工作條件進行測定，計算加標(biāo)回收率，測定結(jié)果見表6。由表6可知，加標(biāo)回收率為98.60%～100.70%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表6 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.4 精密度試驗

分別稱取6 份1.0 mg 的氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于6只10 mL 容量瓶中，用甲醇定容、搖勻，配制成6 份0.1 mg/mL 甲醇中氯菊酯溶液，在1.3 儀器工作條件進行測定，試驗結(jié)果見表7。由表7 可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%，表明該方法具有較好的精密度。

表7 精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了反相高效液相色譜法測定農(nóng)藥中氯菊酯含量的分析方法，分別對檢測波長、流動相、流量、柱溫、進樣量進行了優(yōu)化。該方法操作簡便、可用于農(nóng)藥中氯菊酯的快速檢測。