顧龍龍 梁璇 黃霞 單妍 范戎

三七為五加科植物三七的干燥根，主產(chǎn)于云南、廣西及四川等地，其味甘、微苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有散瘀止血、消腫止痛的功效[1-2]，是我國珍貴的特產(chǎn)藥材和常用中藥。國內(nèi)外多年來對三七的研究，主要集中在水溶性皂苷成分[3]，三七中的許多其他的成分，如三七多糖類、三七素、黃酮、揮發(fā)油、氨基酸及各種微量元素等[4]，隨著研究手段和分離技術(shù)的不斷發(fā)展也被分離出來，具有重要的藥用價值[5]。為了最大限度地利用和節(jié)約三七資源，本實驗在前期實驗研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將提取皂苷過程中產(chǎn)生的大量三七渣和三七廢液充分利用，分離出3種三七提取物，進(jìn)行了體外細(xì)胞抗腫瘤活性篩選實驗并探討其在抗腫瘤方面的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細(xì)胞株

儀器：HFC386STD-V12型超低溫冰箱（德國Hereaus公司），CO2孵育箱（德國Heraeus公司），YJ-1450型紫外超凈工作臺SW-CJ-IF（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），METTLER AE240型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），Biorad MODEL 680型BH-2型酶標(biāo)儀（美國 Bio-rad公司），1.0R型低溫高速離心機(jī)（德國Heraeus公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

試劑：RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司），新生牛血清（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），PBS袋裝預(yù)混合試劑（康為生物有限公司），二甲基四氮唑鹽（MTT）（Sigma公司），生理鹽水（昆明南疆制藥有限公司），無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠），三七脂溶性成分（云南省云科藥業(yè)有限公司，批號：20181018），三七水溶性成分（云南省云科藥業(yè)有限，批號：20181018），含三七素的提取物（云南省云科藥業(yè)有限公司，批號：20181018）。

細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株HepG2，人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375，人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116，人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，人肺癌細(xì)胞A549。保存于昆明醫(yī)科大學(xué)云南省天然藥物藥理重點實驗室。

1.2 藥物及試劑配制

1.2.1 藥物的配制 三七水溶性提取物：稱取三七水溶性提取物，用含10%牛血清的1640培養(yǎng)基溶解，取得濃度為10 mg/ml的藥液并用0.22 μm無菌濾頭過濾備用。

三七脂溶性提取物：稱取三七脂溶性提取物，用含10%牛血清的1640培養(yǎng)基溶解，取得濃度為10 mg/ml的藥液并用0.22 μm無菌濾頭過濾備用。

含三七素提取物：稱取含三七素的提取物，用含10%牛血清的1640培養(yǎng)基溶解，取得濃度為10 mg/ml的藥液并用0.22 μm無菌濾頭過濾備用。

1.2.2 試劑的配制 （1）MTT 溶液配制：5 mg MTT粉末， 加 入 1 ml PBS 配成 5 mg/ml濃 度 的溶液。（2）三聯(lián)液配制：配置含 0.012 mol/L HCl、10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、5%異丁醇的三聯(lián)液，即加 1.2 ml 36%～37% 濃鹽酸、100 g SDS、50 ml異丁醇，用1 L三蒸水溶解后備用。

1.3 改良MTT法

參照文獻(xiàn)[6-8]采用改良MTT（MTS）法對5種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外抑瘤藥理活性篩選。實驗采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。取對數(shù)生長期的各腫瘤細(xì)胞，計數(shù)后調(diào)細(xì)胞濃度為6×104個/ml，接種于96孔板。給藥組、空白組各設(shè)10個平行孔，每孔 各 80 μl。 將 母 液 按 1、2、4、10、100、1 000倍稀釋為 10 mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml的藥液。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后給藥組每10孔加入一種濃度藥液20 μl，使作用于細(xì)胞的終濃度為 2 mg/ml、1 mg/ml、500 μg/ml、200 μg/ml、20 μg/ml、2 μg/ml，空白組加入每孔20 μl含10%牛血清的1640培養(yǎng)基。加藥后在37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/ml）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，每孔加入100 μl三聯(lián)液充分溶解，8～12 h后，用酶標(biāo)儀在雙波長（570、630 nm）下測定各孔的OD值并用SPSS 17.0統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三七提取物對人肝癌細(xì)胞HepG2實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人肝癌細(xì)胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人肝癌細(xì)胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物濃度為 2 mg/ml的給藥組對人肝癌細(xì)胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細(xì)胞生長，見表1。

表1 不同濃度三七提取物對人肝癌細(xì)胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表1 不同濃度三七提取物對人肝癌細(xì)胞株HepG2的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.004 0±0.002 1* 0.266 2±0.027 8 0.227 8±0.015 2 1 mg/ml 0.265 7±0.055 1 0.287 2±0.010 6 0.231 0±0.010 1 500 μg/ml 0.264 7±0.021 9 0.283 4±0.008 5 0.248 5±0.016 1 200 μg/ml 0.280 8±0.009 5 0.257 6±0.006 4 0.229 3±0.019 2 20 μg/ml 0.259 8±0.006 6 0.261 5±0.013 3 0.234 4±0.010 2 2 μg/ml 0.246 4±0.012 0 0.263 9±0.063 4 0.233 5±0.017 5空白組（n=10） 0.262 2±0.011 8 0.268 9±0.015 1 0.245 4±0.006 8

2.2 三七提取物對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116在不同的濃度具有不同的藥理作用：濃度為 2 mg/ml、1 mg/ml的給藥組 OD 值均低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細(xì)胞生長，2 mg/ml抑制作用最明顯，其次是 1 mg/ml；濃度為500 μg/ml、200 μg/ml的給藥組OD值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可促進(jìn)細(xì)胞生長，500 μg/ml促進(jìn)作用最明顯，其次是200 μg/ml，見表2。

表2 三七提取物對人結(jié)腸癌HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表2 三七提取物對人結(jié)腸癌HCT-116的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.001 1±0.000 3* 0.304 9±0.021 6 0.266 2±0.027 8 1 mg/ml 0.061 7±0.014 8* 0.318 4±0.013 4 0.287 3±0.010 6 500 μg/ml 0.313 2±0.011 5* 0.317 5±0.011 7 0.283 4±0.008 7 200 μg/ml 0.285 7±0.024 6* 0.301 0±0.005 7 0.257 6±0.006 6 20 μg/ml 0.255 0±0.015 0 0.301 1±0.005 8 0.261 5±0.013 3 2 μg/ml 0.253 0±0.014 2 0.299 6±0.013 9 0.263 9±0.006 4空白組（n=10） 0.266 2±0.007 5 0.307 0±0.005 3 0.268 9±0.151 1

2.3 三七提取物對人胃癌細(xì)胞SGC-7901實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901在不同的濃度具有不同的藥理作用：濃度為2 mg/ml、1 mg/ml的給藥組OD值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細(xì)胞生長，2 mg/ml抑制作用最明顯，其次是 1 mg/ml；而在為 500 μg/ml、200 μg/ml的給藥組OD值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能促進(jìn)細(xì)胞生長，500 μg/ml促進(jìn)作用最明顯，其次是200 μg/ml，見表3。

表3 三七提取物對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表3 三七提取物對人胃癌細(xì)胞株SGC-7901的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.006 5±0.002 2* 0.251 3±0.012 6 0.228 2±0.035 9 1 mg/ml 0.106 0±0.042 8* 0.250 1±0.016 7 0.210 2±0.022 7 500 μg/ml 0.288 7±0.019 7* 0.250 6±0.010 0 0.230 7±0.007 1 200 μg/ml 0.252 7±0.013 1* 0.262 8±0.013 7 0.252 7±0.012 7 20 μg/ml 0.246 1±0.007 1 0.235 7±0.007 7 0.217 2±0.005 5 2 μg/ml 0.243 8±0.013 1 0.224 5±0.006 5 0.225 8±0.009 0空白組（n=10） 0.239 2±0.010 5 0.228 7±0.009 6 0.239 2±0.007 4

2.4 三七提取物對人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375具有抑制生長的藥理作用：濃度為2 mg/ml、1 mg/ml的給藥組OD值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），能抑制細(xì)胞生長，見表4。

表4 三七提取物對人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表4 三七提取物對人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.007 8±0.002 6* 0.300 7±0.004 3 0.283 0±0.008 7 1 mg/ml 0.129 5±0.019 3* 0.291 1±0.013 8 0.277 4±0.005 8 500 μg/ml 0.256 2±0.008 5 0.291 2±0.007 8 0.273 4±0.011 9 200 μg/ml 0.273 9±0.010 3 0.289 1±0.013 2 0.274 2±0.010 1 20 μg/ml 0.261 0±0.005 6 0.283 8±0.009 1 0.274 0±0.006 6 2 μg/ml 0.260 2±0.005 8 0.286 3±0.004 5 0.277 1±0.007 5空白組（n=10） 0.265 1±0.003 7 0.295 2±0.011 0 0.277 7±0.003 5

2.5 三七提取物人肺癌細(xì)胞A549實驗

（1）含三七素的三七提取物各給藥組對人肺癌細(xì)胞株A549藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）三七水溶性提取物各給藥組對人肺癌細(xì)胞株A549藥理學(xué)活性O(shè)D值與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）三七脂溶性提取物對人肺癌細(xì)胞株A549在不同的濃度具有不同的藥理作用：濃度為2 mg/ml的給藥組OD值低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可抑制細(xì)胞生長；而濃度為 1 mg/ml、500 μg/ml、200 μg/ml的給藥組OD值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可促進(jìn)細(xì)胞生長，1 mg/ml促進(jìn)作用最明顯，見表5。

表5 三七提取物對人肺癌細(xì)胞株A549的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

表5 三七提取物對人肺癌細(xì)胞株A549的藥理學(xué)活性O(shè)D值比較（±s）

*與空白組比較，P＜0.05。

組別 藥物濃度 三七脂溶性 三七水溶性 三七素給藥組（n=10） 2 mg/ml 0.050 4±0.012 2* 0.291 7±0.008 5 0.287 3±0.010 6 1 mg/ml 0.458 3±0.033 8* 0.299 8±0.015 8 0.283 1±0.005 6 500 μg/ml 0.381 6±0.031 9* 0.293 6±0.004 5 0.272 7±0.016 5 200 μg/ml 0.310 2±0.012 9* 0.287 6±0.008 5 0.274 2±0.009 8 20 μg/ml 0.287 4±0.010 7 0.288 0±0.004 7 0.270 3±0.004 4 2 μg/ml 0.282 0±0.007 5 0.295 2±0.008 5 0.269 0±0.005 2空白組（n=10） 0.283 1±0.008 9 0.294 3±0.007 3 0.278 0±0.010 6

3 討論

三七資源的綜合利用，能最大限度地提高三七資源的利用率，變廢為寶，更能增加企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。國內(nèi)學(xué)者在篩選植物抗腫瘤活性成分時發(fā)現(xiàn)，三七醇提物的石油醚部位對結(jié)腸癌細(xì)胞株及部分革蘭陽性菌有強(qiáng)烈的抑制活性[9]，對線蟲具有降脂作用[10]，對潰瘍性結(jié)腸炎具有改善作用[9]，通過對分離得到的化合物光譜分析分別鑒定為人參炔醇（panax ynol，Ⅰ）、人參環(huán)氧炔醇（panax ydol，Ⅱ）和B-谷甾醇（B-sitosterol，Ⅲ）。而關(guān)于三七素的研究主要集中在止血作用和抗脂解與促進(jìn)脂肪合成作用[11-13]。近年來三七多糖的研究也日益受到人們的關(guān)注，有研究表明，三七多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用[14]，國內(nèi)外近期研究也主要集中于三七多糖對機(jī)體免疫功能方面上的影響。陳新霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)三七多糖能改善小鼠免疫功能調(diào)節(jié)；張朝貴等[16]發(fā)現(xiàn)三七多糖能影響創(chuàng)傷大鼠CD4+/CD8+和白細(xì)胞介素-2水平。

對本實驗結(jié)果統(tǒng)計分析可發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)律，對于貼壁細(xì)胞（HepG2、A375、A549、SGC-7901、HCT-116），三七脂溶性成分在高濃度時具有明顯的抑制細(xì)胞增殖作用，這與脂溶性成分對結(jié)腸癌細(xì)胞株及部分革蘭陽性菌有強(qiáng)烈的抑制活性的報道相一致；三七脂溶性成分在中濃度一般具有明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。而富含三七素的三七提取物與水溶性的三七提取物對腫瘤細(xì)胞活性的影響不大，這對三七資源的進(jìn)一步研究和利用將具有重要的指導(dǎo)意義。