黃英， 彭晴， 王荃， 徐小輕， 張宇微， 馬藍(lán)， 石波， 喬宇*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；2.全國畜牧總站，北京 100125）

芽孢桿菌（Bacillus）屬革蘭氏陽性菌，可形成芽孢[1]，能分泌多種酶類，如蛋白酶、纖維素酶、果膠酶；還能合成多種生物活性物質(zhì)，如有機(jī)酸、維生素、氨基酸等[2]。益生芽孢桿菌能夠提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，維持腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病力，在功能食品、畜禽養(yǎng)殖、植物病害防治、工業(yè)酶制劑生產(chǎn)等方面取得了很好的應(yīng)用效果[3]。

蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生溶血素、磷脂酶和其他腸毒素[4-5]，引起人類和動物的中毒反應(yīng)，主要表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉。嘔吐毒素（cereulide）[6]是由非核糖體肽合酶ces基因簇編碼的熱穩(wěn)定性環(huán)狀多肽。腸毒素主要包括溶血素Hbl、非溶血性腸毒素Nhe、腸毒素FM（entFM）、細(xì)胞毒素K（CytK）和腸毒素 T（BceT）[7]。Hbl由 L1、L2和 B 共 3 個亞基構(gòu)成，分別由hblA、hblB和hblD基因編碼[8]。當(dāng)3個亞基都存在時毒性最強(qiáng)，對宿主產(chǎn)生溶血、細(xì)胞毒性和皮膚壞死毒性。Nhe由nheA、nheB和nheC 3個亞基構(gòu)成[9]，而entFM、CytK和BceT是單亞基蛋白[10]。近年來，具有益生功效的芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）等陸續(xù)被報(bào)道也能分泌與蠟樣芽孢桿菌相同的毒素[5]。Parvathi等[11]從土壤中分離出一株短小芽孢桿菌，攜帶了與蠟樣芽孢桿菌相同的嘔吐毒素合成基因，且能夠分泌嘔吐毒素。Rowan等[12]用蠟樣芽孢桿菌溶血素（Hbl的L2亞基）進(jìn)行反向被動乳膠凝集試驗(yàn)，結(jié)果表明，凝結(jié)芽胞桿菌NB11和多粘芽孢桿菌NB6能分泌Hbl毒素。除此之外，一些枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌[13-16]和短小芽孢桿菌[13,17-20]還能產(chǎn)生多種類型的脂肽類毒素，如表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和芬芥素（fengycin）等，部分脂肽類毒素具有溶血性和細(xì)胞毒性。

安全無毒是益生類芽孢桿菌必需具備的首要條件，在使用前必需對其毒性和安全性進(jìn)行評價[13,21]。采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和生化法測定毒素存在耗時長、靈敏度低等缺點(diǎn)[22]；而利用PCR和全基因組測序分析檢測毒素基因的方法缺乏必要的質(zhì)量控制和結(jié)果驗(yàn)證，存在一定的局限性[22-23]。細(xì)胞毒性測定法通過體外檢測毒素對相關(guān)哺乳動物生長代謝產(chǎn)生的影響，解決了上述方法的缺陷[22,24]。Beattie等[25]用體外培養(yǎng)的CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞），通過細(xì)胞染色和代謝活性的變化評價芽孢桿菌的細(xì)胞毒性，該方法耗時較長，需要24～72 h才能完成。Gray等[22]用Ped-2E9細(xì)胞（小鼠雜交瘤淋巴細(xì)胞）檢測芽孢桿菌的細(xì)胞毒性，但Ped-2E9細(xì)胞只能檢測出蠟樣芽孢桿菌的細(xì)胞毒性，對枯草芽胞桿菌不敏感。Lee等[26]利用HEp-2細(xì)胞（人喉表皮樣癌細(xì)胞）的空泡化測定蠟樣芽孢桿菌的嘔吐毒素。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）的官方文件中使用非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）評估飼用芽孢桿菌的產(chǎn)毒潛力[28]。研究報(bào)道，流式細(xì)胞儀法、同位素釋放法、臺盼藍(lán)染色法[29]、MTT比色法[30]和CCK-8[31]法均能測定細(xì)胞毒性強(qiáng)弱。其中，MTT比色法和CCK-8法以其快速簡單、不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素且適合大批量檢測等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。綜上所述，在芽孢桿菌毒性檢測中，不同株系的細(xì)胞和細(xì)胞活性測定方法在操作性、敏感性、適用性和準(zhǔn)確性等方面存在差異，制約了細(xì)胞毒性檢測方法的應(yīng)用。因此，本研究擬通過篩選試驗(yàn)用細(xì)胞系，并進(jìn)一步對細(xì)胞毒性的檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，建立一種簡單、快速、可靠和廣泛適用的芽孢桿菌細(xì)胞毒性檢測方法，為芽孢桿菌的安全使用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芽孢桿菌：蠟樣芽孢桿菌CICC 21261（標(biāo)準(zhǔn)毒株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心）及81株芽孢桿菌（實(shí)驗(yàn)室分離保存），包括3株蠟樣芽胞桿菌、44株枯草芽孢桿菌、15株解淀粉芽孢桿菌、9株地衣芽孢桿菌、6株貝萊斯芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌、1株人參芽孢桿菌、1株副芽孢桿菌。

細(xì)胞：非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，人喉表皮樣癌細(xì)胞（HEp-2細(xì)胞）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)條件

芽胞桿菌：取甘油保存的芽孢桿菌于LB固體平板劃線，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)16～18 h。將活化的菌液以體積比為2%的接種量轉(zhuǎn)接于腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI）中，32℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng) 6～18 h[32]。

細(xì)胞：細(xì)胞接種于含DMEM完全培養(yǎng)基（含8%胎牛血清，1%雙抗）的T-25瓶中，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，以胰酶消化傳代。利用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞液密度為5×104～1×105個·mL?1[33]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞毒性檢測方法的建立

1.3.1 細(xì)胞活性檢測方法的確定 ①M(fèi)TT比色法。取Vero細(xì)胞液100μL接種于96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換為100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實(shí)驗(yàn)組每孔加入50μL BHI培養(yǎng)基，對照組每孔加入50μL DMEM培養(yǎng)基（含1%雙抗），以不接細(xì)胞的孔作為空白對照，每組做8個重復(fù)。于37℃、5% CO2下繼續(xù)孵育2 h后，移去孔板中的液體，加入100μL質(zhì)量濃度為1 mg·mL?1的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，北京博奧拓達(dá)科技有限公司]，37℃反應(yīng)4 h后移去MTT溶液，每孔加入150μL的DMSO[34]，充分振蕩混勻后，在490 nm下測定光吸收值，并計(jì)算BHI培養(yǎng)基對細(xì)胞的抑制率[35]。

②CCK-8法。取Vero細(xì)胞液100μL接種于96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實(shí)驗(yàn)組每孔加入50μL BHI培養(yǎng)基，對照組每孔加入50μL DMEM培養(yǎng)基（含1%雙抗），以不接細(xì)胞的孔作為空白對照，每組做8個重復(fù)。于37℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育2 h后，移去孔板中的液體，加入100μL DMEM培養(yǎng)基以及10μL CCK溶液（Cell Counting Kit-8,biosharp，北京蘭杰柯科技有限公司），37℃反應(yīng)2 h，在450 nm下測定光吸收值，并計(jì)算芽孢桿菌培養(yǎng)基對細(xì)胞的抑制率。

1.3.2 細(xì)胞的選擇 培養(yǎng)Vero細(xì)胞和HEp-2細(xì)胞，分別取細(xì)胞液100μL接種于96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實(shí)驗(yàn)組每孔加入50μL BHI培養(yǎng)基，對照組每孔加入50μL DMEM培養(yǎng)基（含1%雙抗），以不接細(xì)胞的孔作為空白對照，每組做8個重復(fù)。37℃、5% CO2下繼續(xù)孵育2 h后，采用MTT比色法測定BHI培養(yǎng)基對兩種細(xì)胞的抑制率。

1.4 細(xì)胞毒性檢測條件的優(yōu)化

1.4.1 芽胞桿菌粗提物的制備 分別濃縮或稀釋蠟樣芽孢桿菌CICC 21261、蠟樣芽孢桿菌1-20、解淀 粉 芽 孢 桿 菌 1-16 培 養(yǎng) 液 至 108CFU·mL?1，10 000 r·min?1離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，制成芽孢桿菌粗提物，4℃保存不超過48 h。

1.4.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化 將100μL Vero細(xì)胞液接入96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實(shí)驗(yàn)組分別加入粗提物25、50、75和100 μL，對照組加入與粗提物等量的BHI培養(yǎng)基，以不接細(xì)胞的孔作為空白對照，每組做8個重復(fù)，37℃、5% CO2下孵育2 h后，測定粗提物的細(xì)胞抑制率，比較不同體積的粗提物對細(xì)胞抑制率的影響。

1.4.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化 將100μL Vero細(xì)胞液接入96孔板，于37℃、5% CO2下孵育24 h后更換100μL DMEM完全培養(yǎng)基，同時實(shí)驗(yàn)組加入粗提物50μL，對照組加入與粗提物等量的BHI培養(yǎng)基，以不接細(xì)胞的孔作為空白對照，各組于37℃、5% CO2下分別孵育1、2、4、6和24 h后，計(jì)算并比較不同孵育時間下的粗提物的細(xì)胞抑制率。

1.5 細(xì)胞抑制率的計(jì)算及結(jié)果判定

測定試驗(yàn)組光吸收值、對照組光吸收值和空白組光吸收值，按照下式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

當(dāng)芽孢桿菌的培養(yǎng)液對細(xì)胞抑制率＜20%時，判定該菌株無細(xì)胞毒性；當(dāng)芽孢桿菌的培養(yǎng)液對細(xì)胞抑制率≥20%時，判定該株芽孢桿菌具有細(xì)胞毒性[28,35]。

1.6 芽孢桿菌分離菌株毒性檢測

利用建立的細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法對實(shí)驗(yàn)室分離的81株芽孢桿菌進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。

1.7 芽胞桿菌分泌毒素的測定

1.7.1 毒素編碼基因檢測 提取芽孢桿菌基因組DNA，參考?zdemir等[36]的方法PCR擴(kuò)增entFM、ces、cytk、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB和nheC9種毒素編碼基因，引物序列[36-39]詳見表1。以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 毒素編碼基因的PCR引物Table1 Primer of virulence genes for PCR

1.7.2 芽孢桿菌培養(yǎng)上清液的耐熱性測試 芽胞桿菌產(chǎn)生的嘔吐毒素和脂肽類毒素具有較高的熱穩(wěn)定性，而腸毒素Hbl、Nhe和Cytk等具有熱不穩(wěn)定性。為了分析芽胞桿菌分泌毒素的類型，芽孢桿菌培養(yǎng)物上清液在58℃下處理40 min[22]后，按建立的試驗(yàn)方法對其進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。

1.7.3 溶血性測定 挑取LB平板上活化的芽孢桿菌單菌落劃線于含8%綿羊血（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）的哥倫比亞血瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）平板上，于37℃培養(yǎng)14～18 h，觀察菌落周圍的形態(tài)，判斷溶血性的類型，每株菌3個重復(fù)。若菌落周圍形成了界限分明、完全透明的溶血環(huán)，具有溶血性，則溶血類型為β-溶血；若菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，不具有溶血性，則為γ-溶血[40]。

1.7.4 腸毒素的特異性抗體檢測 利用逆向被動乳膠凝集反應(yīng)（CRET-RPLA，日本生研株式會社）檢測芽孢桿菌腸毒素，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 用于芽胞桿菌代謝物細(xì)胞毒性檢測方法的建立

2.1.1 不同細(xì)胞活性檢測方法對Vero細(xì)胞抑制率的影響 對比MTT比色法和CCK-8法測定BHI培養(yǎng)基對Vero細(xì)胞抑制率，結(jié)果（圖1）表明，MTT比色法測定BHI培養(yǎng)基的細(xì)胞抑制率為2.46%，按照芽孢桿菌細(xì)胞毒性的判定標(biāo)準(zhǔn)，該BHI培養(yǎng)基的細(xì)胞抑制率較低，不具有細(xì)胞毒性；而使用CCK-8法測定Vero細(xì)胞抑制率時，當(dāng)培養(yǎng)基與細(xì)胞反應(yīng)2 h后，實(shí)驗(yàn)組的光吸收值高于對照組，細(xì)胞活性沒有被抑制反而被促進(jìn)，增長率達(dá)92%。根據(jù)CCK-8法的原理推斷，可能BHI培養(yǎng)基中某些組分具有還原特性，使CCK-8法的顯色反應(yīng)被干擾，導(dǎo)致本底誤差過大而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有參考意義。因此，CCK-8法測定細(xì)胞活性不適用于本試驗(yàn)。MTT比色法培養(yǎng)基本底水平低，結(jié)果較穩(wěn)定，適合本試驗(yàn)中細(xì)胞活性的測定。

圖1 BHI培養(yǎng)基的細(xì)胞抑制率Fig.1 Inhibition rates of Bacillus culture medium on Vero cells

2.1.2 BHI培養(yǎng)基對不同細(xì)胞活性的影響 Vero細(xì)胞和HEp-2細(xì)胞分別與BHI培養(yǎng)基反應(yīng)后測定細(xì)胞抑制率，結(jié)果（圖2）表明，當(dāng)BHI培養(yǎng)基與Vero細(xì)胞反應(yīng)2 h后，細(xì)胞抑制率為2.46%；而BHI培養(yǎng)基與HEp-2細(xì)胞反應(yīng)2 h后，細(xì)胞抑制率為29.94%。與Vero細(xì)胞相比，本試驗(yàn)選用的BHI培養(yǎng)基對HEp-2細(xì)胞的抑制率達(dá)到20%以上，如此高的本底水平會影響芽孢桿菌培養(yǎng)物細(xì)胞毒性的判定，因此，選用Vero細(xì)胞作為試驗(yàn)細(xì)胞。

圖2 BHI培養(yǎng)基對Vero細(xì)胞和HEp-2細(xì)胞的抑制率Fig.2 Inhibition rates of Bacillus culture medium on Vero cell and HEp-2 cell

2.2 用于芽胞桿菌代謝物細(xì)胞毒性檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 不同反應(yīng)體系對細(xì)胞抑制率的影響 不同體積粗提物對細(xì)胞抑制率的影響如表2所示，蠟樣芽孢桿菌CICC 21261具有強(qiáng)毒性，在加入粗提物體積為50μL時，細(xì)胞抑制率最高；蠟樣芽孢桿菌1-20和解淀粉芽孢桿菌1-16在加入粗提物體積為50μL時，細(xì)胞抑制率最高，分別為94.26%和52.64%。因此，將與細(xì)胞反應(yīng)的芽孢桿菌粗提物體積確定為50μL。

表2 不同粗提物體積的細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition rates of cells by different volumes of Bacillus crude extract （%）

2.2.2 不同反應(yīng)時間對細(xì)胞抑制率的影響 芽孢桿菌粗提物和細(xì)胞反應(yīng)不同時間對細(xì)胞抑制率的影響結(jié)果如圖3所示，蠟樣芽孢桿菌CICC 21261粗提物與細(xì)胞反應(yīng)1 h，細(xì)胞抑制率達(dá)94.26%，細(xì)胞抑制率曲線到達(dá)平臺期；蠟樣芽孢桿菌1-20粗提物與細(xì)胞反應(yīng)2 h，細(xì)胞抑制率達(dá)94.26%，細(xì)胞抑制率曲線到達(dá)平臺期；解淀粉芽孢桿菌1-16的細(xì)胞抑制率雖然隨粗提物和細(xì)胞反應(yīng)時間的延長呈上升趨勢，但反應(yīng)1～4 h的細(xì)胞抑制率差異不顯著。因此，綜合3株菌的試驗(yàn)結(jié)果，將待測芽孢桿菌粗提物與Vero細(xì)胞反應(yīng)時間確定為2 h。

圖3 不同反應(yīng)時間下的細(xì)胞抑制率Fig.3 Inhibition rate of cells at different co-incubation times

2.3 不同來源的芽胞桿菌細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

應(yīng)用建立的細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法對81株芽孢桿菌的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測，結(jié)果（表3）表明，65株芽孢桿菌的Vero細(xì)胞抑制率小于20%，無細(xì)胞毒性作用，包括41株枯草芽孢桿菌、9株地衣芽孢桿菌、9株解淀粉芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌、1株人參芽孢桿菌、1株副芽孢桿菌和2株貝萊斯芽孢桿菌；16株芽孢桿菌的Vero細(xì)胞抑制率大于20%，顯示出細(xì)胞毒性作用，包括3株蠟樣芽孢桿菌、3株枯草芽孢桿菌、6株解淀粉芽孢桿菌和4株貝萊斯芽孢桿菌。

表3 芽孢桿菌細(xì)胞毒性檢測及毒素分析Table 3 Cytotoxicity tests and toxin analysis of Bacillus

2.4 產(chǎn)毒芽胞桿菌的毒素分析

2.4.1 毒素編碼基因檢測結(jié)果 對16株具有細(xì)胞毒性的芽孢桿菌攜帶的毒素編碼基因進(jìn)行檢測，結(jié)果（表3）表明，蠟樣芽胞桿菌1-19攜帶entFM、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC7個毒素編碼基因；蠟樣芽孢桿菌1-13攜帶entFM、Cytk、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC8個毒素編碼基因；蠟樣芽胞桿菌1-20攜帶entFM、Cytk、hblA、hblC、hblD、nheB、nheC7個毒素編碼基因；解淀粉芽孢桿菌3-29、3-33、1-18、2-15、1-16和枯草芽孢桿菌2-17、2-13、2-14及貝萊斯芽孢桿菌3-31僅攜帶hblD毒素編碼基因；貝萊斯芽孢桿菌3-34、3-32、2-16及解淀粉芽孢桿菌1-17未檢測到上述毒素編碼基因。

2.4.2 芽孢桿菌分泌毒素的耐熱性 對具有細(xì)胞毒性的16株芽孢桿菌培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行了加熱失活處理，然后檢測細(xì)胞毒性，結(jié)果（表3）表明，枯草芽孢桿菌2-14、解淀粉芽孢桿菌1-16和1-18及貝萊斯芽孢桿菌2-16粗提物經(jīng)58℃處理40 min后，細(xì)胞毒性與未經(jīng)熱處理時的細(xì)胞毒性差異不顯著；另12株菌（蠟樣芽孢桿菌1-13、1-19、1-20，枯草芽孢桿菌2-13、2-17，解淀粉芽孢桿2-15、3-29、1-17、3-33，貝萊斯芽孢桿菌 3-31、3-32、3-34）培養(yǎng)物的上清液58℃處理40 min后，細(xì)胞毒性與未熱處理菌株粗提物的細(xì)胞毒性差異顯著，其中，3株蠟樣芽孢桿菌粗提物經(jīng)熱處理后，細(xì)胞抑制率顯著下降，推測這3株蠟樣芽孢桿菌分泌的有毒代謝產(chǎn)物為不耐熱的腸毒素；另9株芽胞桿菌粗提物經(jīng)熱處理后細(xì)胞毒性降幅較小，加熱處理后細(xì)胞毒性為28.19%～57.23%。

2.4.3 溶血性結(jié)果 對16株具有細(xì)胞毒性的芽孢桿菌進(jìn)行溶血性試驗(yàn)，結(jié)果（表3）表明，蠟樣芽孢桿菌1-13、1-19和1-20的菌落周圍形成了界限分明且完全透明的溶血環(huán)，具有溶血性，即溶血類型為β-溶血；其他13株芽孢桿菌菌落周圍的培養(yǎng)基無變化，不具有溶血性，即溶血類型為γ-溶血。

2.4.4 腸毒素的特異性抗體檢測結(jié)果 對16株具有細(xì)胞毒性的芽孢桿菌是否產(chǎn)生腸毒素進(jìn)行檢測，結(jié)果（表3）表明，蠟樣芽孢桿菌1-13、1-19和1-20（菌體濃度為108CFU·mL-1）的檢測結(jié)果呈陽性，腸毒素含量分別為16、128和 512 ng·mL-1；其余菌株檢測結(jié)果均呈陰性。

3 討論

利用細(xì)胞毒性試驗(yàn)評價細(xì)菌毒性是以生物學(xué)性狀基本相同的細(xì)胞系（或株）為對象，避免了動物的使用及個體差異，且操作簡單、檢測靈敏度高，可在細(xì)胞存活的狀態(tài)下觀察細(xì)胞毒性物質(zhì)，研究其對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響，分析作用機(jī)理和量效關(guān)系[41-42]。目前，已經(jīng)報(bào)道的可用作芽孢桿菌毒性評價的細(xì)胞有CHO細(xì)胞、Ped-2E9細(xì)胞和Vero細(xì)胞等，但是不同哺乳動物細(xì)胞對芽孢桿菌毒素的敏感性不同。作為受試細(xì)胞，CHO細(xì)胞不僅對產(chǎn)嘔吐毒素和腸毒素的蠟樣芽孢桿菌敏感，對枯草芽胞桿菌也同樣敏感[21,25]；Ped-2E9細(xì)胞對枯草芽胞桿菌的毒素不敏感[22]；Vero細(xì)胞對多種病毒和毒素敏感[28,43]。本研究表明，蠟樣芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌屬部分菌株對Vero細(xì)胞具有毒性，說明Vero細(xì)胞適宜作為受試細(xì)胞用于芽孢桿菌的毒性檢測，并在此基礎(chǔ)上建立了一種用于快速檢測芽孢桿菌代謝物細(xì)胞毒性的方法。通過建立的細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法對實(shí)驗(yàn)室分離的81株芽孢桿菌的代謝物細(xì)胞毒性進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16株芽孢桿菌對Vero細(xì)胞的抑制率大于20%，顯示出細(xì)胞毒性作用[28,35]；其中，3株蠟樣芽孢桿菌的細(xì)胞抑制率達(dá)90%以上，其余13株枯草芽孢桿菌類菌株的細(xì)胞抑制率為33.29%～65.38%。

芽孢桿菌中是否存在毒素編碼基因并表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的毒素是芽孢桿菌安全性評價的重要內(nèi)容。?zdemir等[36]用PCR檢測法對從土耳其市場上銷售的魚肉和牛肉中分離的52株芽孢桿菌進(jìn)行檢測，11株蠟樣芽孢桿菌和1株枯草芽孢桿菌攜帶2個或3個毒素編碼基因；12株芽孢桿菌攜帶hblC和hblD基因；8株攜帶hblA基因；7株攜帶nheABC基因；1株攜帶nheB和nheC基因。朱奎等[44]發(fā)現(xiàn)，從人、動物、植物和環(huán)境中益生菌產(chǎn)品中分離的43株蠟樣芽胞桿菌和62株枯草芽胞桿菌中約32%（37/114）的分離株攜帶腸毒素（Nhe和Hbl）編碼基因。雖然通過PCR檢測法能夠檢測出芽孢桿菌攜帶的毒素編碼基因，但基因表達(dá)受轉(zhuǎn)錄、翻譯等多層次的調(diào)控，僅檢出毒素基因并不能判定菌株是否具有毒性。因此，需結(jié)合常用的安全性檢測方法（如芽孢桿菌毒素檢測試劑盒和溶血性試驗(yàn)等）[21]確認(rèn)菌株產(chǎn)生的毒素種類。

本研究對細(xì)胞毒性試驗(yàn)與PCR檢測、溶血性試驗(yàn)以及抗體免疫反應(yīng)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，3株蠟樣芽孢桿菌攜帶了腸毒素entFM基因及Nhe、Hbl的所有編碼基因，并檢測出較高的腸毒素含量且具有溶血性；3種檢測方法得出的試驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞毒性試驗(yàn)的靈敏度和準(zhǔn)確性一致。對于13株具有細(xì)胞毒性的枯草芽孢桿菌類菌株，只有部分菌株檢測出溶血性腸毒素Hbl的一個亞基，且試劑盒與溶血性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，因此，無法判定其安全性。但細(xì)胞毒性試驗(yàn)及熱處理試驗(yàn)結(jié)果表明，13株枯草芽孢桿菌類菌株產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，且這些代謝產(chǎn)物可能具有較好的耐熱性。研究表明，枯草芽孢桿菌類菌株可分泌熱穩(wěn)定性的脂肽類毒素[13]，該類物質(zhì)能作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞膜的穩(wěn)定性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，同時也會對哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低或死亡。因此，通過本研究建立的細(xì)胞毒性試驗(yàn)?zāi)芨`敏地反映枯草芽孢桿菌的毒性，而針對毒素編碼基因的PCR法等更適用于蠟樣芽胞桿菌。綜上所述，與傳統(tǒng)的毒素編碼基因PCR法及抗體免疫反應(yīng)等芽孢桿菌安全性評價方法相比，本研究建立的細(xì)胞毒性試驗(yàn)?zāi)芨鼫?zhǔn)確、更靈敏地體現(xiàn)芽孢桿菌的毒性，且周期短、操作簡單、測樣量大，可作為初步選育益生芽孢桿菌的安全評估方法。